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एमनियोटिक झिल्ली से लुमिकन निष्कर्षण और इसके भंडारण तापमान का निर्धारण

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64460
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एमनियोटिक झिल्ली (एएम) से लुमिकन के निष्कर्षण और इसके प्रोटीन और लुमिकन एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए 6, 12, 20 और 32 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) और कमरे के तापमान (आरटी) के रूप में उनकी भंडारण स्थितियों का वर्णन करता है।

Abstract

लुमिकन मानव एमनियोटिक झिल्ली (एएम) में एक छोटा ल्यूसीन युक्त प्रोटिओग्लाइकन है जो कॉर्नियल एपिथेलियलाइजेशन और कोलेजन फाइबर के संगठन को बढ़ावा देता है, कॉर्नियल पारदर्शिता बनाए रखता है। वर्तमान कार्य में, लुमिकन प्राप्त करने के लिए एएम से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक विधि प्रस्तावित है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न तापमानों और समय अवधि पर संग्रहीत एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) में लुमिकन की स्थिरता का मूल्यांकन किया जाता है। 100 मिलीग्राम एएम को पिघलाया गया और यांत्रिक डी-एपिथेलियलाइज्ड किया गया। डी-एपिथेलियलाइज्ड एएम को जमे हुए और कुचल दिया गया था जब तक कि एक महीन पाउडर प्राप्त नहीं किया गया था, जिसे प्रोटीज इनहिबिटर के साथ 2.5 एमएल खारा बफर के साथ घुलनशील किया गया था और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरने वाला 6, 12, 20 और 32 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान (आरटी) पर एकत्र और संग्रहीत किया गया था। बाद में, प्रत्येक एएमई में लुमिकन की मात्रा निर्धारित की गई थी। यह तकनीक एएम से लुमिकन निष्कर्षण के लिए एक सुलभ और स्वीकार्य प्रोटोकॉल की अनुमति देती है। लुमिकन एकाग्रता भंडारण समय और तापमान की स्थिति से प्रभावित थी। -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 12 दिनों के एएमई में लुमिकन अन्य एएमई की तुलना में काफी अधिक था। यह लुमिकन निष्कर्षण उपचार और दवा समाधान विकसित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। पुन: उपकलाकरण और घाव भरने की प्रक्रिया में एएमई लुमिकन के उपयोग को निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

Introduction

कॉर्नियल स्नेह के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले उपचारों में से एक एमनियोटिक झिल्ली प्रत्यारोपण है; हालांकि, हाल के वर्षों में, वैकल्पिक और सहायक उपचार के रूप में एमनियोटिक ऊतक के विभिन्न घटकों का उपयोग करने के लिए नए प्रस्ताव सामने आए हैं। एएम के सबसे अधिक अध्ययन किए गए घटकों में एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) 1,2,3,4,5,6,7 से प्राप्त किए गए हैं। एएम में कई घुलनशील कारक होते हैं जैसे एंटीएंजियोजेनिक प्रोटीन, इंटरल्यूकिन (आईएल), मेटालोप्रोटीनेस (टीआईएमपी) के ऊतक अवरोधक, टीएसजी -6 द्वारा मध्यस्थ विरोधी भड़काऊ प्रोटीन जो न्यूट्रोफिल बाह्य जाल को रोकते हैं, विकास कारक: एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (टीजीएफ) (अल्फा और बीटा), केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ), हेपेटोसाइट ग्रोथ फैक्टर (एचजीएफ), और लुमिकन, जो कोलेजन फाइब्रिलोजेनेसिस1 को विनियमित करके कॉर्नियल पारदर्शिता बनाए रखता है। 2,3,4,5,6,7,8,9.

लुमिकन एक छोटा ल्यूसीन युक्त प्रोटीओग्लाइकन (एसएलआरपी) है, जो कॉर्नियल स्ट्रोमा मैट्रिक्स में अंतरालीय कोलेजनेज के मुख्य बाह्य घटकों में से एक है, जो कोलेजन फाइबर को व्यवस्थित करने और कॉर्नियल पारदर्शिता 4,10,11 को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है। प्रोटिओग्लाइकेन्स बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में अणु हैं, जो सेल सिग्नलिंग करने और इंट्रासेल्युलर होमियोस्टेसिस12 को बनाए रखने में मुख्य हैं। घाव भरने के दौरान प्रसार, भेदभाव और प्रवासन की सेलुलर प्रक्रियाओं को चलाने के लिए ईसीएम प्रोटीन की सूचना दी गईहै।

साक्ष्य कॉर्नियल पुन: उपकलाकरण की प्रक्रिया में लुमिकन की संभावित भागीदारी को इंगित करता है। एक अध्ययन में, सैका एट अल ने दिखाया कि कॉर्नियल चोट के बाद, चोट के बाद पहले 8 घंटे और 3 दिनों के बीच कॉर्नियल केराटोसाइट्स में लुमिकन का पता लगाया जा सकता है। दूसरे और तीसरे दिन लुमिकन की उच्चतम सांद्रता प्रस्तुत करते हुए, यह प्रोटीओग्लाइकन बाद में सातवें दिन13 पर अज्ञात है। ये डेटा कॉर्नियल री-एपिथेलियलाइजेशन प्रक्रिया के सक्रियण में लुमिकन की भागीदारी का सुझाव देते हैं। दूसरी ओर, एक अन्य अध्ययन में, यह बताया गया था कि लुमिकन की अनुपस्थिति पुन: उपकलाकरण में देरी करती है; दिलचस्प बात यह है कि लुमिकन को जोड़ने से पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया 4,11,13 में तेजी आ सकती है। इसी तरह, एक हालिया अध्ययन ने बताया है कि लुमिकन कॉर्नियल लिम्बस फाइब्रोब्लास्ट 14 के भड़काऊ कार्यों कोसंशोधित कर सकता है, जो भड़काऊ, एंटीफिब्रोटिक और पुन: उपकला प्रतिक्रिया के मॉड्यूलेटर के रूप में लुमिकन के लिए एक भूमिका का सुझाव देता है। इसी तरह, लुमिकन एफएएस-एफएएसएल जैसे सिग्नलिंग अणुओं के साथ बातचीत करके कॉर्नियल प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकता है। इसके अलावा, नॉकआउट लुम-/- माउस मॉडल में लुमिकन की अनुपस्थिति से पता चला है कि लुमिकन सिग्नलिंग की कमी पर्याप्त कॉर्नियल मरम्मत को रोकतीहै।

मुख्य रूप से, इस विधि का उद्देश्य एएम से लुमिकन निकालने के लिए एक व्यवहार्य और सुलभ तरीका प्रदर्शित करना है। लुमिकन निष्कर्षण की इस लाभप्रद विधि के साथ, प्रोटीन की समान सांद्रता प्राप्त करना संभव है, प्रसंस्करण समय को कम करना और पिछलेअध्ययनों की तुलना में जांचकर्ताओं के लिए इसे अधिक सुविधाजनक बनाना। इसके अलावा, इस एएमई लुमिकन का उपयोग कॉर्नियल मरम्मत और पुन: उपकलाकरण प्रक्रियाओं के लिए एक सहायक के रूप में किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को संस्थागत समीक्षा बोर्ड (परियोजना संख्या सीईआई-2020/06/04) द्वारा अनुमोदित किया गया था। एएम को इंस्टीट्यूटो डी ओफ्टालमोलोगिया कोंडे डी वालेन्सियाना एमनियन बैंक (अज्ञात मानव विषयों से) से प्राप्त किया गया था, जिसे चावेज़-गार्सिया एट अल.17 द्वारा वर्णित के रूप में तैयार किया गया है।

1. एमनियोटिक झिल्ली निकालने की तैयारी

  1. एमनियन बैंक से 100 मिलीग्राम एएम प्राप्त करें।
    नोट: पिछली रिपोर्ट के अनुसार, 50 मिलीग्राम एएम कुल 10 एनजी / एमएल लुमिकन14 का स्राव करता है। लुमिकन की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए, 100 मिलीग्राम एएम का उपयोग करें, जो 32 सेमी 2 के कुल क्षेत्रफल के बराबरहै।
  2. यदि एएम जमे हुए हैं, तो इसे कमरे के तापमान पर पिघलाएं।
    नोट: लैमिनार फ्लो हुड क्लास II बी के तहत निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
  3. 2 मिनट के लिए 10 एमएल बाँझ संतुलित नमक समाधान (बीएसएस, सामग्री की तालिका देखें) के साथ पेट्री डिश में एएम धो लें।
    1. बीएसएस को बीकर में डालें।
    2. चरण 3 को दोहराएं और नेत्रहीन पुष्टि करें कि ग्लिसरॉल माध्यम पेट्री डिश बीएसएस में मौजूद नहीं है।
      नोट: चरण 3 दोहराएँ। आवश्यकतानुसार जब तक ग्लिसरॉल माध्यम पेट्री डिश बीएसएस में मौजूद नहीं है।
  4. एएम को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 10 एमएल डिस्पेस II (1.7 आईयू / एमएल, सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: डिस्पेज़ II उपकला कोशिकाओं पर कोमल गतिविधि के साथ एक तटस्थ प्रोटीज है। यह एंजाइम प्रभावी रूप से बरकरार एपिडर्मिस को डर्मिस से अलग करता है और बरकरार उपकला शीट18 को अलग करता है।
  5. इनक्यूबेशन को हटाने के बाद, रबर पुलिसकर्मी के साथ एक यांत्रिक डी-एपिथेलियलाइजेशन14 करें ( सामग्री की तालिका देखें)। माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा डी-एपिथेलियलाइजेशन की पुष्टि करें।
    नोट: डी-एपिथेलियाइजेशन की प्रक्रिया को 4x और 20x उद्देश्यों का उपयोग करके एक उल्टे माइक्रोस्कोप में पुष्टि की जाती है। किसी भी सेलुलर परत की उपस्थिति को बाहर करने के लिए ऊतक की कल्पना करें।
  6. 2 मिनट के लिए 10 एमएल बीएसएस के साथ पेट्री डिश में एएम धो लें। बीएसएस को बीकर में डालें।
  7. डी-एपिथेलियलाइज्ड एएम (डीएएम) को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। 40 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में डीएएम को डुबोएं।
  8. मैन्युअल रूप से जमे हुए डीएएम को -85 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकूल्ड मोर्टार में 2-3 मिनट के लिए पीस लें जब तक कि एक महीन पाउडर प्राप्त न हो जाए।
  9. मोर्टार में, 2.5 एमएल प्रोटीज अवरोधक समाधान (प्रोटीज इनहिबिटर के साथ बीएसएस) के साथ डीएएम पाउडर को घुलनशील करें।
    नोट: प्रोटीज अवरोधक की प्रत्येक गोली में एंजाइमों का निम्नलिखित मिश्रण होता है: अग्न्याशय अर्क (0.02 मिलीग्राम / एमएल), थर्मोलिसिन (मेटालोप्रोटीज) (0.0005 मिलीग्राम / एमएल), काइमोट्रिप्सिन (0.002 मिलीग्राम / एमएल), ट्रिप्सिन (0.02 मिलीग्राम / एमएल), और पपैन (0.33 मिलीग्राम / एमएल) ( सामग्री की तालिका देखें)।
  10. मिश्रण को माइक्रोपिपेट के साथ इकट्ठा करें, और स्केलपेल चाकू की मदद से मोर्टार की दीवारों को साफ करें। मिश्रण को 5 एमएल ट्यूब में रखें।
  11. 30 सेकंड के लिए भंवर के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
  12. ऊतक मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 34 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए तुरंत 3360 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके समरूप करें।
  13. एकत्र किया गया सुपरनैटेंट एएमई (चित्रा 1) है। -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान (आरटी) की विभिन्न तापमान स्थितियों पर 6, 12, 20 और 33 दिनों के लिए विभिन्न 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रत्येक एएमई के 0.7 एमएल स्टोर करें।

Figure 1
चित्र 1: एएमई तैयार करने और लुमिकन एकाग्रता माप की प्रक्रिया। 100 मिलीग्राम एएम को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डिस्पेस II के साथ इनक्यूबेट किया गया और यांत्रिक रूप से डी-एपिथेलियलाइज्ड किया गया। डी-एपिथेलियलाइज्ड एएम को 40 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में धोया और डुबोया गया था, और फिर एक महीन पाउडर प्राप्त होने तक कुचल दिया गया था, जिसे प्रोटीज इनहिबिटर और सेंट्रीफ्यूज के साथ 2.5 एमएल खारा बफर के साथ घुलनशील किया गया था। सुपरनैटेंट को कुल प्रोटीन और लुमिकन मात्रा तक 6, 12, 20 और 32 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और आरटी पर एकत्र और संग्रहीत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. एएमई प्रोटीन परिमाणीकरण

नोट: एएमई में कुल प्रोटीन का परिमाणीकरण तुरंत बाद किया जाना चाहिए। लोरी प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह सिफारिश की जाती है कि सभी मानकों और नमूनों को तीन प्रतियों में जांचा जाए।

  1. 96-वेल माइक्रोप्लेट में एएमई के प्रत्येक नमूने का पिपेट 40 μL।
    1. 0-1,500 μg/ mL (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 और 1,500 μg / mL) की अंतिम बीएसए एकाग्रता के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) मानक का उपयोग करके एक ही माइक्रोप्लेट में एक मानक वक्र तैयार करें।
  2. प्रत्येक कुएं के लिए संशोधित लॉरी अभिकर्मक का पिपेट 200 μL। तुरंत इसे 30 सेकंड के लिए प्लेट मिक्सर पर मिलाएं।
  3. माइक्रोप्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें और इसे 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक कुएं के लिए 1x फोलिन-सिओकैल्ट्यू अभिकर्मक का 20 μL। तुरंत इसे 30 सेकंड के लिए प्लेट मिक्सर पर मिलाएं।
    नोट: 1x फोलिन-सिओकैल्ट्यू अभिकर्मक तैयार करने के लिए, अल्ट्राप्योर पानी के साथ 2x (2N) अभिकर्मक 1: 1 को पतला करें। उपयोग के उसी दिन 1x फोलिन-सिओकैल्टू अभिकर्मक तैयार करें क्योंकि पतला अभिकर्मक अस्थिर है।
  5. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से माइक्रोप्लेट को कवर करें और इसे 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  6. एलिसा प्लेट स्पेक्ट्रोमीटर में 660 एनएम पर नमूनों के अवशोषण को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: रंग को 650 एनएम और 750 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पर मापा जा सकता है।
  7. मानक रिक्त नमूनों के 660 एनएम अवशोषण मूल्य का औसत निकालें और इसे मानक और अज्ञात नमूनों के अन्य 660 एनएम मूल्यों से घटाएं।
    1. एलिसा प्लेट स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अवशोषण को एंडपॉइंट मोड में 10 सेकंड के लिए कम झटकों के साथ मापें।
  8. प्रत्येक अज्ञात नमूने की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें।
  9. प्रोटीन की गणना के लिए, प्रत्येक मानक बीएसए वक्र के एक्स अक्ष पर मिलीग्राम / एमएल में सांद्रता के खिलाफ वाई अक्ष पर अवशोषण के मूल्यों का उपयोग करके एक लाइनल रिग्रेशन ग्राफ से एकाग्रता निर्धारित करें।
    1. प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए रैखिक प्रतिगमन और आर मान का समीकरण प्राप्त करें।
      नोट: परिणाम एएम के मिलीग्राम (μg / mL प्रोटीन / mg AM ऊतक) के सापेक्ष कुल प्रोटीन के सामान्यीकृत सापेक्ष एकाग्रता मूल्यों के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

3. एएमई में लुमिकन का परिमाणीकरण

नोट: लुमिकन की एकाग्रता को विभिन्न भंडारण स्थितियों और समय अवधि में संग्रहीत एएमई में मापा जाना चाहिए। सैंडविच एलिसा का उपयोग करके लुमिकन की मात्रा निर्धारित करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। यह अनुशंसा की जाती है कि सभी मानकों और नमूनों को डुप्लिकेट में जांचा जाए।

  1. मानव लुमिकन कैप्चर एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में नियोजित एकाग्रता के लिए पतला करें।
    नोट: कैप्चर एंटीबॉडी शीशी में 120 μg एंटीबॉडी होता है। पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ पुनर्गठन के बाद, कैप्चर एंटीबॉडी को 2 μg / mL के कामकाजी समाधान पर पतला करें।
    1. 96-वेल माइक्रोप्लेट में पतला कैप्चर एंटीबॉडी के प्रति कुएं पर तुरंत 100 μL पिपेट करें। प्लेट को संलग्न करें और इसे आरटी पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से एस्पिरेट करें और इसे 300 μL वॉश बफर के साथ पाइप करके धोएं: पीबीएस में 0.05% पॉलीऑक्सीथिलीन सोर्बिटन मोनोलॉरेट 20, पीएच 7.2-7.4 ( सामग्री की तालिका देखें) मल्टी-चैनल पिपेटर का उपयोग करके। तीन बार दोहराएं।
    नोट: अंतिम धोने के बाद, प्लेट को उल्टा करके किसी भी शेष वॉश बफर को हटा दें और धीरे से इसे पेपर तौलिए के खिलाफ टैप करें।
  3. अभिकर्मक डिल्युएंट के 300 μL जोड़कर प्लेटों को ब्लॉक करें: पीबीएस में 1% बीएसए, पीएच 7.2-7.4, 0.2 μm फ़िल्टर किया गया ( सामग्री की तालिका देखें)। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  4. चरण 2 दोहराएँ।
  5. 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 और 8,000 pg/ mL की अंतिम सांद्रता के लिए 0-8,000 pg/mL से दो गुना सीरियल डाइल्यूशन का उपयोग करके 96-वेल माइक्रोप्लेट में एक मानक वक्र तैयार करें। एलिसा लुमिकन किट में 75 एनजी का पुनः संयोजक लुमिकन मानक होता है (सामग्री की तालिका देखें)।
  6. कैप्चर एंटीबॉडी-लेपित 96-वेल माइक्रोप्लेट में 100 μL नमूने और मानक वक्र जोड़ें।
  7. माइक्रोप्लेट को कवर करें और 2-3 आरपीएम के बीच वेग बनाए रखते हुए एक कॉम्पैक्ट रॉकर में कम आंदोलन के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. चरण 2 दोहराएँ।
  9. प्रत्येक कुएं में बायोटिनिलेटेड-डिटेक्शन एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL जोड़ें। प्रकाश से कवर करें और आरटी पर 2 घंटे तक एक कॉम्पैक्ट रॉकर में कम आंदोलन के साथ 2-3 आरपीएम के बीच वेग बनाए रखें।
    नोट: बायोटिनिलेटेड-डिटेक्शन एंटीबॉडी शीशी में एंटीबॉडी का 24 μg होता है। 1.0 एमएल अभिकर्मक डिल्युएंट के साथ पुनर्गठन के बाद, 400 एनजी / एमएल के कामकाजी समाधान पर बायोटिनाइलेटेड-डिटेक्शन एंटीबॉडी को पतला करें।
  10. चरण 2 दोहराएँ।
  11. प्रत्येक कुएं में स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी, सामग्री की तालिका देखें) के काम करने के कमजोर पड़ने का 100 μL जोड़ें। माइक्रोप्लेट को प्रकाश से कवर करें और आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रतिक्रियाशील स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी 40 गुना केंद्रित था। स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी का कार्य समाधान 1x अभिकर्मक मेहनती के साथ बनाया गया था।
    नोट: प्लेट को सीधे प्रकाश में रखने से बचें।
  12. चरण 2 दोहराएँ।
  13. अंत में, प्रत्येक कुएं में सब्सट्रेट टेट्रामिथाइलबेंजिडीन (टीएमबी, सामग्री की तालिका देखें) समाधान के 100 μL जोड़ें।
    नोट: किट में प्रदान किए गए स्थिर हाइड्रोजन पेरोक्साइड 30% समाधान की समान मात्रा के साथ टीएमबी समाधान तैयार करें।
    नोट: उपयोग करने से पहले तुरंत समाधान तैयार करें और इसे कमरे के तापमान पर बनाए रखें।
  14. एक अंधेरी जगह में आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्लेट को सीधे प्रकाश में रखने से बचें। टीएमबी समाधान को न खिलाएं क्योंकि आगे धोने की आवश्यकता नहीं है।
  15. कलरिमेट्रिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1 एन एच2एसओ4 स्टॉप समाधान का 50 μL जोड़ें। पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से टैप करें।
  16. एलिसा प्लेट स्पेक्ट्रोमीटर में 450 एनएम पर सेट माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के अवशोषण को तुरंत निर्धारित करें।
  17. एलिसा प्लेट स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अवशोषण को एंडपॉइंट मोड में 10 सेकंड के लिए कम झटकों के साथ मापें।
  18. मानक रिक्त नमूनों के 450 एनएम अवशोषण मूल्य का औसत निकालें और इसे मानक और अज्ञात नमूनों के अन्य 450 एनएम मूल्यों से घटाएं।
  19. प्रत्येक अज्ञात नमूने की लुमिकन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें।
  20. लुमिकन एकाग्रता की गणना के लिए, प्रत्येक मानक लुमिकन वक्र के एक्स अक्ष पर पीजी / एमएल में सांद्रता के खिलाफ वाई अक्ष पर अवशोषण के मूल्यों का उपयोग करके एक लाइनल प्रतिगमन ग्राफ बनाएं।
    1. लुमिकन एकाग्रता की गणना करने के लिए रैखिक प्रतिगमन और आर मान का समीकरण प्राप्त करें।
      नोट: निकाले गए ऊतक के मिलीग्राम के संबंध में लुमिकन की एकाग्रता सामान्यीकृत की गई थी। परिणाम लुमिकन से मिलीग्राम एएम (एनजी / एमएल लुमिकन / मिलीग्राम एएम ऊतक) के सामान्यीकृत सापेक्ष एकाग्रता मूल्यों के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

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Representative Results

परिणाम मानक विचलन (एसडी) के औसत मूल्य ± रूप में रिपोर्ट किए जाते हैं। छात्र के टी-परीक्षण और विचरण का विश्लेषण (एनोवा) किया गया था। 0.05 < पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

एएमई में कुल प्रोटीन की मात्रा समय और भंडारण की स्थिति से प्रभावित थी। बेसल प्रोटीन एकाग्रता सभी एएमई के बीच समान थी; मूल्यांकन किए गए नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के बिना कुल प्रोटीन की सीमा 2.7 ± 0.3 μg / mL थी। हालांकि, जब नमूने 12, 20 और 32 दिनों के लिए संग्रहीत किए गए थे, तो बेसल एकाग्रता के संबंध में प्रोटीन एकाग्रता में परिवर्तनशीलता देखी गई थी। दिलचस्प बात यह है कि भंडारण के हर समय आरटी के संबंध में एएमई में प्रोटीन एकाग्रता 4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ी है।

इसी तरह, जब भंडारण समय के बीच प्रोटीन एकाग्रता की तुलना की गई, तो यह 12, 20 और 32 दिनों के बाद बदल गया। आरटी स्थिति (चित्रा 2) की तुलना में 4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस पर 32 और 20 दिनों के एएमई में एक महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) पाया गया, यह सुझाव देते हुए कि प्राप्त विभिन्न एएमई में प्रोटीन संरक्षण के लिए तापमान महत्वपूर्ण है।

Figure 2
चित्रा 2: समय और भंडारण तापमान से प्रभावित एएमई में कुल प्रोटीन एकाग्रता। एएमई पर प्रोटीन निष्कर्षण की एकाग्रता तापमान और समय भंडारण स्थितियों से पहले और बाद में निर्धारित की गई थी। मूल्यांकन किए गए भंडारण समय तीन अलग-अलग तापमान स्थितियों (आरटी डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में 6 दिन (काले त्रिकोण), 12 दिन (गुलाबी त्रिकोण), 20 दिन (बैंगनी वर्ग), और 32 दिन (भूरे रंग के सर्कल) थे। बेसल प्रोटीन एकाग्रता सभी एएमई के बीच समान थी। विभिन्न तापमान स्थितियों में बेसल प्रोटीन एकाग्रता के संबंध में 20 और 32 दिनों के एएमई में प्रोटीन एकाग्रता में महत्वपूर्ण अंतर था। प्रत्येक स्थिति में n = 3 डेटा को प्रोटीन के औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है ± एसई * पी < 0.05 (एस 1 32 दिन बनाम एस 1 20, 12, और 6 दिन 4 डिग्री सेल्सियस पर); (एस 1 32 दिन बनाम एस 1 20, 12, और 6 दिन -20 डिग्री सेल्सियस पर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लुमिकन एकाग्रता भंडारण समय और तापमान की स्थिति से प्रभावित थी। 12 दिनों के भंडारण की तुलना में 6, 20 और 32 दिनों के लिए संग्रहीत एएमई में लुमिकन की कम एकाग्रता पाई गई। गौरतलब है कि 12 दिनों के एएमई में 20 और 32 दिनों के भंडारण (पी < 0.05) की तुलना में लुमिकन की उच्च सांद्रता थी।

जब एएमई में लुमिकन एकाग्रता की तुलना भंडारण तापमान के बीच की गई थी, तो 12 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर लुमिकन की उच्च सांद्रता पाई गई थी (चित्रा 3)। दिलचस्प बात यह है कि 4 डिग्री सेल्सियस की तुलना में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 12 दिनों के एएमई में लुमिकन की एक उच्च (पी < 0.05) एकाग्रता भी पाई गई थी।

इससे पता चलता है कि लुमिकन की एकाग्रता तापमान की स्थिति और भंडारण समय से प्रभावित होती है, यह सुझाव देते हुए कि लुमिकन की उच्चतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उपयुक्त भंडारण समय और तापमान -20 डिग्री सेल्सियस पर 12 दिन है।

Figure 3
चित्रा 3: समय और भंडारण तापमान से प्रभावित एएमई में कुल लुमिकन एकाग्रता। लुमिकन एकाग्रता भंडारण समय और तापमान की स्थिति से प्रभावित थी। एएमई में लुमिकन की एकाग्रता तापमान और समय भंडारण स्थितियों से पहले और बाद में निर्धारित की गई थी। मूल्यांकन किए गए भंडारण समय तीन अलग-अलग तापमान स्थितियों (आरटी डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में 6 दिन (काले त्रिकोण), 12 दिन (गुलाबी त्रिकोण), 20 दिन (बैंगनी वर्ग), और 32 दिन (भूरे रंग के सर्कल) थे। 12 दिनों के एएमई में लुमिकन -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस की तापमान स्थितियों में 32, 20 और 6 दिनों के एएमई की तुलना में काफी अधिक था <। पी < 0.001 (एस 1 12 दिन बनाम एस 1 32, 20 और 6 दिन -20 डिग्री सेल्सियस पर)। एएमई में लुमिकन की उच्चतम सांद्रता 12 दिनों में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत थी+ + पी < 0.01 (एस 1 12 दिन 4 डिग्री सेल्सियस बनाम एस 1 12 दिन -20 डिग्री सेल्सियस)। भंडारण तापमान की स्थिति (एनएस) की तुलना में 32 और 20 दिनों के एएमई में लुमिकन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। प्रत्येक स्थिति (एन = 3) में, डेटा को प्रोटीन के एनजी / एमएल के औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है। डेटा को ऊतक के मिलीग्राम के संबंध में सामान्यीकृत किया गया था ± एसई (एनएस) सांख्यिकीय महत्व नहीं था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, एएमई में लुमिकन की उपस्थिति और विभिन्न भंडारण स्थितियों के तहत इसकी स्थिरता के साथ इसका सीधा संबंध का विश्लेषण किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि जब एएमई में कुल प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी, तो भंडारण के बाद प्रोटीन एकाग्रता बढ़ गई थी। साक्ष्य तीन तंत्रों का सुझाव देते हैं जो जमे हुए भंडारण में प्रोटीन एकाग्रता को बदल सकते हैं: ठंडा विकृतीकरण, विलेय की जमी हुई एकाग्रता, और प्रोटीन संरचना का बर्फ-प्रेरित आंशिक प्रकटीकरण19। ठंड प्रक्रिया नमूने में तरल चरण के क्रिस्टलीकरण के कारण भंडारण नमूनों पर प्रोटीन एकाग्रता को प्रभावित कर सकती है। परिणाम बताते हैं कि यह फ्रीजर में भंडारण समय से प्रभावित एकाग्रता को फ्रीज करने की प्रक्रिया के रूप में हो सकता है। भंडारण के लंबे समय (32 और 20 दिन) और सबसे ठंडे तापमान (4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस) पर प्रोटीन की उच्च सांद्रता देखी गई। हालांकि, प्रोटीन की उच्चतम सांद्रता वाली अवधि में लुमिकन की उच्चतम एकाग्रता नहीं थी; इससे पता चलता है कि लुमिकन जमे हुए तापमान और समय की स्थिति से प्रभावित हो सकता है।

परिणामों के अनुसार, 4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के 12 दिनों में लुमिकन एकाग्रता अधिक और अधिक स्थिर थी। बहरहाल, 12 दिनों की तुलना में 6 दिनों में लुमिकन की कम सांद्रता पाई गई। कुछ रिपोर्टों से पता चलता है कि जमे हुए भंडारण की स्थिति20 के बाद प्रोटीन एकाग्रता बदल सकती है। परिणाम प्रोटीन संरचना के बर्फ-प्रेरित आंशिक प्रकटीकरण नामक एक थर्मोडायनामिक तंत्र के कारण हो सकते हैं, जो नमूनों के जमने के दौरान होता है। जलीय घोल में पानी के साथ प्रोटीन की बातचीत अन्य अणुओं के साथ उनकी बातचीत को कम करती है। जमे हुए परिस्थितियों में पानी की क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया प्रोटीन और कुछ कार्यात्मक क्षेत्रों को अन्य अणुओं के साथ बातचीत करने की अनुमति देतीहै। उपरोक्त तक, एक जलीय घोल में लुमिकन को फ्रीज करने के 12 दिनों के बाद, यह एलिसा परिमाणीकरण किट में मौजूद एंटीबॉडी के साथ बातचीत करने में सक्षम हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च एकाग्रता हो सकती है। दूसरी ओर, शायद छठे दिन, लुमिकन को जलीय घोल में एकांत किया जा सकता था।

नवाचारों को आगे बढ़ाने में, एएम का उपयोग एटियलजि की परवाह किए बिना कॉर्नियल री-एपिथेलियलाइजेशन के लिए अत्याधुनिक उपचार है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, एएम के लाभविशाल 21,22,23,24,25,26 हैं। कई लेखकों ने एएमई में लुमिकन के लाभों का प्रदर्शन किया है, जिससे यह विशेष रूप से विकासशील देशों के लिए एक किफायती विकल्प बन गया है 1,2,3,4,5,6,7,8,9। वर्तमान में, एएमई में लुमिकन के कई लाभ हैं; उपचार के रूप में इसका उपयोग कॉर्नियल पुन: उपकलाकरण का पक्ष लेता है और कॉर्नियल अल्सर 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 के पूर्वानुमान में सुधार करता है। एएम प्रत्यारोपण (एएमटी) विभिन्न कॉर्नियलविकारों में सुधार के लिए महान लाभ के साथ एक उपचार बन गया है। हालांकि, कॉर्नियल ऊतक के कुछ पुराने स्नेह हैं, जैसे कि लगातार उपकला दोष (पीईडी) और लिम्बल स्टेम सेल की कमी (एलईएससीडी), जिन्हें जैविक कारकों की उपस्थिति के निरंतर उपचार और रखरखाव की आवश्यकता होती है जो कॉर्नियल मरम्मत में मदद करते हैं21,24। वर्तमान में, कोई सहायक उपचार नहीं हैं जो कॉर्नियल सतह पर एएमटी द्वारा जारी कारकों के दीर्घकालिक रखरखाव की अनुमति देते हैं। हालांकि, रोगी सुरक्षा के लिए एएमटी के निरंतर प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं की जा सकतीहै। इस कारण से, ऐसे विकल्प विकसित करना आवश्यक है जो एएमटी के कार्यों को सहायता करने की अनुमति देते हैं और लंबे समय तक कॉर्नियल ऊतक जैसे लुमिकन में एएम द्वारा जारी कारकों की उपस्थिति को बनाए रखने में मदद करते हैं, कॉर्निया27 की लगातार समस्याओं के उपचार का पक्ष लेने का इरादा रखते हैं।

लुमिकन एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटीफिब्रोटिक कार्यों के साथ एएम में मौजूद कारकों में से एक है, जिसे कॉर्नियल मरम्मत प्रक्रिया 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 में कार्य करने की सूचना मिली है . यही कारण है कि लुमिकन कॉर्नियल स्नेह के इलाज में सहायता के लिए एक अच्छा उम्मीदवार होने का सुझाव देता है; हालांकि, कॉर्नियल री-एपिथेलियलाइजेशन प्राप्त करने के लिए एएमई में लुमिकन की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त शोध की आवश्यकता है।

लुमिकन एक प्रोटिओग्लाइकन है जिसे कोलेजन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स यौगिकों के स्राव को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है; इसके अलावा, यह फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण और भड़काऊ कोशिकाओं और एंजियोजेनेसिस प्रक्रिया के मॉड्यूलेशन में शामिल है, घाव भरने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। परिणामों के अनुसार, लुमिकन को एएम ऊतक से निकाला जा सकता है। लुमिकन के चिकित्सीय अनुप्रयोग कई हैं; एएमई में लुमिकन का उपयोग ओकुलर विकारों 4,13 के लिए एक प्राप्य चिकित्सीय विकल्प की अनुमति देता है। एएमई का उपयोग करने का प्राथमिक लाभ यह है कि यह ओकुलर सतह के लिए सामयिक उपचार के रूप में एक आसान अनुप्रयोग प्रदान करता है, इसकी जलीय संरचना को देखते हुए। इसी तरह, विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोरेगुलेटरी विशेषताओं वाले अन्य प्रोटीन एएम ऊतक से निकाले गए घटकों के भीतर पाए जा सकते हैं, जो आंखों में डी-एपिथेलियलाइजिंग समस्याओं के इलाज में अधिक लाभ पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एएम और सेलुलर घटकों में मौजूद टीएसजी -6 जैसे अन्य विरोधी भड़काऊ कारकों को पहले इम्यूनोरेगुलेटरीगुणों की सूचना दी गई है। इसके द्वारा, एएमई में मौजूद लुमिकन और अन्य बाह्य मैट्रिक्स यौगिकों और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं की एक संयुक्त चिकित्सा पुन: उपकलाकरण और घाव भरने की प्रक्रिया में उपयोगी हो सकती है।

इस विधि का उद्देश्य प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक सीधी तकनीक का प्रदर्शन करना है, जो भरपूर प्रोटीन और कारकों के संयोजन के लिए उपयोगी है। इस विधि के लिए महत्वपूर्ण विचारों में से एक प्रोटीज इनहिबिटर का उपयोग है, क्योंकि यह सफल प्रोटीन निष्कर्षण के लिए मौलिक है क्योंकि एएमप्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए एंजाइमेटिक यौगिकों के भार के साथ एक ऊतक है। साक्ष्य ने बताया है कि एक जलीय घोल के साथ प्रोटीन अवरोधकों का उपयोग करने से एएम ऊतक26 में एचजीएफ जैसे अन्य कारकों का निष्कर्षण बढ़ जाता है। एएम को फ्रीज करने और ग्राउंडिंग के बाद एक महीन पाउडर का अवशोषण एएमई के इष्टतम अवशोषण के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह प्रक्रिया साइटोसोलिक और अन्य परमाणु यौगिकोंके निष्कर्षण के लिए आवश्यक संरचनाओं के ऊतक और सेलुलर व्यवधान के लिए उपयुक्त है।

इस निष्कर्षण विधि की कुछ सीमाएं यह हैं कि उपयोग की जाने वाली एएम मात्रा उच्च पैमाने पर निष्कर्षण की अनुमति नहीं दे सकती है। यह प्रोटोकॉल ऊतक की एक सीमित मात्रा से प्रोटीन निष्कर्षण की अनुमति देता है; चूंकि इस बात का कोई सबूत नहीं है कि यह विधि एक बड़े ऊतक क्षेत्र से अधिक मात्रा में प्रोटीन प्राप्त करने की अनुमति देती है। अन्य निष्कर्षण विधियों की तुलना में विचार किए जाने वाले समस्या निवारण प्रोटीज अवरोधक और इनक्यूबेशन समय की उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग करना है, क्योंकि अतिरिक्त एंजाइम प्रोटीन30 को प्रभावित कर सकते हैं और तकनीक की प्रभावकारिता को कम कर सकते हैं।

इस तकनीक का एक हिस्सा महबोद एट अल.16 द्वारा रिपोर्ट किए गए से संशोधित किया गया था, जो वर्णन करता है कि सेंट्रीफ्यूजेशन और निष्कर्षण प्रक्रिया को दोहराने से प्रोटीन निष्कर्षण बढ़ जाता है। महबोड के विपरीत, परिणामों ने सेंट्रीफ्यूजेशन के तीन चक्रों के बाद प्रोटीन एकाग्रता की रिपोर्ट नहीं की। जब कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित की गई थी, तो यह दूसरे निष्कर्षण में 80% और तीसरे निष्कर्षण में 97% तक कम हो गई। केवल एक निष्कर्षण करने से प्रसंस्करण समय कम हो जाता है और कुल प्रोटीन की मात्रा कम नहीं होती है। पूर्ववर्ती के साथ, यहां बताई गई निष्कर्षण विधि को अनुकूल परिणामों के साथ केवल एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक का उपयोग एएम में मौजूद अन्य कारकों और प्रोटीन को निकालने के लिए किया जा सकता है और आगे, जानवरों या सब्जियों जैसे अन्य स्रोतों से कारक प्राप्त करने के लिए। इसमें बुनियादी अनुसंधान या यहां तक कि योगों और उपचारों के विकास को पूरा करने के लिए प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक आवेदन भी हो सकता है।

इन परिणामों से पता चलता है कि लुमिकन को एएम से निकाला जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस तापमान स्थितियों दोनों के तहत एएमई के रूप में 12 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। एएमई के रूप में लुमिकन के चिकित्सीय प्रभावों को प्राप्त करने के लिए इसके आधे जीवन पर विचार करना महत्वपूर्ण है। कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं में एएमई लुमिकन की भूमिका निर्धारित करने और कॉर्नियल री-एपिथेलियलाइजेशन के लिए लुमिकन की आदर्श खुराक निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

निष्कर्ष में, परिणाम बताते हैं कि एएमई में लुमिकन जैसे कारक प्राप्त करना संभव है। इसी तरह, तापमान और भंडारण समय की स्थिति एएमई में मौजूद लुमिकन की एकाग्रता को प्रभावित करती है।

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Disclosures

अध्ययन को Universidad Nacional Autonoma de Mexico (अनुदान संख्या PAPIIT IN203821) और शिक्षा, विज्ञान, प्रौद्योगिकी और नवाचार मंत्रालय (अनुदान संख्या SECEI 250/2019) के अनुसंधान और तकनीकी नवाचार परियोजनाओं के लिए समर्थन कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Acknowledgments

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N H2SO4 stop solution R&D Systems DY994
100 μL micropipette Eppendorf
1000 μL micropipette Eppendorf
15 mm Petri dish Symlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) BD Becton Dickinson  305211
2 mL microcentrifuge tube Eppendorf Z606340
20 mL plastic syringe  BD Becton Dickinson  302562
20 μL micropipette Eppendorf
20-200 μL micropipette Eppendorf
5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 30119401
96-well microplate SARSTEDT 821581
Aluminum foil N/A N/A
Amniotic membrane Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank 100 mg
Balanced salt solution Bausch + Lomb BSS-403802
Beaker N/A N/A
BioRender  BioRender figures design 
Compact Rocker BioRad 970822DD Mod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		 Roche 11 873 580 001 Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2 A.Daigger & Co. , INC 22220A
Dispase II Gibco 17105-041
ELISA plate spectrometer Thermo Labsystems  35401106 Multiscan
Freezer
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc version 9 statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kit R&D Systems DY2846-05 includes human Lumican capture antibody
Incubator  Forma Scientific  3326 S/N 36481-7002
Inverted light Microscope Olympus  6A13921 to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hood Forma Scientific  14753-567 Mod.1184
Liquid nitrogen N/A N/A
Mortar N/A N/A
Multi-channel pipettor Eppendorf
Nitrogen Tank Thermo Scientific Mod. Biocan 20
Paper towels N/A N/A
Phosphate-buffered saline R&D Systems DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit Thermo Scientific 23240
Plate sealers R&D Systems DY992
Reagent diluent R&D Systems DY995 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifuge centurion scientific Ltd  15877 Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraper NEST 710001 for mechanical de-epithelialization
Scalpel knife Braun BB521 No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated  R&D Systems part 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution R&D Systems DY999
Toothed tweezers Invent Germany 6b inox 
Ultrapure water PISA
Wash buffer R&D Systems WA126 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

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References

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चिकित्सा अंक 188 लुमिकन एमनियोटिक झिल्ली भंडारण स्थिरता आंखों की बूंदें
एमनियोटिक झिल्ली से लुमिकन निष्कर्षण और इसके भंडारण तापमान का निर्धारण
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Haro-Morlett, L.,… More

Haro-Morlett, L., Magaña-Guerrero, F. S., Volante, B. B., Garfias, Y. Lumican Extraction from Amniotic Membrane and Determination of its Storage Temperature. J. Vis. Exp. (188), e64460, doi:10.3791/64460 (2022).

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