Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.
Methodenartikel
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.
Das Darmepithel regeneriert sich alle 5-7 Tage und wird von der intestinalen Epithelstammzellpopulation (IESC) am Boden der Kryptenregion gesteuert. IESCs umfassen aktive Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Epithelzelltypen differenzieren, und ruhende Stammzellen, die im Falle einer Verletzung als Reservestammzellen dienen. Die Regeneration des Darmepithels wird durch die sich selbst erneuernden und differenzierenden Fähigkeiten dieser aktiven IESCs gesteuert. Darüber hinaus sind das Gleichgewicht der kryptalen Stammzellpopulation und der Erhalt der Stammzellnische essentiell für die Darmregeneration. Die Organoidkultur ist ein wichtiger und attraktiver Ansatz zur Untersuchung von Proteinen, Signalmolekülen und Umwelthinweisen, die das Überleben und die Funktionen von Stammzellen regulieren. Dieses Modell ist kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und manipulierbarer als Tiermodelle. Organoide ahmen auch die Mikroumgebung des Gewebes nach und sorgen für In-vivo-Relevanz . Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von Kolonkrypten, die Einbettung dieser isolierten Kryptzellen in ein dreidimensionales Gelmatrixsystem und die Kultivierung von Kryptenzellen zur Bildung von Kolonorganoiden, die zur Selbstorganisation, Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind. Dieses Modell ermöglicht es, die Umwelt zu manipulieren - bestimmte Proteine wie Claudin-7 auszuschalten, Signalwege zu aktivieren / deaktivieren usw. - um zu untersuchen, wie diese Effekte die Funktion von Kolonstammzellen beeinflussen. Insbesondere wurde die Rolle des Tight-Junction-Proteins Claudin-7 bei der Funktion von Kolonstammzellen untersucht. Claudin-7 ist wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase und Barrierefunktion und -integrität. Knockout von Claudin-7 bei Mäusen induziert einen entzündlichen Darmerkrankungs-ähnlichen Phänotyp, der Darmentzündungen, Epithelhyperplasie, Gewichtsverlust, Schleimhautgeschwüre, Epithelzellablösung und Adenome aufweist. Zuvor wurde berichtet, dass Claudin-7 für intestinale epitheliale Stammzellfunktionen im Dünndarm benötigt wird. In diesem Protokoll wird ein Kolon-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Rolle von Claudin-7 im Dickdarm zu untersuchen.
Die intestinale Organoidkultur ist ein dreidimensionales (3D) ex vivo System, in dem Stammzellen aus den Darmkrypten des Primärgewebes isoliert und zu einer Gelmatrix 1,2 plattiert werden. Diese Stammzellen sind zur Selbsterneuerung, Selbstorganisation und Organfunktionalität fähig2. Organoide ahmen die Mikroumgebung des Gewebes nach und sind In-vivo-Modellen ähnlicher als zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle, obwohl sie weniger manipulierbar sind als Zellen 3,4. Dieses Modell beseitigt Hin....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University (ECU) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und der ECU zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Induzierbare, Darm-spezifische Claudin-7-Knockout-Mäuse wurden durch Kreuzung von C57BL6-Claudin-7-flox-transgenen Mäusen mit Villin-CreERT2-Mäusenerzeugt 19. Männliche und weibliche Mäuse im Alter von 3 Monaten wurden in dieser Studie verwendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes/der Ausrüstung
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Um die regulatorischen Wirkungen von Claudin-7 auf Dickdarmstammzellen zu untersuchen, wurden Kolonkrypten aus murinem Dickdarmgewebe isoliert, wie oben beschrieben und in Abbildung 1A gezeigt. Sobald die Krypten aus dem primären Gewebe isoliert waren, wurden sie in einer 3D-Matrix in einer 96-Well-Platte plattiert, um 11 Tage lang zu wachsen (Abbildung 1). Normale gesunde Krypten schließen das Lumen und werden am 2. Tag zu Sphäroiden und beginnen schließlich et.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Organoidkultur ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Stammzellfunktion, der Darmphysiologie, der Arzneimittelforschung, der menschlichen Darmerkrankungen sowie der Regeneration und Reparatur von Geweben 7,8,9,10,11,26. Obwohl es viele Vorteile hat, kann es schwierig sein, es zu etablieren. Vorsicht ist bei al.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Diese Studie wurde vom NIH DK103166 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,09 Kubikfuß platzsparender Vakuum-Exsikkator | United States Plastic Corp | 78564 | Anästhesiekammer |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL konische Zentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 14190-144 | |
| 2-Methylbutan | Sigma | 277258 | |
| 4% Paraformaldehyd | ThermoFisher | J61899. | |
| 4-Hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| konische Zentrifugenröhrchen 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 & micro; m Nylon-Zellsieb | Corning | 352350 | |
| 96-Well-Kulturplatte | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Ergänzung (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Rinderserumalbumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 Anti-Maus-Kaninchen-Antikörper | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Deckglas (24 x 50-1,5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Kryoformen | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Typ 2 | R& D Systems | 3533-005-02 | Gelmatrix |
| Cy3 Anti-Kaninchen-Antikörper | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewarflasche | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose mit L-Glutamin | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluor-Gel II mit DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycin | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Pufferlösung | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isofluran | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Medien | Harvard Medical School Gastrointestinale Organoid-Ableitung und Kulturkern | N/A | |
| Maus-Chirurgie-Kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Maus EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Ergänzung (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimale Schnitttemperatur (OCT) Mischung | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Natriumcitrat | Fisher Scientific | S-279 | |
| Saccharose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vakuumfilter (0,22 &Mikro; m; | Corning | 430769 | |
| Y-27632 Dihydrochlorid | Tocris Bioscience | 1254 |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragen