Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (<250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.

Zusammenfassung

Ausgerichtete Kollagen-I-Fasern (COL1) steuern die Beweglichkeit von Tumorzellen, beeinflussen die Morphologie von Endothelzellen, kontrollieren die Differenzierung von Stammzellen und sind ein Markenzeichen von Herz- und Muskel-Skelett-Geweben. Um die Zellantwort auf ausgerichtete Mikroumgebungen in vitro zu untersuchen, wurden mehrere Protokolle entwickelt, um COL1-Matrizen mit definierter Faserausrichtung zu erzeugen, einschließlich magnetischer, mechanischer, zellbasierter und mikrofluidischer Methoden. Von diesen bieten mikrofluidische Ansätze fortschrittliche Fähigkeiten wie die genaue Kontrolle von Flüssigkeitsflüssen und der zellulären Mikroumgebung. Die mikrofluidischen Ansätze zur Erzeugung ausgerichteter COL1-Matrizen für fortschrittliche In-vitro-Kulturplattformen waren jedoch auf dünne "Matten" (<40 μm Dicke) von COL1-Fasern beschränkt, die sich über Entfernungen von weniger als 500 μm erstrecken und für 3D-Zellkulturanwendungen nicht geeignet sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von 3D-COL1-Matrizen (130-250 μm Dicke) mit millimetergroßen Bereichen definierter Faserausrichtung in einem mikrofluidischen Gerät vor. Diese Plattform bietet fortschrittliche Zellkulturfunktionen zur Modellierung strukturierter Gewebemikroumgebungen, indem sie direkten Zugriff auf die mikrotechnische Matrix für die Zellkultur bietet.

Einleitung

Die Zellen befinden sich in einem komplexen 3D-Fasernetzwerk, der als extrazelluläre Matrix (ECM) bezeichnet wird und deren Großteil aus dem Strukturprotein Kollagen Typ I (COL1) ^besteht1,2. Die biophysikalischen Eigenschaften der EZM geben den Zellen Orientierungshilfen, und als Reaktion darauf modellieren die Zellen die EZM-Mikroarchitektur ^3,4,5. Diese reziproken Zell-Matrix-Wechselwirkungen können zu ausgerichteten COL1-Faserdomänen⁶ führen, die die Angiogenese und Zel....

Protokoll

1. Herstellung des zweiteiligen Kanals und der modularen Plattformbasis

HINWEIS: Der mikrofluidische Kanal besteht aus zwei Teilen - dem mikrofluidischen Kanal-"Ausschnitt", der aus einer Polydimethylsiloxan-Folie (PDMS) definierter Dicke geschnitten wird, und der Kanalabdeckung, die sich reversibel mit dem Ausschnitt verbindet und den Kanal bildet. Der Kanal ist von einem Rahmen aus Polymethylmethacrylat (PMMA) umgeben, der als Medienreservoir fungiert (Abbildung 1). Der PMMA-Rahmen kann auch verwendet werden, um spezielle Module magnetisch zu verriegeln, um zusätzliche Funktionalität zu erhalte....

Ergebnisse

Wenn eine selbstorganisierende COL1-Lösung durch einen Kanal mit abnehmender Querschnittsfläche fließt, steigt die stromweise Geschwindigkeit (v x) der COL1-Lösung lokal um eine Größe ∂v x entlang der Länge der Einschnürung zwischen den beiden Segmenten (∂x), was zu einer Dehndehnungsrate (ε̇) führt, bei der ε̇ = ∂v x/∂_x ist. Die Dehndehnungsrate kann aus der Fluidgeschwindigkeit berechnet werden, die mit Hilfe der Partikelbildgeschwindigkeit (PIV) gemessen wird, wie in

Diskussion

Protokolle zur Erzeugung von COL1-Matrizen mit ausgerichteten Fasern wurden unter Verwendung magnetischer Methoden, der direkten Anwendung mechanischer Dehnung und mikrofluidischer Techniken beschrieben⁴⁷. Mikrofluidische Ansätze werden häufig verwendet, um mikrophysiologische Systeme zu schaffen, da sie genau definierte Strömungs- und Transporteigenschaften aufweisen, die eine präzise Kontrolle der biochemischen Mikroumgebung ermöglichen. Da ausgerichtete COL1-Fasern wichtige instruktive Hinweise.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(3-Aminopropyl)triethoxysilan, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT-Serie abgewinkelte Dosierspitze	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" Durchmesser x 1/16" dick Vernickelter Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETON ACS REAGENZ ≥ 99,5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABOR CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V, 98%, Reagenzqualität, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Klargegossene Acrylplatte	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2,5 % Trypsin in HBSS [-] Calcium, Magnesium, Phenolrot, Porcine Parvovirus Getestet VWR		45000-666
Countess II Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE Software	LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyd 50% in wässriger Lösung, Reagenzqualität, Verpackung=HDPE-Flasche, Größe=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 m)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
Hochreiner Silikonkautschuk .010" dick, 6" x 8" Blatt, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen  Trypanblauer Fleck (0,4 %)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laserschneider	Vollspektrum	20x12 Mikrofluidik der H-Serie
Spritzenpumpe	New Era Spritzenpumpen	NE-1002X
Microman E Einkanal-Pipettor, Gilson, Modell M1000E	Gilson	FD10006
Molekulare Sonden Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molekulare Sonden Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Rinder Atelo Kollagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7,4	VWR	70011044,00
PBS pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10x), mit Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Ersatz-Trägerblatt für graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Kunststoffspritze 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Siliziumwafer	Universitätswafer	452
Natriumhydroxid, ACS, Verpackung=Polyflasche, Größe=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific  Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00