Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.
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Methodenartikel
Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die partielle Hepatektomie ist weit verbreitet, um die Leberregeneration bei Mäusen zu untersuchen, aber die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Hepatozyten für nachgeschaltete Einzelzellanwendungen ist eine Herausforderung. Eine deutliche Akkumulation von Lipiden in regenerierenden Hepatozyten wird während der ersten 2 Tage der normalen Leberregeneration bei Mäusen beobachtet. Diese sogenannte transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) ist temporär, überschneidet sich aber teilweise mit der Hauptproliferationsphase. Die Dichtegradientenreinigung ist das Rückgrat der meisten existierenden Protokolle zur Isolierung von primären Hepatozyten. Da die Gradientenreinigung auf der Dichte und Größe der Zellen beruht, trennt sie nicht-steatotische von steatotischen Hepatozytenpopulationen. Daher gehen Fetthepatozyten häufig verloren, was zu nicht repräsentativen Hepatozytenfraktionen führt.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode zur in vivo Isolierung von regenerierenden Hepatozyten unabhängig von ihrem Lipidgehalt. Hepatozyten von männlichen C57BL/6-Mäusen werden 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Rest, wobei eine retrograde Perfusionstechnik mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird. Hepatozyten werden durch Kollagenase dissoziiert, um sie aus der Glisson-Kapsel freizusetzen. Nach dem Waschen und sorgfältigen Zentrifugieren können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine einfache und reproduzierbare Technik zur Isolierung einer repräsentativen Population regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Die Methode kann auch bei der Untersuchung von Fettlebererkrankungen helfen.
Einleitung
Die Leber kann sich auch nach einem größeren Gewebeverlust selbst regenerieren. Diese einzigartige Regenerationsfähigkeit wird explizit durch das experimentelle Modell der partiellen (70%) Hepatektomie veranschaulicht, das erstmals 1931 von Higgins und Anderson an Ratten beschrieben wurde1. In diesem Modell werden 70% der Leber operativ von Tieren entfernt, indem größere Leberlappen abgeschnitten werden. Die verbleibenden Lappen wachsen dann durch kompensatorische Hypertrophie, um die ursprüngliche Lebermasse innerhalb von etwa 1 Woche nach der Operation wiederherzustellen, wenn auch ohne Wiederherstellung der ursprüngli....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Tierschutzverordnung durchgeführt und vom Veterinäramt Zürich (Nr. 007/2017, 156/2019) genehmigt, um die menschliche Versorgung zu gewährleisten. Männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen wurden in einem 12-stündigen Tag/Nacht-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Jede Versuchsgruppe bestand aus sechs bis acht Tieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Partielle Hepatektomie bei Mäusen
- Bei der Standard-Hepatektomie (70%) wi....
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Ergebnisse
TRAS erreicht 16 Stunden nach der Hepatektomie seinen Höhepunkt und verschwindet allmählich 32-48 Stunden nach der Standardhepatektomie, bleibt aber nach der verlängerten Hepatektomie über 48 Stunden hinaus bestehen. Makroskopisch ist TRAS als blasser Teint des Leberrestes gut sichtbar (Abbildung 1F) und kann bei hepatektomierten Mäusen zwischen 16 h und 48 h nach der Operation beobachtet werden.
Die geschätzte Endausbeute beträgt 10-15 × 10 6 Hepatozyt.......
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Diskussion
Das veröffentlichte Protokoll bietet eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Isolierung einer hohen Ausbeute an normalen und steatotischen murinen Hepatozyten für Einzelzell-Downstream-Analysen oder Massenanalysen von Zellen nach FACS-Sortierung. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Dichtegradientenreinigung besteht darin, dass der zelluläre Lipidgehalt im Wesentlichen keinen Einfluss auf die effektive Ausbeute an Hepatozyten hat. So bleibt der Anteil der steatotischen Hepatozyten erhalten und wird in nachgel.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Projektbeitrag 310030_189262).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie grün | BioLegend | 423111 | Amin-reaktiver Viabilitätsfarbstoff |
| Attan Isofluran ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | ACHTUNG: Beatmung |
| benötigt EDTA-Lösung | Sigma-Aldrich | E8008-100ML-Ethanol | |
| Sigma-Aldrich | V001229 | Wasser auf 70% | |
| fötales Rinderserum (FCS) | A5256701-Hanks | ||
| ' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenolrot | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | Für den Aufschluss/die Konservierung |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), ohne Ca2+, ohne Mg2+, kein Phenolrot | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | Für Perfusionspuffer |
| HEPES-Lösung, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Histoacryl-Gewebekleber | |
| (Butyl-2-cyanacrylat) | B. Braun | 1050052 | Zur Stabilisierung der Kanülierungsstelle |
| Hoechst 33258 Färbefarbstofflösung | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | lyophilisierte Kollagenasen I/II |
| NaCl 0,9 % 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Vet Salbe | Dechra | 17033-211-38-Phosphatgepufferte | |
| Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | A1286301-Sudan | |
| IV – Lipidfärbung | Sigma-Aldrich | ||
| V001423-Temgesic (Buprenorphinhydrochlorid), Injektionslösung 0,3 mg/ml | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Betäubungsmittel. Sicher aufbewahren. |
| Trypanblau, 0,4%, sterilfiltriert | Sigma-Aldrich | T8154 | Für die Zellzählung |
| Williams' Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML- | |
| Materials | |||
| 25 mL serologische Pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| mL Falcon Tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Katheter 26 G | BD Falcon | 391349-Cell | |
| Schaber, rotierende Klingenbreite 25 mm | TPP | 99004-Falcon | |
| Zellsieb 100 & Mikro; m Nylon | BD Falcon | 352360-Fenestiertes | |
| steriles | OP-Tuch | - | Wiederverwendbares Stoffmaterial |
| Fülldüse für Schläuche der Größe 16# (ID 3,1 mm) | Drifton | FÜLLDÜSE#16 | Zum Einsetzen in die Röhrchen |
| Durchflusszytometrie-Röhrchen, 5 mL | BD Falcon | 352008-männlicher | |
| Luer zum Widerhaken, Schlauch ID 3,2 mm | Drifton | LM41 | Verbindungsschlauch zur Spritze |
| Petrischale, 96 x 21 mm | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | Zum Zurückziehen des Brustbeins |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | Für Hautnaht |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligatur Gallenblase |
| Sonde 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusionskanüle |
| Ausrüstung | |||
| BD LSRFortessa Zellanalysator Durchflusszytometer | BD | - | |
| Isis Nagetierrasierer | Aesculap | GT421-Isofluran | |
| Station | Provet | - | |
| Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit – Scanspeed 416 | Labogene | - | |
| -Neubauer-verbesserte Zählkammer | Marienfeld | - | |
| -Sauerstoffkonzentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettierer Turbo-Fix | TPP | 94700-Shenchen | |
| Perfusionspumpe – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-Operationsmikroskop | |
| – SZX9 | Olympus | - | |
| ThermoLux Wärmematte | Thermo Lux | - | |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Wasserbad – Precision GP 02 | Thermo scientific-Adjust | auf 42 ° C |
Referenzen
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver....
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Nachdrucke und Genehmigungen
