Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Eva Breuer; Bostjan Humar

doi:10.3791/64493

Methodenartikel

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

DOI:

10.3791/64493

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2. Dezember 2022

Eva Breuer¹ , Bostjan Humar¹

¹Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zurich (USZ)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Zusammenfassung

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Die partielle Hepatektomie ist weit verbreitet, um die Leberregeneration bei Mäusen zu untersuchen, aber die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Hepatozyten für nachgeschaltete Einzelzellanwendungen ist eine Herausforderung. Eine deutliche Akkumulation von Lipiden in regenerierenden Hepatozyten wird während der ersten 2 Tage der normalen Leberregeneration bei Mäusen beobachtet. Diese sogenannte transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) ist temporär, überschneidet sich aber teilweise mit der Hauptproliferationsphase. Die Dichtegradientenreinigung ist das Rückgrat der meisten existierenden Protokolle zur Isolierung von primären Hepatozyten. Da die Gradientenreinigung auf der Dichte und Größe der Zellen beruht, trennt sie nicht-steatotische von steatotischen Hepatozytenpopulationen. Daher gehen Fetthepatozyten häufig verloren, was zu nicht repräsentativen Hepatozytenfraktionen führt.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode zur in vivo Isolierung von regenerierenden Hepatozyten unabhängig von ihrem Lipidgehalt. Hepatozyten von männlichen C57BL/6-Mäusen werden 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Rest, wobei eine retrograde Perfusionstechnik mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird. Hepatozyten werden durch Kollagenase dissoziiert, um sie aus der Glisson-Kapsel freizusetzen. Nach dem Waschen und sorgfältigen Zentrifugieren können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine einfache und reproduzierbare Technik zur Isolierung einer repräsentativen Population regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Die Methode kann auch bei der Untersuchung von Fettlebererkrankungen helfen.

Einleitung

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Die Leber kann sich auch nach einem größeren Gewebeverlust selbst regenerieren. Diese einzigartige Regenerationsfähigkeit wird explizit durch das experimentelle Modell der partiellen (70%) Hepatektomie veranschaulicht, das erstmals 1931 von Higgins und Anderson an Ratten beschrieben wurde¹. In diesem Modell werden 70% der Leber operativ von Tieren entfernt, indem größere Leberlappen abgeschnitten werden. Die verbleibenden Lappen wachsen dann durch kompensatorische Hypertrophie, um die ursprüngliche Lebermasse innerhalb von etwa 1 Woche nach der Operation wiederherzustellen, wenn auch ohne Wiederherstellung der ursprüngli....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Tierschutzverordnung durchgeführt und vom Veterinäramt Zürich (Nr. 007/2017, 156/2019) genehmigt, um die menschliche Versorgung zu gewährleisten. Männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen wurden in einem 12-stündigen Tag/Nacht-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Jede Versuchsgruppe bestand aus sechs bis acht Tieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Partielle Hepatektomie bei Mäusen

Bei der Standard-Hepatektomie (70%) wi....

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Ergebnisse

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TRAS erreicht 16 Stunden nach der Hepatektomie seinen Höhepunkt und verschwindet allmählich 32-48 Stunden nach der Standardhepatektomie, bleibt aber nach der verlängerten Hepatektomie über 48 Stunden hinaus bestehen. Makroskopisch ist TRAS als blasser Teint des Leberrestes gut sichtbar (Abbildung 1F) und kann bei hepatektomierten Mäusen zwischen 16 h und 48 h nach der Operation beobachtet werden.

Die geschätzte Endausbeute beträgt 10-15 × 10 6 Hepatozyt.......

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Diskussion

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Das veröffentlichte Protokoll bietet eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Isolierung einer hohen Ausbeute an normalen und steatotischen murinen Hepatozyten für Einzelzell-Downstream-Analysen oder Massenanalysen von Zellen nach FACS-Sortierung. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Dichtegradientenreinigung besteht darin, dass der zelluläre Lipidgehalt im Wesentlichen keinen Einfluss auf die effektive Ausbeute an Hepatozyten hat. So bleibt der Anteil der steatotischen Hepatozyten erhalten und wird in nachgel.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Projektbeitrag 310030_189262).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Alexa Fluor 488 Zombie grün	BioLegend	423111	Amin-reaktiver Viabilitätsfarbstoff
Attan Isofluran ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	ACHTUNG: Beatmung
benötigt EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-Ethanol
	Sigma-Aldrich	V001229	Wasser auf 70%
fötales Rinderserum (FCS)			A5256701-Hanks
' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca²⁺, Mg²⁺, phenolrot	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	Für den Aufschluss/die Konservierung
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), ohne Ca²⁺, ohne Mg²⁺, kein Phenolrot	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	Für Perfusionspuffer
HEPES-Lösung, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Histoacryl-Gewebekleber
(Butyl-2-cyanacrylat)	B. Braun	1050052	Zur Stabilisierung der Kanülierungsstelle
Hoechst 33258 Färbefarbstofflösung	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	lyophilisierte Kollagenasen I/II
NaCl 0,9 % 500 mL Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Vet Salbe	Dechra	17033-211-38-Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung (PBS)	Gibco		A1286301-Sudan
IV – Lipidfärbung	Sigma-Aldrich
V001423-Temgesic (Buprenorphinhydrochlorid), Injektionslösung 0,3 mg/ml	Indivior Europe Ltd.	345928	Betäubungsmittel. Sicher aufbewahren.
Trypanblau, 0,4%, sterilfiltriert	Sigma-Aldrich	T8154	Für die Zellzählung
Williams' Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML-
Materials
25 mL serologische Pipette, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
mL Falcon Tubes	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV Katheter 26 G	BD Falcon	391349-Cell
Schaber, rotierende Klingenbreite 25 mm	TPP	99004-Falcon
Zellsieb 100 & Mikro; m Nylon	BD Falcon	352360-Fenestiertes
steriles	OP-Tuch	-	Wiederverwendbares Stoffmaterial
Fülldüse für Schläuche der Größe 16# (ID 3,1 mm)	Drifton	FÜLLDÜSE#16	Zum Einsetzen in die Röhrchen
Durchflusszytometrie-Röhrchen, 5 mL	BD Falcon	352008-männlicher
Luer zum Widerhaken, Schlauch ID 3,2 mm	Drifton	LM41	Verbindungsschlauch zur Spritze
Petrischale, 96 x 21 mm	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	Zum Zurückziehen des Brustbeins
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	Für Hautnaht
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligatur Gallenblase
Sonde 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm	Drifton	SC0374T	Perfusionskanüle
Ausrüstung
BD LSRFortessa Zellanalysator Durchflusszytometer	BD	-
Isis Nagetierrasierer	Aesculap	GT421-Isofluran
Station	Provet		-
Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit – Scanspeed 416	Labogene	-
-Neubauer-verbesserte Zählkammer	Marienfeld	-
-Sauerstoffkonzentrator – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettierer Turbo-Fix	TPP	94700-Shenchen
Perfusionspumpe – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x-Operationsmikroskop
– SZX9	Olympus		-
ThermoLux Wärmematte	Thermo Lux	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092	-
Wasserbad – Precision GP 02	Thermo scientific-Adjust		auf 42 ° C

Mit iges verdünnenGibco

Referenzen

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Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
Taub, R. Liver....

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Schlagwörter

Isolierung von Hepatozyten Leberregeneration Collagenase Perfusion retrograde Perfusion lipidbeladene Hepatozyten steatotische Hepatozyten Glisson Kapsel Einzelzellanwendungen

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

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