Methodenartikel

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

3.4K Ansichten

DOI:

10.3791/64534

11. Oktober 2022

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Zusammenfassung

Das Darmepithel regeneriert sich alle 5-7 Tage und wird von der intestinalen Epithelstammzellpopulation (IESC) am Boden der Kryptenregion gesteuert. IESCs umfassen aktive Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Epithelzelltypen differenzieren, und ruhende Stammzellen, die im Falle einer Verletzung als Reservestammzellen dienen. Die Regeneration des Darmepithels wird durch die sich selbst erneuernden und differenzierenden Fähigkeiten dieser aktiven IESCs gesteuert. Darüber hinaus sind das Gleichgewicht der kryptalen Stammzellpopulation und der Erhalt der Stammzellnische essentiell für die Darmregeneration. Die Organoidkultur ist ein wichtiger und attraktiver Ansatz zur Untersuchung von Proteinen, Signalmolekülen und Umwelthinweisen, die das Überleben und die Funktionen von Stammzellen regulieren. Dieses Modell ist kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und manipulierbarer als Tiermodelle. Organoide ahmen auch die Mikroumgebung des Gewebes nach und sorgen für In-vivo-Relevanz . Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von Kolonkrypten, die Einbettung dieser isolierten Kryptzellen in ein dreidimensionales Gelmatrixsystem und die Kultivierung von Kryptenzellen zur Bildung von Kolonorganoiden, die zur Selbstorganisation, Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind. Dieses Modell ermöglicht es, die Umwelt zu manipulieren - bestimmte Proteine wie Claudin-7 auszuschalten, Signalwege zu aktivieren / deaktivieren usw. - um zu untersuchen, wie diese Effekte die Funktion von Kolonstammzellen beeinflussen. Insbesondere wurde die Rolle des Tight-Junction-Proteins Claudin-7 bei der Funktion von Kolonstammzellen untersucht. Claudin-7 ist wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase und Barrierefunktion und -integrität. Knockout von Claudin-7 bei Mäusen induziert einen entzündlichen Darmerkrankungs-ähnlichen Phänotyp, der Darmentzündungen, Epithelhyperplasie, Gewichtsverlust, Schleimhautgeschwüre, Epithelzellablösung und Adenome aufweist. Zuvor wurde berichtet, dass Claudin-7 für intestinale epitheliale Stammzellfunktionen im Dünndarm benötigt wird. In diesem Protokoll wird ein Kolon-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Rolle von Claudin-7 im Dickdarm zu untersuchen.

Einleitung

Die intestinale Organoidkultur ist ein dreidimensionales (3D) ex vivo System, in dem Stammzellen aus den Darmkrypten des Primärgewebes isoliert und zu einer Gelmatrix 1,2 plattiert werden. Diese Stammzellen sind zur Selbsterneuerung, Selbstorganisation und Organfunktionalität fähig2. Organoide ahmen die Mikroumgebung des Gewebes nach und sind In-vivo-Modellen ähnlicher als zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle, obwohl sie weniger manipulierbar sind als Zellen 3,4. Dieses Modell beseitigt Hin....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University (ECU) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und der ECU zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Induzierbare, Darm-spezifische Claudin-7-Knockout-Mäuse wurden durch Kreuzung von C57BL6-Claudin-7-flox-transgenen Mäusen mit Villin-CreERT2-Mäusenerzeugt 19. Männliche und weibliche Mäuse im Alter von 3 Monaten wurden in dieser Studie verwendet.

1. Vorbereitung des Reagenzes/der Ausrüstung

  1. Kühlen Sie die folgenden Reagenzi....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Um die regulatorischen Wirkungen von Claudin-7 auf Dickdarmstammzellen zu untersuchen, wurden Kolonkrypten aus murinem Dickdarmgewebe isoliert, wie oben beschrieben und in Abbildung 1A gezeigt. Sobald die Krypten aus dem primären Gewebe isoliert waren, wurden sie in einer 3D-Matrix in einer 96-Well-Platte plattiert, um 11 Tage lang zu wachsen (Abbildung 1). Normale gesunde Krypten schließen das Lumen und werden am 2. Tag zu Sphäroiden und beginnen schließlich et.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Organoidkultur ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Stammzellfunktion, der Darmphysiologie, der Arzneimittelforschung, der menschlichen Darmerkrankungen sowie der Regeneration und Reparatur von Geweben 7,8,9,10,11,26. Obwohl es viele Vorteile hat, kann es schwierig sein, es zu etablieren. Vorsicht ist bei al.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom NIH DK103166 finanziert.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,09 Kubikfuß platzsparender Vakuum-Exsikkator United States Plastic Corp78564Anästhesiekammer
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9261
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenThermoFisher69715
15 mL konische ZentrifugenröhrchenFisher Scientific14-959-53A
1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungGibco14190-144
2-MethylbutanSigma277258
4% ParaformaldehydThermoFisherJ61899.
4-Hydroxytamoxifen (4OH-TAM)Sigma579002
konische Zentrifugenröhrchen 50 mLFisher Scientific14-432-22
70 & micro; m Nylon-ZellsiebCorning352350
96-Well-KulturplatteGreiner Bio-One655180
B-27 Ergänzung (50x)Gibco12587-010
RinderserumalbuminFisher ScientificBP1605-100
Claudin-7 Anti-Maus-Kaninchen-AntikörperImmuno-Biological Laboratories 18875
Deckglas (24 x 50-1,5)Fisher Scientific12544E
Kryoformenvwr25608-916
Cultrex RCF BME, Typ 2R& D Systems3533-005-02Gelmatrix
Cy3 Anti-Kaninchen-AntikörperJackson Immunoresearch111-165-003
DewarflascheThomas Scientific1173F61
DMEM High Glucose mit L-GlutaminATCC30-2002
EVOS FLoid Imaging SystemThermoFisher4477136
Fluor-Gel II mit DAPIElectron Microscopy Sciences17985-50
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
GlycinJT Baker4059-02
HEPES (1 M) PufferlösungGibco15630-080
HoechstThermoFisher62249
In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods, TMR RedRoche12156792910
IsofluranPivetal07-893-8440
L-WRN MedienHarvard Medical School Gastrointestinale Organoid-Ableitung und KulturkernN/A
Maus-Chirurgie-KitKent Scientific CorporationINSMOUSEKIT
Maus EGFPeproTech315-09-500UG
N2 Ergänzung (100x)Gibco17502-048
Optimale Schnitttemperatur (OCT) Mischung Agar ScientificAGR1180
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Sequenza Rackvwr10129-584
NatriumcitratFisher ScientificS-279
SaccharoseSigmaS9378
Triton X-100SigmaX100
Vakuumfilter (0,22 &Mikro; m; Corning430769
Y-27632 DihydrochloridTocris Bioscience1254
, AK

Referenzen

  1. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of e....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Kolon Organoidkulturintestinale StammzellenIsolierung von KolonkryptenClaudin 7 KnockoutStammzellnischeepitheliale RegenerationImmunfluoreszenzf rbungEinbettung in GelmatrixApoptose Assay

Verwandte Artikel