Summary
本文提供了一种简单明了的方案，使用遗传密码扩展 （GCE） 位点特异性标记 沙门氏菌 分泌效应子，并使用直接随机光学重建显微镜 （dSTORM） 对 HeLa 细胞中分泌蛋白的亚细胞定位进行成像
Abstract
三型分泌系统（T3SS）使革兰氏阴性菌能够将一系列效应蛋白直接注射到真核宿主细胞的细胞质中。进入后，注射的效应蛋白协同调节真核信号通路并重新编程细胞功能，使细菌进入并存活。在感染背景下监测和定位这些分泌的效应蛋白为定义宿主-病原体相互作用的动态界面提供了足迹。然而，在不破坏宿主细胞结构/功能的情况下标记和成像宿主细胞中的细菌蛋白在技术上具有挑战性。
构建荧光融合蛋白并不能解决这个问题，因为融合蛋白会堵塞分泌装置，因此不会被分泌。为了克服这些障碍，我们最近采用了一种使用遗传密码扩展（GCE）对细菌分泌的效应子以及其他难以标记的蛋白质进行位点特异性荧光标记的方法。本文提供了一个完整的分步方案，使用GCE位点特异性标记 沙门氏菌 分泌效应子，然后使用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）对HeLa细胞中分泌蛋白的亚细胞定位进行成像
最近的研究结果表明，通过GCE 掺 入非规范氨基酸（ncAAs），然后用含四嗪的染料进行生物正交标记，是一种可行的技术，用于选择性标记和可视化细菌分泌蛋白以及随后在宿主中进行图像分析。本文的目的是提供一个简单明了的方案，可供有兴趣使用GCE进行超分辨率成像的研究人员使用，以研究细菌和病毒中的各种生物过程，以及宿主 - 病原体相互作用。
Introduction
长期以来，细菌感染一直被视为对人体健康的严重危害。病原体使用高度进化、极其强大和复杂的防御系统，以及各种细菌毒力因子（称为效应蛋白）来逃避宿主免疫反应并建立感染1，2.然而，由于缺乏在发病过程中直接跟踪宿主细胞中关键蛋白质成分和效应子的合适方法，这些系统背后的分子机制和单个效应蛋白的作用仍然在很大程度上是未知的。
一个典型的例子是鼠伤寒沙门氏菌，它会导致急性胃肠炎。沙门氏菌鼠伤寒使用三型分泌系统（T3SS）将各种效应蛋白直接注射到宿主细胞中。一旦沙门氏菌进入宿主细胞，它就会驻留在酸性膜结合的隔室中，称为含沙门氏菌的液泡（SCV）3，4。SCV 的酸性 pH 值激活沙门氏菌致病性岛 2 （SPI-2） 编码的 T3SS，并将 20 种或更多效应蛋白的凌空翻位穿过液泡膜进入宿主细胞质5，6，7，8。在宿主内部，这些复杂的效应蛋白混合物协调操纵宿主细胞信号通路，导致形成高度动态、复杂的管状膜结构，从 SCV 沿微管延伸，称为沙门氏菌诱导的细丝 （SIF），使沙门氏菌能够在宿主细胞内存活和复制9，10，11。
可视化、跟踪和监测细菌效应子定位以及检查它们在宿主细胞内的运输和相互作用的方法，为支撑细菌发病机制提供了重要的见解。宿主细胞内沙 门氏菌 分泌的T3SS效应蛋白的标记和定位已被证明是一项技术挑战12，13;尽管如此，基因编码荧光蛋白的发展已经改变了我们研究和可视化生命系统中蛋白质的能力。然而，荧光蛋白的大小（~25-30 kDa）15通常与目标蛋白的大小相当甚至更大（POI;例如，SsaP为13.65 kDa，SifA为37.4 kDa）。事实上，效应器的荧光蛋白标记通常会阻断标记效应子的分泌并堵塞T3SS14。
此外，荧光蛋白稳定性较差，在光漂白前发射的光子数量很少，限制了它们在超分辨率显微技术中的使用16，17，18，特别是在光活化定位显微镜（PALM），STORM和受激发射耗尽（STED）显微镜中。虽然有机荧光染料的光物理性质优于荧光蛋白，但诸如CLIP/SNAP19，20，Split-GFP 21，ReAsH / FlAsH22，23和HA-Tags 24，25等方法/技术需要额外的蛋白质或肽附属物，这些附件可能通过干扰翻译后修饰或运输来损害目标效应蛋白的结构功能一种最大限度地减少必要蛋白质修饰的替代方法涉及在通过GCE翻译期间将ncAA掺入POI中。ncAA要么是荧光的，要么可以通过点击化学12，13，26，27，28制成荧光。
使用GCE，具有微小的、功能性的生物正交基团（如叠氮化物、环丙烯或环辛炔基团）的ncAA几乎可以在靶蛋白的任何位置引入。在该策略中，在POI基因的指定位置将天然密码子与稀有密码子（例如琥珀色（TAG）终止密码子）交换。修饰的蛋白质随后与正交氨酰基-tRNA合成酶/tRNA对一起在细胞中表达。tRNA合成酶活性位点被设计为仅接收一个特定的ncAA，然后将其共价连接到识别琥珀色密码子的tRNA的3'末端。ncAA被简单地引入生长培养基中，但它必须被细胞吸收并到达细胞质，其中氨酰基-tRNA合成酶（aaRS）可以将其连接到正交tRNA;然后将其合并到指定位置的POI中（见图1）12。因此，GCE能够将大量的生物正交反应基团（如酮，叠氮化物，炔烃，环辛炔，转环辛烯，四嗪，去甲骨烯，α，β-不饱和酰胺和双环[6.1.0]-壬炔）掺入POI中，可能克服传统蛋白质标记方法的局限性12，26，27，28。
超分辨率成像技术的最新新兴趋势为在分子水平上研究生物结构开辟了新的途径。特别是，STORM是一种基于定位的单分子超分辨率技术，已成为可视化低至~20-30纳米的细胞结构的宝贵工具，并且能够一次研究一个分子的生物过程，从而发现细胞内分子的作用，这些作用在传统的集合平均研究中尚不为人知13.单分子和超分辨率技术需要带有明亮、光稳定的有机荧光团的小标签，以获得最佳分辨率。我们最近证明GCE可用于结合合适的探针进行超分辨率成像12。
细胞中蛋白质标记的两个最佳选择是双环[6.1.0]壬炔赖氨酸（BCN）和反式环辛烯赖氨酸（TCO;如图1所示），它们可以使用tRNA/合成酶对的变体（此处称为tRNA Pyl/PylRS AF）进行遗传编码，其中Pyl代表吡咯赖氨酸，AF代表合理设计的双突变体（Y306A，Y384F），源自天然编码吡咯赖氨酸12的甲烷肉瘤，29，30，31.通过应变促进的逆电子需求Diels-Alder环加成（SPIEDAC）反应，这些氨基酸与四嗪偶联物发生化学选择性反应（图1）12，30，31。这种环加成反应非常快，并且与活细胞相容;如果适当的荧光团与四嗪部分12，26，32官能化，它们也可能是荧光的。本文提出了一种优化的方案，用于使用GCE监测传递到宿主细胞中的细菌效应子的动力学，然后使用dSTORM监测HeLa细胞中分泌蛋白的亚细胞定位。结果表明，通过GCE掺入ncAA，然后与含荧光四嗪的染料进行点击反应，代表了一种选择性标记，分泌蛋白可视化以及随后在宿主中进行亚细胞定位的通用方法。然而，这里详述的所有组件和程序都可以调整或替换，以便GCE系统可以适应其他生物学问题。
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Protocol
1. 质粒构建
- 将表达POI的基因克隆到表达大肠杆菌BL21（DE3）中表达POI的表达质粒（例如pET28a-sseJ 10TAG）。此步骤有助于确定突变体是否具有功能。
- 为了可视化宿主细胞中分泌的沙门氏菌效应子，构建一个表达质粒（pWSK29-sseJ-HA），该质粒在其天然启动子的控制下表达靶POI SseJ，如先前的报告7，12，24中所述。使用定点诱变，将苯丙氨酸-10的密码子替换为SseJ（pWSK29-sseJ 10TAG-HA）中的琥珀色密码子（TAG），确保AAT-TAG-ACT基序33，34。
- 除上述质粒外，对于将反式环辛-2-烯-L-赖氨酸（TCO*A）遗传掺入POI中，请使用另一种表达质粒（pEVOL-PylRS-AF）31 ，其中包含在质粒pEVOL中编码的进化tRNA/合成酶对（tRNAPyl/PylRS AF ）基因。
注意：质粒和克隆方案的详细说明在上一份报告30，31中描述。 - 使用市售质粒制备试剂盒获得高质量的质粒DNA。对于纯化的DNA，最佳的260/280比例为~1.8。如有必要，使用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA纯度。
2. 细菌培养准备
- 获得双转化体以测试突变体在大肠杆菌中是否有效
- 将BL 21感受态细胞从-80°C取出并在冰上解冻约20-30分钟。
- 在 1.5 mL 微量离心管中将 1–5 μL 每个质粒（~50 ng 的 pEVOL-PylRS-AF 和 pET28a-sseJ 10TAG）与 200 μL 化学感受态 BL21 细胞混合。轻轻混合感受态细胞和质粒混合物;在冰上孵育30分钟。
- 将微量离心管在42°C水浴中热休克45秒。将试管放回冰上2分钟。
- 向微量离心管中加入 1 mL 温热的 LB 培养基，并将混合物快速转移到 15 mL 锥形管中。将细胞在37°C下在250rpm的振荡器中孵育1小时。将部分或全部转化细胞铺在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。将板在37°C孵育过夜。
注意：在该协议中，分别使用35μg/ mL氯霉素和50μg/ mL卡那霉素选择pEVOL-PylRS-AF和pET28a-sseJ 10TAG。在转换步骤中，使用负对照和正对照评估成功的转换。
- 将突变体转移到沙门 氏菌 中，以可视化宿主细胞中沙 门氏菌 分泌的效应子：
- 在冷冻微量离心管中，将 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ 10TAG 各加入 2–3 μL 的 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ 10TAG 到 40–60 μL 的电感受态鼠伤寒沙门氏菌菌株 14028 中。用移液管轻轻混合混合物。
- 将电穿孔混合物转移到冷却的（0.2厘米电极间隙）比色皿中;将电穿孔设置设置为 2.5 kV、200 Ω、25 μF。将比色皿放入电穿孔室内。确保腔室电极与微型脉冲发生器比色皿牢固接触。
- 按住 脉冲 按钮，直到它发出哔哔声。
- 立即将 1 mL 温热的 LB 培养基加入比色皿中。将全部内容物转移到 15 mL 锥形管中。将细胞在37°C下以250rpm振荡孵育1小时。
- 将部分或全部 沙门氏菌 电穿孔混合物铺在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。将板在37°C孵育过夜。
注意：在该协议中，分别使用35μg/ mL氯霉素和100μg/ mL氨苄青霉素选择pEVOL-PylRS-AF和pWSK29-sseJ 10TAG。
- 培养物制备
- 在含有适当抗生素的 5 mL LB 培养基中接种单个沙 门氏菌 或 大肠杆菌 菌落。在37°C下生长过夜，以250rpm振荡。
3. ncAA蛋白的表达和荧光标记
- 携带ncAA蛋白在大肠杆菌中的表达
- 将 100 μL 原代培养物转移到含有 35 μg/mL 氯霉素和 50 μg/mL 卡那霉素的 5 mL LB 培养基（1：50 稀释液）中，然后在 37 °C 下以 250 rpm 振荡孵育，直到 OD600 达到 0.4–0.6。
- 准备 1 mM TCO*A 储备溶液（10 mL; 表 1）。
- 当培养物达到OD600 = 0.4–0.6时，用含有1 mM TCO * A、35 μg/mL氯霉素和50 μg/mL卡那霉素的新鲜LB替换LB培养基。
注意：或者，可以按照步骤5.4.2中所述制备TCO*A储备溶液。 - 在1mM IPTG，0.2%阿拉伯糖存在下诱导蛋白质表达，并在34°C，250rpm下摇匀过夜。通过以11，000× g离心5分钟收获细菌细胞。除去上清液并将沉淀在-20°C冷冻直至进一步使用。
- 对于对照实验，重复相同的实验，但在没有ncAA的情况下表达携带ncAA的蛋白质。对于大肠杆菌中携带ncAA的蛋白质的体外荧光标记，请按照步骤3.3中描述的详细程序进行操作。
- 含ncAA蛋白在沙门氏菌中的表达
- 将 100 μL 原代培养物转移到含有 35 μg/mL 氯霉素和 100 μg/mL 氨苄西林的 5 mL LB 培养基（1：50 稀释）中，然后在 37 °C 下以 250 rpm 振荡孵育，直到 OD600 达到 0.6。
- 如 表1所述制备改性N-最小培养基（MgM，pH 5.6）。
- 用补充有1 mM TCO * A的改良N-最小培养基（MgM）替换LB培养基（表1）。在34°C下培养细菌30分钟。然后，加入0.2%阿拉伯糖，25mg / mL氯霉素和100mg / mL氨苄青霉素，并将细胞再生长6小时，以250rpm振荡。
- 6小时后，用不含ncAA的新鲜MgM（pH 5.6）培养基（表1）在30分钟的间隔内洗涤细菌4次。在洗涤步骤中，在室温下使用972 ×g15分钟。
- 离心细菌，重悬于1x PBS缓冲液中，并在4°C下在黑暗中孵育1小时以除去过量的ncAA。1小时后，将细菌在3，000× g，4°C下离心15分钟并储存以备进一步使用。
- 对于对照实验，在没有ncAA的情况下通过表达携带ncAA的蛋白质重复相同的实验。
- 鼠伤寒沙门氏菌中携带ncAA蛋白的体外荧光标记
- 在不存在或存在 TCO*A（来自步骤 3.2）的情况下，在 1x PBS 中重悬表达 SseJ-F10TCO-HA 的 沙门氏菌 细胞。将 OD600 调整为 4 英寸（以 PBS 为单位）。在黑暗中用20μMJanelia Fluor 646-四嗪（JF646-Tz）或20μM BDP-Fl-tetrazine（DMSO中的5mM储备溶液）在37°C下孵育细胞，并以250rpm振荡1-2小时。
- 沉淀细胞，用含有5%DMSO和0.2%Pluronic F-127的PBS洗涤3-4x，重悬于含有5%DMSO的PBS中，并在4°C下在黑暗中孵育过夜。用 1x PBS 再次清洗 2 次。在洗涤步骤中，在室温下使用972× g15分钟。
- 立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像，或在室温下在黑暗中用PBS中的1.5%多聚甲醛（PFA）固定30-45分钟。
- 用PBS洗涤固定细胞2次，最后在PBS中的50mM NH4Cl中洗涤15分钟以除去多余的PFA。将细胞重悬于PBS中，并在4°C下储存不超过3-4天。使用共聚焦显微镜对细菌进行成像，如第6节所述。
4. 携带ncAA蛋白的生化表征
- 细胞裂解
- 将3.1节中的细胞重悬于裂解缓冲液（表1）中，并在室温下孵育30分钟以上。将混合物在冰上冷却15分钟。
注意： 将裂解缓冲液与细胞重量的比例 保持在 1：10。 - 在冰上对重悬的细胞进行超声处理。使用超声仪在设置 7 下脉冲 30 秒，至少 6 倍，间隔 1 分钟（参见材料表）。
- 将细胞裂解物在20，500× g，4°C下旋转15分钟（维持4°C至关重要）。将上清液转移到新管中并弃去沉淀。
- 将3.1节中的细胞重悬于裂解缓冲液（表1）中，并在室温下孵育30分钟以上。将混合物在冰上冷却15分钟。
- 安全数据表页面分析
- 制备5x SDS上样染料（表1）。将 5 μL SDS 凝胶上样缓冲液加入 13 μL 细胞裂解物中。用十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液在95°C的2mL管中变性蛋白质10分钟，将混合物以2，000 ×g 离心50秒，然后加载到12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
- 组装凝胶盒，将其放入凝胶电泳装置中，然后将电泳装置连接到电源。倒入电泳缓冲液，加载分子量标记物和蛋白质样品，并在100 V下运行凝胶，直到溴酚到达分离凝胶的底部。
注意：立即开始分析，因为储存在-20°C的裂解物在每个冻融循环后往往会失去质量。 - 用考马斯蓝蛋白染色剂染色凝胶。
5. HeLa细胞中沙门氏菌 分泌效应子SseJ-F10TCO-HA的生物正交标记
- 在高葡萄糖 （4.5 g/L） Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 中培养并保持 HeLa 细胞在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度下，除青霉素 - 链霉素 （1x） 外还补充 10% （v/v） FBS。
- 感染前1天培养细菌。将含有pEVOL-PylRS-AF和pWSK29-sseJ 10TAG的沙门氏菌14028s的单个菌落接种在5mL含抗生素的标准LB肉汤中，在37°C下过夜，以250rpm振荡。
- 感染前1天接种HeLa细胞。取含有~80%汇合度的HeLa细胞的组织培养瓶（T-75），通过细胞密度的显微镜检查确定。用温热的PBS清洗细胞。用3mL温热的0.25%胰蛋白酶/ EDTA在37°C，5%CO2下分离细胞5分钟。
- 使用 2 mL DMEM（+ 10% FBS）淬灭胰蛋白酶。重悬细胞后，将烧瓶的全部内容物转移到15mL管中。以 1，000 × g 离心细胞 5 分钟。将上清液从管中取出。将HeLa细胞沉淀重悬于预热的生长培养基中。
- 使用血细胞计数器检查悬浮液并计数存在的细胞。制备 1 × 105 个细胞/mL 的稀释细胞储备液。在八孔室载玻片中，在 500 μL DMEM + 10% FBS 生长培养基中接种每孔 0.5 ×10 5 个 HeLa 细胞。将腔室载玻片保持在37°C，5%CO2，95%湿度的培养箱中24小时。
- 细菌感染
- 含有pEVOL-PylRS-AF和pWSK29-sseJ 10TAG的传代培养沙门氏菌14028s，通过将100μL过夜细菌培养物（来自步骤5.2）稀释到含有35μg/ mL氯霉素和100μg/ mL氨苄青霉素的3mLLB培养基（1：30稀释）中，然后在37°C下以250rpm振荡孵育5-7小时。
注意：在此阶段，培养物达到指数后期，细菌具有高度侵入性。 - 准备100 mM TCO*A储备溶液和完整培养基（表1）。
- 要启动 HeLa 细胞感染，请从培养箱中取出 HeLa 细胞并用预热的 DPBS 洗涤细胞，然后向每个孔中加入 500 μL 新鲜 DMEM （+10% FBS）。将腔室载玻片放回CO2 培养箱中，直到感染开始。
- 孵育 5-7 小时后，将 沙门氏菌 培养物稀释至 OD600 = 0.2 在 1 mL DMEM 生长培养基中 （~3 ×10 8 cfu/mL）。在腔室载玻片的每个孔中加入必要量的 沙门氏 菌接种物，使感染多重性（MOI）为100。
- 将感染的细胞在CO2 培养箱中孵育30分钟。用预热的DPBS洗涤细胞3次，以去除细胞外 沙门氏菌。将此时间点设置为感染后 0 小时。加入含有 100 μg/mL 庆大霉素的 500 μL 完全培养基（表 1）1 小时。1小时后，用DPBS洗涤细胞3倍。加入 500 μL 完整培养基（从步骤 5.4.2; 表 1）向腔室载玻片的每个孔中补充0.2%阿拉伯糖，10μg/mL庆大霉素。
- 在对照实验中，对没有TCO*A的HeLa细胞进行类似的感染。
- 将腔室载玻片在CO2 培养箱中孵育10小时。
- 含有pEVOL-PylRS-AF和pWSK29-sseJ 10TAG的传代培养沙门氏菌14028s，通过将100μL过夜细菌培养物（来自步骤5.2）稀释到含有35μg/ mL氯霉素和100μg/ mL氨苄青霉素的3mLLB培养基（1：30稀释）中，然后在37°C下以250rpm振荡孵育5-7小时。
- 点击活细胞中基于化学的标记
- 继续标记细菌感染的细胞。预热不含TCO*A的完整培养基（表1）。
- 感染后10小时后，用不含TCO*A的新鲜完全培养基替换完全培养基，并用预热的DPBS在30分钟的间隔内洗涤HeLa细胞4次，然后是新鲜的完全培养基（无TCO*A）。
- 在DMSO中制备0.5mM染料 - 四嗪储备溶液。
注意：为了标记宿主细胞中沙 门氏菌 分泌的效应子，提出了两种方案。对于方案1，通过将JF646-Tz原液稀释在含有1%酪蛋白钠盐的牛奶中的1x PBS中来制备染料混合物，使最终工作溶液为2μM。对于方案2，准备温热的完全培养基（不含FBS和TCO*A）并加入2μM JF646-Tz。 使这种染料混合物在每次标记会话时新鲜。如果可能的话，在黑暗中工作（调暗引擎盖和/或房间的灯光）。 - 感染后12小时后，从细胞中吸出培养基。用预热的DPBS 2x或3x清洗细胞。在一组孔中，加入500μL方案1中描述的染料溶液混合物，在同一室载玻片的另一组孔中，加入500μL方案2中描述的染料溶液混合物步骤5.5.3和之后的说明。将腔室载玻片放回CO 2培养箱中1.5-2小时。
- 感染后13.5-14小时后，用预热的DPBS冲洗HeLa细胞2倍。加入 500 μL 新鲜 DMEM（补充有 FBS）。将腔室载玻片放回培养箱中30分钟。用预热的DPBS洗涤细胞，然后在30分钟的间隔内使用新鲜的DMEM 4x。
- 在感染后 16 小时，通过在每孔中加入 200 μL 4% PFA 并在室温下在黑暗中孵育 10 分钟来用 PFA 固定 HeLa 细胞。吸出PFA，用PBS冲洗3次，并将细胞储存在4°C的PBS中，在黑暗中。
注意：PFA是一种剧毒化学品。避免吸入，以及皮肤和眼睛接触。搬运时穿戴防护装备。为避免标记样品暴露在光线下，请关闭细胞培养罩中的灯。
- HA标记蛋白的免疫染色
- 吸出PBS并在封闭溶液中冲洗一次（表1）。
- 将固定的HeLa细胞与基于PBS的一抗溶液（表1）在室温下在黑暗中孵育1小时。使用兔抗 HA 一抗对分泌的 SseJ 进行染色（1：500 稀释）。
- 1小时后，用0.5mL的0.1%吐温-20 / 1x PBS轻轻洗涤细胞2次。在用吐温/PBS 溶液洗涤期间，将细胞用 0.5 mL 的 0.1% 吐温 20/1x PBS 孵育 3 倍 5 分钟。
- 在二抗溶液中稀释二抗驴抗兔555 1：500，并在室温下在黑暗中孵育1小时。
- 1 小时后，用 0.5 mL 的 0.1% 吐温-20/1x PBS 轻轻洗涤细胞 2 次，并用 0.5 mL 的 0.1% 吐温 20/1x PBS 孵育 2 次 5 分钟。
- 用0.5mL的1x PBS洗涤细胞3x，并将其储存在4°C的黑暗中。
注意：固定细胞可以在4°C的PBS中储存几周。 免疫染色应在最后一刻进行。
6. 共聚焦成像
- 使用共聚焦显微镜，例如转盘（SD）或STED显微镜。
- 调整图像采集设置，例如扫描模式 （XYZ）、扫描速度 （400 Hz）、分辨率 （512 x 512）、放大倍率 （100x） 和 Z 轴堆叠。
- 对DAPI、BDP-Tz和JF646四嗪使用正确的激发/发射滤光片。
注意：对于此协议，共聚焦成像是在配备脉冲白光激光器的STED显微镜系统上进行的，允许选择470-670 nm范围内的激发和UV 405 nm二极管激光器以激发405 nm，488 nm和647 nm。使用内置声光分束器结合基于棱镜的共聚焦系统的可调谐多波段光谱检测来设置适当的发射范围。 - 使用100×/1.4油浸物镜采集图像。
7. 超分辨率 （dSTORM） 成像
- 成像前3小时打开显微镜以允许热平衡（如果在此之前开始成像，则更容易发生漂移）。将相机冷却至-70°C。
- 同时，制备新鲜的GLOX-BME成像缓冲液（表1）。
- 将细胞带到显微镜下。将成像室放在样品架的显微镜载物台上。在支架中，确保样品平坦且牢固。用0.4mL新鲜制造的GLOX-BME成像缓冲液更换孔中的培养基。
- 设置正确的激光线和滤光片组。将激光功率降低到~1 mW以识别感兴趣的HeLa细胞。调整焦平面和激光束角度，同时用 647 nm 的低激光密度照射样品（在这种情况下，建议使用陡峭的倾斜角度 [HILO]，因为 HILO 提高了信噪比 [SBR]）。调整 HILO 照明角度。
注意：在此协议中，使用倒置落射荧光显微镜（参见 材料表）在Alexa Fluor 647通道中获取SseJ的超分辨率成像，该显微镜配备了TIRF物镜（100x Apo TIRF油浸物镜，NA 1.49）。使用EMCCD相机检测荧光，该相机通过μManager控制。 - 将 前置放大器增益 设置为 3 ，并在μManager中激活 帧传输 。将 EM 增益 设置为 200 ，以提高 dSTORM 测量的灵敏度，如上一份报告35 中所述。
- 在进行dSTORM成像之前，捕获目标结构的参考衍射极限图像。通过将激光打开到最大功率，将荧光团切换到暗状态。
注意：如前所述，当JF646荧光团通过连续照明647nm激发光转变为主要黑暗状态时，观察到JF646荧光团的单个快速闪烁分子。 - 将激光强度调整到在空间和时间上将闪烁事件分开的合适水平，将 曝光时间 设置为 30 ms，然后开始采集。获取 10，000–30，000 帧。
注意：应更改激光强度以优化闪烁。如果检测到太多事件（重叠的闪烁粒子），请考虑增加激光强度。理想的长度取决于样本的质量，但~10，000帧应显示出可辨别的特征。
8. dSTORM的图像重建
- 使用适当的软件进行图像分析。
注意：ThunderSTORM是许多可用的开源图像重建程序之一，下面简要介绍。 - 打开 ImageJ 并导入原始数据。打开雷暴插件并配置与设备对应的相机设置。
- 转到 运行分析 并设置适当的设置，例如图像滤波（平均滤波器的差异）、定位方法（局部最大值）和分子的亚像素定位（集成高斯 PSF）。单击 “确定 ”开始图像重建。
注意：如有必要，在 ThunderSTORM 中设置参数的详细说明已经描述37.
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Representative Results
该协议论文描述了一种基于GCE的方法，用于沙门氏菌分泌效应子的位点特异性荧光标记和可视化，如图1所示。含有ncAA的反式环辛烯生物正交基团（TCO）和荧光染料的化学结构如图1A所示。SseJ标记是通过GCE技术使用正交氨基酰基-tRNA合成酶/tRNA对在琥珀色终止密码子（见图1B）上遗传掺入生物正交ncAAs来实现的。用含有荧光团（JF646-Tz或BDP-Tz）的四嗪处理TCO标记的效应子提供了一种替代蛋白质标记策略，能够在宿主感染数小时后观察易位的沙门氏菌分泌效应子（图1B，C）。我们首先确定了可能的氨基酸残基，并根据表面可及性和SseJ功能残基的现有知识选择了SseJ的位置10进行ncAA包合。先前的结构数据和表面暴露预测有助于选择特定位置。
琥珀色密码子在编码POI的基因中的位置会影响TCO掺入的功效。因此，应创建并分析一系列在POI基因不同位置具有琥珀色密码子的突变体，以实现最佳整合效率。琥珀色密码子位置的选择是经验性的。一般来说，改变的残基对于POI功能应该是非必需的，没有翻译后修饰，并且可用于荧光探针。表达质粒应为低拷贝数，以便其模拟POI的天然拷贝数。密码子上下文会影响正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统掺入ncAA的有效性。虽然 AAT-TAG-ACT 是正交 tRNA 的首选上下文，但 sseJ 的苯丙氨酸-10 的位置更改为 TAG，确保 AAT-TAG-ACT 上下文能够最有效地掺入 ncAA。首先，我们使用高拷贝数质粒表达sseJ测试突变体在大肠杆菌中是否具有功能。正如SDS-PAGE所证明的那样，SseJ-F10TCO-HA突变体表达取决于TCO*A的存在和相应的最佳tRNA/aaRS（图2A）。SseJ-F10FCO-HA用JF646-Tz标记，使用SPIEDAC点击化学在大肠杆菌中标记。通过荧光显微镜分析证实了大肠杆菌体外SseJ-F10TCO-HA的选择性荧光标记（图2B）。因此，使用GCE，TCO*A被特异性地掺入sseJ中的琥珀色密码子中。试图使用tRNAPyl/PylRS AF系统直接鉴定ncAAs的基因组脱靶掺入没有产生它们存在的证据。然而，我们建议使用凝胶内荧光、蛋白质印迹、荧光融合蛋白、体外荧光标记和其他方法来评估pEVOL质粒的效率、特异性、脱靶掺入程度和毒性，如本文12，29中引用的先前报道的论文中所述。
一旦我们确定sseJ中抑制的TAG具有功能，我们将sseJ-F10TCO-HA及其天然启动子克隆到低拷贝数质粒pWSK29中，确保用于荧光标记和可视化的AAT-TAG-ACT基序。 使用荧光显微镜确认沙门氏菌细胞中SseJ-F10TCO-HA的体外选择性标记（图3）。然后，我们在不存在或存在TCO*A的情况下，用补充有p sseJ-HA或p sseJ 10TAG-HA的野生型沙门氏菌菌株感染HeLa细胞，以确定TCO掺入的SseJ是否可以易位到宿主细胞中。感染的HeLa细胞用PFA固定，并在感染后16小时用抗HA抗体免疫染色，以突出SseJ修饰的SIF。如图4C所示，SseJ-F10TCO-HA明显分泌，形成SseJ依赖性SIF，它们看起来与野生型感染细胞中观察到的相似（图4A）。然而，在没有TCO*A的情况下，没有观察到SseJ依赖性的SIF（图4B）。这些观察结果表明，使用GCE表达sseJ-F10TCO-HA拯救了SseJ依赖性SIF。此外，结果还表明，SseJ-F10TCO-HA是沙门氏菌的全功能毒力因子。
在确认GCE标记的SseJ具有功能性和分泌性后，我们使用SPIEDAC反应在HeLa细胞中用JF646-Tz标记SseJ-F10TCO-HA。为此，我们在TCO*A存在下，用野生型沙门氏菌感染HeLa细胞，并补充了p sseJ-F10TCO-HA。使用方案第5节中描述的两种替代方案用JF646-Tz标记后，广泛洗涤细胞以去除多余的染料，用PFA固定，并用抗HA抗体免疫染色以可视化分泌的SseJ-F10TCO-HA。分泌到HeLa细胞细胞质中的SseJ-F10TCO-HA用JF646-Tz标记（图5A，B，红色），并与HA标签（绿色）明确共定位。观察到两个标记相互重叠（一个是荧光染料，另一个通过免疫染色标记），进一步强调了GCE标记的特异性。
为了确保在这些HeLa细胞中观察到的荧光信号仅对分泌的效应子SseJ具有特异性，我们在TCO*A和pEVOL-PylRS-AF存在下用野生型 沙门氏菌 （携带psseJ-HA）感染细胞。使用点击染料观察HeLa细胞中是否有任何背景标记。SseJ被释放到宿主细胞的细胞质中，没有细胞内或非特异性荧光信号（图5C），表明荧光信号对SseJ具有特异性。在确定ncAA特异性掺入琥珀色密码子，并且分泌的SseJ可以通过点击反应 在 宿主细胞中可视化后，下一个目标是创建HeLa细胞中分泌的SseJ的超分辨率图像（图6）。在 图6中，我们展示了GCE的力量以及使用JF646染料生成HeLa细胞中 沙门氏菌 分泌效应子SseJ的位点特异性超分辨率图像。
图 1：SPI-2 效应器的位点特异性荧光标记方案。（A） TCO*A 和 JF-646-四嗪。（B） 示意图描述了在 SPI-2 效应器中加入 ncAA。在细菌细胞中，引入含有效应POI（紫色）和正交抑制tRNA（红色）/氨酰基合成酶（绿色）对基因的质粒。在允许的位置，将天然密码子与效应基因序列中的琥珀色（TAG，红色）终止密码子交换。ncAA（深红色圆圈）被简单地引入生长培养基中。然后它被细胞拾取并到达细胞质，在那里它通过氨酰基 tRNA合成酶 （aaRS） 与正交 tRNA 连接。由于效应器mRNA（紫色）上的互补琥珀色密码子，具有CUA反密码子的ncAA酰化tRNA进入核糖体机制，将附着的ncAA结合到效应器中。ncAA由效应位点的全长多肽链携带，然后折叠并组装成功能性效应蛋白。新产生的效应器通过T3SS转移到宿主细胞中。外部提供的荧光团可用于标记与ncAA集成的分泌SPI-2效应子。（C）荧光四嗪染料的无铜点击反应方案。通过SPIEDAC点击反应，具有掺入POI（SseJ）的链烯基的ncAA与四嗪偶联染料（JF646-Tz）反应。荧光四嗪偶联染料JF646-Tz只有在成功标记后才会变成荧光（红色）。缩写：TCO*A = 反式环辛-2-烯-L-赖氨酸;ncAA = 非规范氨基酸;T3SS = 三型分泌系统;SPI-2 = 沙门氏菌 致病性岛 2;POI = 感兴趣的蛋白质;SPIEDAC = 应变促进逆电子需求柴油-桤木环加成。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：TCO*A 被位点特异性地掺入到大肠杆菌中表达的 SseJ-F10TCO-HA 中。（A）Coomassie染色的SDS-PAGE确认TCO*A选择性地掺入SseJ-F10TCO-HA（用红色箭头表示）in 大肠杆菌中。（B）在不存在（顶部）或存在（底部）的情况下通过荧光显微镜分析的大肠杆菌中SseJ-F10TCO-HA的表达，不存在（顶部）或存在（底部）存在TCO*A.在不存在或存在TCO*A的情况下表达SseJ-F10TCO-HA的大肠杆菌细胞与BDP-Fl-tetrazine一起孵育并成像以进行BDP荧光（绿色）。 SseJ荧光（绿色）仅在存在掺入的TCO*A标记物的情况下观察到;请注意，顶部面板中没有背景荧光。比例尺 = 2 μm。缩写：TCO*A = 反式环辛-2-烯-L-赖氨酸;BF = 明场;HA = 透明质酸。请点击此处查看此图的大图。
图 3：TCO*A 被位点特异性地掺入沙门氏菌中表达的 SseJ-F10TCO-HA 中 。 荧光显微镜用于检查SseJ-F10TCO-HA在沙 门氏菌 中在1mM TCO * A不存在（顶部）或存在（底部）的情况下的表达。 表达SseJ F10TCO-HA的 沙门氏菌 用JF646-Tz处理，并在存在或不存在TCO*A的情况下对JF646荧光（洋红色）成像。比例尺 = 2 μm。缩写：TCO*A = 反式环辛-2-烯-L-赖氨酸;BF = 明场;HA = 透明质酸。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：分泌的 SseJ-J10TCO-HA 具有功能性。 （A）HeLa细胞感染含有psseJ-HA的沙门氏菌16小时，固定并用抗HA抗体（红色），LPS（绿色）和DAPI（蓝色）免疫染色。正如预期的那样，在感染的细胞中观察到SseJ依赖性SIF的形成。（B）在没有TCO*A的情况下，琥珀色密码子不被抑制，并且在感染的HeLa细胞中不存在SseJ依赖性SIF。HeLa细胞在没有TCO*A的情况下感染表达SseJ-F10TCO-HA的沙门氏菌16小时，固定并用抗HA抗体（红色），LPS（绿色）和DAPI（蓝色）免疫染色。（C）在TCO*A存在下观察到SseJ依赖性SIF.在400μM TCO*A存在下用表达SseJ-F10TCO-HA的沙门氏菌感染的HeLa细胞是固定的，并用抗HA抗体SseJ（红色），LPS（绿色）和DAPI（蓝色）免疫染色。在左图中观察到SseJ依赖性SIF，清楚地表明SseJ是通过使用GCE表达sseJ-F10TCO-HA拯救的。比例尺 = 10 μm。缩写：HA = 透明质酸;LPS = 脂多糖;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;TCO*A = 反式环辛烷-2-烯-L-赖氨酸;SIFs = 沙门氏菌诱导的细丝;GCE = 遗传密码扩展。请点击此处查看此图的大图。
图 5：用 JF646-Tz 染料标记 SseJ 的特异性。（A）HeLa细胞在400μM TCO*A存在下感染表达SseJ-F10TCO-HA的沙门氏菌。 TCO标记的分泌SseJ-F10TCO-HA在含有来自牛奶的1%酪蛋白钠盐的1x PBS中用2μM JF646-Tz标记，广泛洗涤，固定并用抗HA抗体免疫染色以可视化分泌的SseJ（绿色）。分泌SseJ-F10TCO-HA并用JF646-Tz染料（红色，左图）标记。通过GCE（红色）和HA（绿色）标记的SseJ显然是共定位的（右图）。（B）使用略有不同的标记方案，TCO标记的分泌SseJ-F10TCO-HA也在完全培养基DMEM（不含FBS）中用2μM JF646-Tz标记，广泛洗涤和固定，并进行抗HA免疫荧光染色。分泌的SseJ-F10TCO-HA用JF646-Tz染料（红色，左图）标记并与HA（绿色）共定位。（C）为了进一步确定荧光信号是SseJ独有的，而不是其他SPI-2释放蛋白的产物，HeLa细胞在ncAA（TCO*A）存在下感染携带psseJ-HA和pEVOL-PylRS-AF的野生型沙门氏菌。在感染后16小时，在完全培养基（无FBS和TCO*A）中用2μM JF646-Tz处理感染的HeLa细胞，并使用新的生长培养基彻底去除多余的染料。HeLa细胞是PFA固定的，并在免疫染色之前用PBS彻底洗涤SseJ（绿色）。左侧图（JF646-Tz）中缺乏可见的背景荧光信号，表明宿主细胞内几乎没有发生脱靶标记。比例尺 = 10 μm。缩写：HA = 透明质酸;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;FBS = 胎牛血清;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;TCO*A = 反式环辛烷-2-烯-L-赖氨酸;SIFs = 沙门氏菌诱导的细丝;GCE = 遗传密码扩展;SPI-2 = 沙门氏菌致病性岛 2;BF = 明场。请点击此处查看此图的大图。
图6：HeLa细胞中GCE标记的SseJ的超分辨率成像。HeLa细胞在400μM TCO*A存在下感染表达SseJ-F10TCO-HA的 沙门氏菌 .TCO标记的分泌SseJ-F10TCO-HA在协议中所述的生理条件下用2μM JF646-Tz标记，然后广泛洗涤。图像是使用尼康N-STORM采集的。（A）观察中的HeLa细胞的明场图像。比例尺 = 10 μm。 （B） 用 TCO*A 和 JF-646 标记的分泌 SseJ 的衍射极限宽场图像。比例尺 = 10 μm. （C） SseJ 装饰的 SIF 的相应 dSTORM 图像。比例尺 = 10 μm。 C（i） 插图显示了盒装区域中超分辨率 SseJ 的放大视图。比例尺 = 1 μm。缩写：HA = 透明质酸;TCO*A = 反式环辛烷-2-烯-L-赖氨酸;SIFs = 沙门氏菌诱导的细丝;GCE = 遗传密码扩展;WF = 宽场;BF = 明场。 请点击此处查看此图的大图。
表 1.解决 方案。请点击此处查看此表的放大版本。
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Discussion
本文描述的方法用于跟踪感染后由细菌T3SS注射到宿主细胞中的效应蛋白的精确位置。T3SS被 沙门氏菌、 志贺氏菌和 耶尔森氏菌 等细胞内病原体用于将毒力成分转运到宿主中。超分辨率成像技术的发展使得以以前无法想象的分辨率12，13，24可视化毒力因子成为可能。然而，某些标记限制排除了更深入的研究，因为光活化蛋白融合会阻塞T3SS孔并且不分泌。此外，聚类伪影和错误分析可能是由于某些融合蛋白固有的聚类或聚集倾向造成的。
在某些情况下，融合蛋白也被切割，正如我们之前用PAmCherry-SsaP12，13观察到的那样。GCE克服了所有这些限制，GCE允许对POI进行位点特异性荧光标记。它还允许可视化不丰富的蛋白质12，13。虽然有许多因素会影响使用正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统掺入ncAA的效率，但密码子背景似乎是最关键的。当首选密码子上下文为 AATTAGACT33 时，正交 tRNA 最有效地结合 ncAA。在 图5中，我们可以比较GCE和位点特异性荧光团（以及无背景）产生的脆标记与HA标签的免疫染色。
因此，研究人员将能够使用此处概述的方法可视化病原体，共生细菌和真核宿主中的POI。简而言之，当传统方法失败时，基因编码的ncAAs提供了一种替代的效应蛋白标记方法。然而，该方法的一个主要限制是荧光团的固有化学性质，例如膜通透性、分布和保留，这会影响荧光标记的效率。荧光ncAA是避免点击反应的替代选择12，但是这些只能使用双光子显微镜进行可视化。读者参考本文12、38、39、40、41中引用的细胞膜渗透性/不可渗透性染料的列表。
总之，我们通过基因编码ncAAs与荧光荧光团组合而不损害其生物学功能，对 沙门氏 菌分泌效应子SseJ进行位点特异性标记和可视化。用JF646-Tz标记SseJ具有高度特异性，超分辨率成像可以进一步用于可视化宿主细胞内的分泌效应子。因此，使用dSTORM兼容染料和遗传密码扩展对细菌效应子进行荧光标记允许在低于衍射极限的分辨率下对宿主细胞中细菌分泌的效应子进行亚细胞空间定位。由于该标记平台与活细胞成像单颗粒跟踪兼容，我们的方法将能够以前所未有的时间和空间分辨率分析T3SS系统的效应蛋白，这将增强我们对细菌发病机制的分子理解。
虽然存在一定的局限性，例如ncAA掺入效率差和有机荧光团的光物理限制，但我们已经证明这种方法可以帮助研究人员观察和定位宿主细胞内的分泌效应子，即使它是稀缺的12，13。我们预计，该技术的适应将为细菌在感染过程中产生的其他效应蛋白的成像和研究开辟新的令人兴奋的机会。该方法也很容易适用于病毒的标记，显示出其广泛的实用性。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯大学医学分院的启动资金的支持，以及L.J.K.的德克萨斯州之星奖。我们感谢Edward Lemke教授（德国海德堡欧洲分子生物学实验室）提供的质粒pEVOL-PylRS-AF。 图1 中的图像是使用BioRender创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
References
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