Digitale Genschaltkreise auf Basis von CRISPR-Cas-Systemen und Anti-CRISPR-Proteinen

Zusammenfassung

CRISPR-Cas-Systeme und Anti-CRISPR-Proteine wurden in das Schema der Booleschen Gates in Saccharomyces cerevisiae integriert. Die neuen kleinen Logikschaltkreise zeigten eine gute Leistung und vertieften das Verständnis sowohl von dCas9/dCas12a-basierten Transkriptionsfaktoren als auch von den Eigenschaften von Anti-CRISPR-Proteinen.

Zusammenfassung

Boolesche Gatter mit synthetischen Genen und digitale Schaltkreise haben ein breites Anwendungsspektrum, von der medizinischen Diagnostik bis zum Umweltschutz. Die Entdeckung der CRISPR-Cas-Systeme und ihrer natürlichen Inhibitoren – der Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) – bietet ein neues Werkzeug für den Entwurf und die Implementierung digitaler Schaltkreise für Gene in vivo . Hier beschreiben wir ein Protokoll, das der Idee des "Design-Build-Test-Learn"-Bio-Engineering-Zyklus folgt und dCas9/dCas12a zusammen mit den entsprechenden Acrs verwendet, um kleine Transkriptionsnetzwerke zu etablieren, von denen sich einige wie Boolesche Gatter verhalten, in Saccharomyces cerevisiae. Diese Ergebnisse weisen auf die Eigenschaften von dCas9/dCas12a als Transkriptionsfaktoren hin. Um eine maximale Aktivierung der Genexpression zu erreichen, muss dSpCas9 insbesondere mit einer künstlich hergestellten Gerüst-RNA interagieren, die mehrere Kopien der VP64-Aktivierungsdomäne (AD) sammelt. Im Gegensatz dazu soll dCas12a an der C-Endstation mit dem starken VP64-p65-Rta (VPR) AD fusioniert werden. Darüber hinaus wird die Aktivität beider Cas-Proteine nicht durch eine Erhöhung der Menge an sgRNA/crRNA in der Zelle erhöht. In diesem Artikel wird auch erläutert, wie boolesche Gatter basierend auf der CRISPR-dCas-Acr-Wechselwirkung erstellt werden. Die mit AcrIIA4 fusionierte Hormonbindungsdomäne des humanen Östrogenrezeptors ist der Kern eines NOT-Gates, das auf β-Östradiol reagiert, während AcrVAs, die durch den induzierbaren GAL1-Promotor synthetisiert werden, es ermöglichen, sowohl YES- als auch NOT-Gatter mit Galaktose als Input nachzuahmen. In den letztgenannten Schaltungen zeigte AcrVA5 zusammen mit dLbCas12a das beste logische Verhalten.

Einleitung

Im Jahr 2011 schlugen Forscher eine Berechnungsmethode vor und entwickelten eine entsprechende Software für den automatischen Entwurf digitaler synthetischer Genschaltkreise¹. Ein Benutzer musste die Anzahl der Eingänge (drei oder vier) angeben und die Wahrheitstabelle des Schaltkreises ausfüllen. Dies lieferte alle notwendigen Informationen, um den Schaltungsaufbau mit Hilfe von Techniken aus der Elektronik abzuleiten. Die Wahrheitstabelle wurde mit Hilfe der Karnaugh-Map-Methode² in zwei boolesche Formeln übersetzt. Jede boolesche Formel besteht aus Klauseln, die logische Operationen (Summe oder Multiplikation) zwischen (einem Teil) der Schaltungseingänge und ihren Negationen (den Literalen) beschreiben. Klauseln wiederum werden entweder summiert (OR) oder multipliziert (AND), um den Schaltungsausgang zu berechnen. Jede Schaltung kann nach einer der beiden entsprechenden Formeln realisiert werden: eine in POS-Form (Produkt der Summen) und die andere in SOP-Darstellung (Summe der Produkte). Ersteres besteht aus einer Multiplikation von Klauseln (d. h. booleschen Gattern), die eine logische Summe der Literale enthalten. Letzteres ist im Gegensatz dazu eine Summe von Sätzen, bei denen die Literale multipliziert werden.

Elektrische Schaltkreise können auf einem Steckbrett realisiert werden, indem verschiedene Gatter physisch miteinander verdrahtet werden. Der elektrische Strom ermöglicht den Austausch von Signalen zwischen den Gattern, was zur Berechnung des Ausgangs führt.

In der Biologie ist die Situation komplexer. Ein Boolesches Gatter kann als Transkriptionseinheit (TU; d.h. die Sequenz "Promotor-kodierender Region-Terminator" innerhalb eukaryotischer Zellen) realisiert werden, in der die Transkription oder Translation (oder beides) reguliert wird. So stellen mindestens zwei Arten von Molekülen eine biologische Verdrahtung her: die Proteine des Transkriptionsfaktors und die nicht-kodierenden Antisense-RNAs¹.

Ein digitaler Genschaltkreis ist in zwei oder drei Schichten von Gates organisiert, nämlich: 1) die Eingangsschicht, die aus JA- (Puffer) und NICHT-Gattern besteht und die Eingangschemikalien in Verdrahtungsmoleküle umwandelt; 2) die innere Schicht, die aus so vielen TEs besteht, wie es Klauseln in der entsprechenden booleschen Formel gibt. Wenn die Schaltung nach der SOP-Formel entworfen wird, erzeugt jede Klausel in der inneren Schicht den Schaltungsausgang (z. B. Fluoreszenz) in einer sogenannten verteilten Ausgangsarchitektur. Wenn die POS-Formel (Product of Summe) verwendet wird, ist eine 3) letzte Schicht erforderlich, die ein einzelnes multiplikatives Gate enthält, das die Verdrahtungsmoleküle aus der internen Schicht sammelt.

Insgesamt können in der synthetischen Biologie viele verschiedene Schemata für denselben Schaltkreis entworfen werden. Sie unterscheiden sich in der Anzahl und Art der TUs und der Verdrahtungsmoleküle. Um die einfachste Lösung für die Implementierung in Hefezellen zu wählen, ist jedes Schaltungsdesign mit einem Komplexitätswert S verknüpft, der definiert ist als

wobei A für die Anzahl der Aktivatoren, R für die Anzahl der Repressoren und a für die Menge der Antisense-RNA-Moleküle steht. Wenn entweder Aktivatoren oder Repressoren im Kreislauf fehlen, ist ihr Beitrag zu S gleich Null. Daher ist es schwieriger, ein Schaltungsschema im Labor (hohes S) zu realisieren, wenn es eine hohe Anzahl orthogonaler Transkriptionsfaktoren erfordert. Das bedeutet, dass neue Aktivatoren und Repressoren de novo entwickelt werden müssen, um die komplette Verdrahtung innerhalb der digitalen Schaltkreise zu realisieren. Prinzipiell können neuartige DNA-bindende Proteine unter Verwendung von Zinkfingerproteinen³ und TAL-Effektoren⁴ als Matrizen assembliert werden. Diese Option erscheint jedoch zu mühsam und zeitaufwändig; Daher sollte man sich hauptsächlich auf kleine RNAs und Translationsregulation verlassen, um komplexe Genschaltkreise zu finalisieren.

Ursprünglich wurde diese Methode entwickelt, um digitale Schaltkreise in Bakterien herzustellen. In eukaryotischen Zellen ist es in der Tat besser geeignet, anstelle von Antisense-RNAs von microRNAs (miRNAs) oder kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) zu ^sprechen5. Der RNAi-Signalweg ist jedoch in der Hefe S. cerevisiae nicht vorhanden. Daher sollte man sich für vollständig transkriptionelle Netzwerke entscheiden. Angenommen, eine Schaltung benötigt fünf Aktivatoren und fünf Repressoren; Sein Komplexitätswert wäre S = 32. Die Komplexität der Schaltkreise kann reduziert werden, indem die 10 Transkriptionsfaktoren durch ein einzelnes dCas9⁶ (Nuklease-defizientes Cas9) ersetzt werden, das zu einer Aktivierungsdomäne (AD) fusioniert ist. Wie in⁷ gezeigt, wirkt dCas9-AD als Repressor in Hefe bei der Bindung eines Promotors zwischen der TATA-Box und der TSS (Transkriptionsstartstelle) und als Aktivator, wenn es weit stromaufwärts der TATA-Box bindet. So kann man 10 Transkriptionsfaktoren durch ein einzelnes dCas9-AD-Fusionsprotein und 10 sgRNAs (Single Guide RNAs) ersetzen, was einen Gesamtkomplexitätsscore von S = 11 ergibt. Es ist schnell und einfach, zehn sgRNAs zu synthetisieren, wobei, wie bereits erwähnt, die Assemblierung von 10 Proteinen viel längere und kompliziertere Arbeit erfordern würde.

Alternativ kann man zwei orthogonale dCas-Proteine (z. B. dCas9 und dCas12a) verwenden: eines, um zu einem AD zu fusionieren, und das andere nackt oder in Kombination mit einer Repressionsdomäne. Der Komplexitätswert würde sich nur um eine Einheit erhöhen (S = 12). Daher sind CRISPR-dCas-Systeme der Schlüssel zum Aufbau sehr komplizierter digitaler Genschaltkreise in S. cerevisiae.

In dieser Arbeit wird die Effizienz von dCas9- und dCas12a-basierten Repressoren und Aktivatoren in Hefe eingehend charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sie keine große Menge an sgRNA benötigen, um ihre Aktivität zu optimieren, so dass episomale Plasmide bevorzugt vermieden werden. Darüber hinaus sind dCas9-basierte Aktivatoren weitaus effektiver, wenn eine Scaffold-RNA (scRNA) verwendet wird, die Kopien des VP64 AD rekrutiert. Im Gegensatz dazu funktioniert dCas12a gut, wenn es direkt mit dem starken VPR-AD fusioniert wird. Darüber hinaus erfordert ein synthetisch aktivierter Promotor eine variable Anzahl von Zielstellen, abhängig von der Konfiguration des Aktivators (z.B. drei bei Verwendung von dCas12a-VPR, sechs bei dCas9-VP64 und nur eine mit dCas9 und einer scRNA). Als Repressor erscheint dCas12a prägnanter, wenn es an die kodierende Region und nicht an den Promotor bindet.

Ein Nachteil ist jedoch, dass CRISPR-dCas9/dCas12a nicht direkt mit Chemikalien interagieren. Daher sind sie im Eingabe-Layer möglicherweise nicht von Nutzen. Aus diesem Grund wurden alternative Boolesche Gate-Designs untersucht, die Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) enthalten. Acrs wirken auf (d)Cas-Proteine und hemmen deren Funktion⁸. Daher sind sie ein Mittel, um die Aktivität von CRISPR-(d)Cas-Systemen zu modulieren. In dieser Arbeit werden die Wechselwirkungen zwischen Typ II Acrs und (d)Cas9 sowie Typ V Acrs und (d)Cas12a in S. cerevisiae eingehend analysiert. Da Acrs viel kleiner als Cas-Proteine sind, wurde durch Fusion der hormonbindenden Domäne des humanen Östrogenrezeptors^9-HBD(hER)- mit AcrIIA4 ein NOT-Gatter gebildet, das auf das Östrogen β-Östradiol anspricht. Außerdem wurden eine Handvoll JA- und NICHT-Gatter, die dCas12a(-AD) konstitutiv exprimierten, und AcrVAs nach Induktion mit Galaktose realisiert. Derzeit dienen diese Tore nur als Proof of Concept. Sie stellen jedoch auch den ersten Schritt zu einem tiefgreifenden Umdenken des Algorithmus dar, um das computergestützte automatische Design von synthetischen Gen-Digitalschaltkreisen in Hefezellen durchzuführen.

Protokoll

1. Design und Aufbau der sgRNA/crRNA-Expressionskassette

HINWEIS: Es gibt zwei Arten von sgRNA/crRNA-Expressionskassetten: eine sogenannte SNR52^10-besteht aus dem RNA-Polymerase-III-abhängigen SNR52-Promotor, der sgRNA/crRNA-Sequenz und dem SUP4-Terminator; eine andere - abgekürzt als RGR¹¹ - besteht aus dem RNA-Polymerase-II-abhängigen ADH1-Promotor, der RGR-Struktur (Ribozyme-guide RNA-Ribozym), die zwei Ribozyme (ein Hammerhai-Ribozym-HH und ein Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym-HDV) und die Sequenz der dazwischen liegenden sgRNA/crRNA sowie den ADH1-Terminator enthält. Die sgRNA, die Cas9-Homologe leitet, bestehen aus einer Spacer-Sequenz und der charakteristischen direkten Wiederholung¹², während die crRNA für Cas12a-Proteine die direkte Wiederholung gefolgt von der Spacer-Sequenz^13,14 umfasst (siehe ergänzende Tabelle 1 für alle in dieser Studie verwendeten DNA-Sequenzen).

1. Entwerfen Sie die Spacer-Sequenz für die Cas9/Cas12a-vermittelte transkriptionelle Aktivierung.
   1. Die bakterielle Lex-Operator-Sequenz (mit dem Namen lexOp) wird als Zielstelle^15,16 genutzt und in den CYC1-Promotor eingefügt^, der die Expression des hefeverstärkten grün fluoreszierenden Proteins (yEGFP) ^steuert17. Daher ist die Spacer-Sequenz durch das eingefügte lexOp definiert und komplementär.
2. Überprüfen Sie die Orthogonalität der Spacer-Sequenz mit dem CRISPRDIRECT-Tool¹⁸.
   1. Fügen Sie die lexOp-Sequenz flankiert von der PAM-Sequenz in das Textfeld ein, definieren Sie die PAM-Sequenz als NRG für dCas9 und TTTV für dCas12a und geben Sie die Spezies aus der Dropdown-Liste als Knospungshefe (Saccharomyces cerevisiae) S288C-Genom an. Klicken Sie auf Design. Stellen Sie sicher, dass es weder in der 20mer+PAM-Suche noch in der 12mer+PAM-Suche eine passende Zielseite gibt.
3. Konstruieren Sie die sgRNA/crRNA-Expressionskassette.
   1. Verwenden Sie die Touchdown-PCR, um die DNA-Sequenzen biologischer Standardteile wie Promotoren, kodierende Sequenzen und Terminatoren zu amplifizieren.
      1. Es wird eine Reaktionsmischung hergestellt, die Folgendes enthält: 20-40 ng DNA-Template, 1 μl 10 μM Vorwärtsprimer (d. h. ot25, sgRNA/crRNA-Expressionsplasmidkonstruktion), 1 μl 10 μM Reverse-Primer (d. h. ot26, sgRNA/crRNA-Expressionsplasmidkonstruktion), 5 μl 2,5 mM dNTP-Mix, 0,5 μl DNA-Polymerase, 10 μl 5x DNA-Polymerase-Reaktionspuffer, und doppelt destilliertes Wasser (_ddH2O) bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μL.
         HINWEIS: In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie eine Liste der in dieser Studie verwendeten Primer.
      2. Führen Sie das Touchdown-PCR-Programm auf einem Thermocycler aus:
         Stufe 1: 98 °C für 30 s.
         Stufe 2 mit 10 Zyklen: 98 °C für 10 s, 68 °C für 20 s und 72 °C für 15 s.
         Stufe 3 mit 25 Zyklen: 98 °C für 10 s, 59 °C für 20 s und 72 °C für 15 s.
         Stufe 4: 72 °C für 2 min.
         Zum Schluss bei 4 °C halten, bis die Folgeversuche beginnen.
         HINWEIS: Die 68 °C in Stufe 2 und 59 °C in Stufe 3 hängen von den Schmelztemperaturen sowohl der Vorwärts- als auch der Rückwärtsgrundierung ab und variieren je nach Grundierungspaar. Die Zeit bei 72 °C in den Stufen 2 und 3 wird durch die Länge des PCR-Produkts und die Geschwindigkeit der DNA-Polymerase bestimmt.
   2. Isolieren Sie die PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese (100 V, 30 min). Die DNA-Sequenzen werden mit einem DNA-Gel-Extraktionskit aus dem Agarose-Gel entnommen (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Für Fragmente mit einer Länge von mehr als 500 nt ist ein Agarosegel mit 0,8 %, für Fragmente zwischen 100 nt und 500 nt ein Agarosegel mit 1,5 % und für Fragmente mit einer Länge von weniger als 100 nt ein Agarosegel von 2 % erforderlich.
   3. Die TU-exprimierende sgRNA/crRNA wird in einen pRSII404/424 Shuttle-Vektor¹⁹ eingefügt, der das Ampicillin-Resistenzgen und das hefeselektierbare auxotrophe Markergen TRP1 enthält.
      1. Verdauen des Shuttle-Vektors bei 37 °C für 1 h mit den beiden Restriktionsenzymen SacI und Acc65I. Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von 5 μg des Shuttle-Vektors, den empfohlenen Mengen an Enzymen, Aufschlusspuffer (gemäß Enzymanweisung) und_ddH2Obis zu einem Gesamtvolumen von 30 μL hergestellt.
      2. Der Aufschluss des Shuttle-Vektors ist mittels Gelelektrophorese zu verifizieren (siehe Unterschritt 1.3.2). Anschließend werden die beiden Enzyme bei 65 °C für 20 min inaktiviert.
      3. Verwenden Sie die Gibson-Assemblierungsmethode 20, um die gereinigten PCR-Produkte in den aufgeschnittenen Shuttle-Vektor einzufügen, indem Sie das äquimolare DNA-Gemisch bei⁵⁰ °C für 1 h einlassen.
      4. Transformieren Sie Escherichia coli DH5α kompetente Zellen mit dem obigen Gibson-Reaktionsgemisch über die Hitzeschock-Umwandlungsmethode²¹. Die transformierten E. coli-Zellen werden auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten übertragen, die Ampicillin (0,1 g/L) enthalten. Legen Sie die Platten bei 37 °C in den Inkubator und lassen Sie die Zellen über Nacht wachsen.
      5. Wählen Sie vier Kolonien von der LB-Agarplatte und kultivieren Sie sie separat über Nacht bei 37 °C in LB-Lösung mit Ampicillin (0,1 g/L). Verwenden Sie dann das Mini-Präparationsverfahren, um Plasmide aus den E . coli-Zellen^{zu extrahieren 22}.
      6. Verwenden Sie die Primer ot18 und ot19 (siehe ergänzende Tabelle 2 für Oligosequenzen), um die eingefügte Transkriptionseinheit über die Sanger-Methode²³ zu sequenzieren und zu bestätigen.
         HINWEIS: In späteren Experimenten werden die konstruierten und bestätigten Plasmide über das PEG/LiAc-Protokoll²⁴ in das Hefegenom eingefügt.

2. Design und Aufbau der Scaffold-RNA-Expressionskassette

ANMERKUNG: Die Scaffold Guide RNA (scRNA) besteht aus der sgRNA-Sequenz und den MS2-Haarnadelstrukturen²⁵. In dieser Arbeit werden zwei Arten von MS2-Haarnadelstrukturen verwendet: Wildtyp-MS2-Haarnadel-wt und f6-MS2-Hüllprotein (MCP) Aptamer-f6.

1. Synthetisieren Sie eine scRNA-Vorlage, die in der Lage ist, verschiedene Spacer-Sequenzen aufzunehmen (z. B. pSNR52-Spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
   HINWEIS: In dieser Studie wurde die scRNA-Vorlage von einem Gensyntheseunternehmen synthetisiert (siehe Materialtabelle).
2. Entwerfen Sie geeignete Primer (siehe ergänzende Tabelle 2), um die PCR auf den erforderlichen Spacer-Sequenzen durchzuführen.
3. Befolgen Sie die Verfahren in Schritt 1.3, um eine scRNA-Expressionskassette zu konstruieren.

3. dSpCas9-Technik und Expressionsplasmidkonstruktion

1. Das Plasmid ist pTPGI_dSpCas9_VP64 (siehe Materialtabelle) zu erhalten.
2. Konstruieren Sie den Akzeptorvektor pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basierend auf dem pRSII406-Shuttle-Vektor, mittels Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode (siehe Schritt 1.3). Das Plasmid liefert einen starken konstitutiven Promotor-pGPD und einen Terminator-CYC1t.
3. Das pTPGI_dCas9_VP64 Plasmid und den neu konstruierten Akzeptorvektor (5 μg für 1 h oder 10 μg für die Nacht - siehe Schritt 1.3.3.1 als Referenz) mit XbaI und XhoI bei 37 °C verdauen. Trennen und reinigen Sie das Insertfragment und den Akzeptorvektor wie in Schritt 1.3.2 beschrieben.
4. Ligate des gereinigten Insertfragments und des Akzeptorvektors mit T4-DNA-Ligase bei 16 °C für 8 h. Die Ligationslösung wird durch Zugabe von 50-100 ng des gereinigten Akzeptorvektors, gereinigten Zielfragmenten in äquimolaren Menge mit dem Akzeptorvektor, 1,5 μl T4-Puffer, 0,5 μl T4-Ligase und_ddH2Obis zu einem Gesamtvolumen von 15 μl hergestellt.
5. Führen Sie die Schritte 1.3.3.3 und 1.3.3.4 aus. Bestätigen Sie dann, dass das neu konstruierte Plasmid korrekt ist, durch Aufschluss mit XbaI und Xhol (37 °C, 1 h) und Gelelektrophorese (siehe Schritt 1.3.2).

4. dCas12a-Technik und Plasmidkonstruktion

1. Konstruieren Sie die Plasmide, die dCas12a-AD exprimieren.
   1. Synthetisieren Sie zwei Hefe-Codon-optimierte dCas12a-Proteine (denAsCas12a und dLbCas12a), flankiert von BamHI- und Xhol-Restriktionsenzymstellen.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden die beiden Hefecodon-optimierten dCas12a-Proteine von einem Gensyntheseunternehmen synthetisiert (siehe Materialtabelle).
   2. Konstruieren Sie den Akzeptorvektor pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 mittels Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode (siehe Schritt 1.3), wobei der "Promotor" entweder pGPD oder pGAL1 ist, "sp" eine kurze Zufallssequenz darstellt und "AD" entweder VPR oder VP64 ist.
   3. Jedes dCas12a-Protein wird durch Verdau mit BamHI und XhoI und Ligation mit T4-DNA-Ligase in die beiden neu konstruierten Akzeptorvektoren eingefügt (siehe Schritte 3.3 und 3.4).
2. Konstruieren Sie die Plasmide, die ein bloßes dCas12a exprimieren.
   1. Konstruieren Sie einen Akzeptorvektor für die Galaktose-induzierbaren Expressionskassetten von dCas12a als pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t unter Verwendung von Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode (siehe Schritt 1.3).
   2. Verdauen Sie die Plasmide, die die dCas12a-Proteine und den obigen Akzeptorvektor enthalten, mit BamHI und Xhol und ligieren Sie sie dann mit der T4-DNA-Ligase, um das Plasmid pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t zu erhalten (siehe Schritte 3.3 und 3.4).
   3. Das in Schritt 4.2.2 erhaltene Plasmid wird mit Acc65I und BamHI verdaut und dann pGAL1 durch pGPD mittels Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode ersetzt, um pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t zu konstruieren.

5. Anti-CRISPR-Protein-Engineering und Plasmidkonstruktion

ANMERKUNG: Drei Arten von Promotoren wurden verwendet, um die Acrs-Expression zu steuern: ein induzierbarer Promotor pGAL1, vier konstitutive Promotoren der Hefe - pGPD, pACT1, pTEF1 und pTEF2 - und ein synthetischer konstitutiver Promotor - genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. Die Plasmide, die die Sequenzen von Typ II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ und AcrIIA5 28) und Typ V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 und AcrVA5²⁹) enthalten, sind von einem Gensyntheseunternehmen zu beziehen.
2. Konstruieren Sie die Plasmide basierend auf dem pRSII403-Shuttle-Vektor, um Acrs zu exprimieren.
   1. Konstruieren Sie AcrIIA-Expressionskassetten.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Touchdown-PCR, um vier verschiedene Promotoren (d. h. pGPD, pACT1, pTEF2 und genCYC1t_pCYC1noTATA), die drei Arten von AcrIIA und zwei Terminatoren (ADH1t und CYC1t) zu amplifizieren. Erstellen Sie eine Reihe von TUs, die AcrIIAs unter verschiedenen Promotoren exprimieren, mit der Gibson-Assemblierungsmethode (siehe Schritt 1.3).
   2. Konstruieren Sie AcrVA-Expressionskassetten.
      1. Synthetisieren Sie die Akzeptorsequenz: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, wobei "sp" eine zufällige Sequenz ist, die später durch AcrVAs ersetzt wird.
         HINWEIS: In dieser Studie wurden die Akzeptorsequenzen von einem Gensyntheseunternehmen synthetisiert (Materialtabelle).
      2. Assemblieren Sie die Akzeptorvektoren pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, wobei der "Promotor" pGAL1, pTEF1 und genCYC1t_pCYC1noTATA ist. Verwenden Sie die Gibson-Montagemethode (siehe Schritt 1.3).
      3. Setzen Sie jede der drei AcrVAs in den in Schritt 5.2.2.2 beschriebenen Akzeptorvektor ein (mittels Touchdown-PCR und Gibson-Assemblierungsmethode [siehe Schritt 1.3]), um einen Satz von Plasmiden zu erstellen, die AcrVAs erzeugen.
3. Entwickeln Sie AcrIIA4 weiter, indem Sie seine Sequenz mit den Sequenzen des GS-Linkers und des HBD(hER) erweitern. Dies ermöglicht den Aufbau eines β-Östradiol-responsiven Schaltkreises.
   1. Verwenden Sie die Touchdown-PCR, um GS-HBD- und AcrIIA4-Teile separat zu erhalten (siehe Schritt 1.3.1).
   2. Geben Sie AcrIIA4, GS-HBD und den Shuttle-Vektor in die Gibson-Mischung und konstruieren Sie das komplette Plasmid mit der Gibson-Methode (siehe Schritt 1.3.3).

6. crRNA-Detektion: RT-qPCR und das Design der Primer

HINWEIS: Der crRNA-Nachweis erfolgte mittels RT-qPCR, die in drei Schritten organisiert ist.

1. Führen Sie die RNA-Extraktion und -Reinigung aus Hefezellen über ein RNA-Kit durch.
   1. Kultivieren Sie Hefezellen über Nacht in 2 ml synthetisch definiertem Vollmedium (SDC, 1 l Volumen: 20 g Glucose, 2 g AA-Mix, 6,7 g YNB, 396 mg Leucin, 79,2 mg Tryptophan, 79,2 mg Histidin und 79,2 mg Uracil) unter Verwendung einer 24-Well-Platte (240 U/min, 30 °C).
   2. Morgens wird die Zellkultur (1:100) in 2 ml frisches SDC verdünnt und die Hefezellen weitere 4 h bei 30 °C, 240 U/min gezüchtet.
   3. Ernten Sie die gesamten 2 ml der Zelllösung und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 20.238 x g . Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, da das Zellpellet klein ist.
   4. Extrahieren Sie die RNA aus Hefezellen mit einem RNA-Kit.
   5. Überprüfen Sie die RNA-Qualität.
      1. Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel vor. Mischen Sie 5 μl jeder RNA-Probe mit 1 μl DNA-Beladungsfarbstoff. Laden Sie dann die Mischung auf das Gel und lassen Sie es laufen.
      2. Stellen Sie sicher, dass zwei klare Banden bei ~4.000 nt und ~2.000 nt, die der ribosomalen RNA (25S/18S) entsprechen, auf dem Gel vorhanden sind. Eine weitere verschwommene Bande ist bei ~80 nt für tRNA zu sehen.
   6. Verwenden Sie die RNA-Proben sofort für die cDNA-Synthese oder lagern Sie sie für die spätere Verwendung bei -80 °C.
2. Reverse Transkription: Verwenden Sie die Stem-Loop-Methode 30, um den ersten cDNA-Strang zu bilden, der der crRNA (⁴⁰ nt) entspricht. Für die reverse Transkription der sgRNA (fast 100 nt) ist die Vorgehensweise die gleiche wie bei der cDNA-Synthese des Referenzgens ACT1.
   HINWEIS: Die Methode zur reversen Transkription der crRNA unterscheidet sich von der Methode, die bei der sgRNA und der ACT1-mRNA verwendet wird. Da die crRNA sehr kurz ist, wurde sie als microRNA behandelt und die microRNA-Reverse-Transkriptionsmethode (Stem-Loop-Ansatz) verwendet, um die entsprechende cDNA zu erhalten. Für die Quantifizierung der crRNA wurden zwei cDNA-Synthese-Kits (ein Stem-Loop-Kit für die crRNA und ein übliches Reverse-Transkriptions-Kit für das ACT1-Gen ) verwendet. In den beiden Kits wurde die gleiche Menge RNA verwendet (siehe Materialtabelle), um die Versuchsergebnisse vergleichbar zu machen. Der mit dem Stem-Loop-Kit verwendete Primer wurde entsprechend der Stem-Loop-Sequenz und den letzten sechs Nukleotiden am 3'-Ende der crRNA entworfen (für die Stem-Loop- und Primer-Sequenz siehe Ergänzende Tabelle 2).
   1. Stem-Loop-Methode zur reversen Transkription von crRNA
      1. Nehmen Sie die RNA-Vorlage, den Primer und die Puffer aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie auf Eis schmelzen.
      2. Genomische DNA-Entfernung: Bereiten Sie zunächst 10 μl des Reaktionsgemisches gemäß den Anweisungen des Kits vor. Die Mischung für 2 min bei 42 °C in einen Thermocycler geben. Zum Schluss auf Eis geben.
      3. Synthese des ersten cDNA-Strangs: 20 μl des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 10 μl des Gemisches aus Schritt 6.2.1.2, 1 μl Stem-Loop-Primer (2 μM Konzentration), 2 μl 10x RT-Reaktionspuffer, 2 μl reverser Transkriptionsenzymmischung (mit der reversen Transkriptase) und 5 μl RNase-freies_H2Oherstellen.
      4. Geben Sie das Reaktionsgemisch in einen Thermocycler und führen Sie das folgende Programm durch: 25 °C für 5 min, 50 °C für 15 min und 85 °C für 5 min. Verwenden Sie das Produkt sofort für die qPCR-Reaktion oder lagern Sie es bei -80 °C.
   2. sgRNA und ACT1 mRNA reverse Transkription
      1. Erste Reaktion: Bereiten Sie eine 13-μl-Mischung zu, die aus der Primermischung, der dNTP-Mischung, der RNA-Vorlage (50 pg-5 μg) und RNase-freiem Wasser (abgesehen von der RNA-Vorlage, die alle im Kit enthalten ist) besteht, gemäß den Anweisungen des Kits. Verwenden Sie 1 μg RNA-Template. Das Gemisch für 10 min bei 70 °C in einen Thermocycler geben.
      2. Zweite Reaktion (cDNA-Synthese): Bereiten Sie das Reaktionsgemisch vor, indem Sie die Reagenzien (wie in der Kit-Anleitung beschrieben) zu den 13 μl der ersten Reaktionslösung bis zu einem Endvolumen von 20 μl hinzufügen. Geben Sie das Gemisch für 15 min bei 50 °C und dann für weitere 5 min bei 85 °C in einen Thermocycler. Verwenden Sie das Produkt sofort für die qPCR-Reaktion oder lagern Sie es bei -80 °C.
3. SYBR-Kit für qPCR: Ct-Wert-Detektion
   HINWEIS: Der in der qPCR der crRNA verwendete Reverse-Primer ist fixiert, da er dem reversen Komplement der Stem-Loop-Sequenz entspricht (siehe Ergänzende Tabelle 2). Der Forward-Primer hingegen ist variabel und hängt von der Sequenz der crRNA ab. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die sgRNA und ACT1 mRNA qPCR sind bei https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ausgelegt. Zwei Primer werden ausgewählt, wenn die Differenz zwischen ihren Schmelztemperaturen nicht größer als 2 °C ist (siehe ergänzende Tabelle 2). Jede Probe wird in drei Wiederholungen gemessen.
   1. Bereiten Sie das qPCR-Reaktionsgemisch gemäß den Anweisungen des Herstellers für das SYBR-Kit vor.
   2. Stellen Sie das folgende qPCR-Programm in einem Echtzeit-PCR-Gerät ein.
      Vorinkubation: 10 min bei 95 °C.
      PCR-Phase: 15 s bei 95 °C, gefolgt von 34 s bei 55 °C. Stellen Sie den Zyklus der PCR-Phase auf 45 Mal ein. Schmelzphase: 10 s bei 95 °C, gefolgt von 60 s bei 65 °C und schließlich 1 s bei 97 °C.
   3. Berechnen Sie die relativen mRNA-Expressionswerte mit der Pfaffl-Formel³¹.

7. Immunfluoreszenz zum Nachweis von Cas-Proteinen

HINWEIS: Cas-Proteine (CasP) werden zu einem His_tag fusioniert.

1. Präparation von Hefezellen
   1. Pflücken Sie einige Hefezellen mit einer sterilen Schleife und kultivieren Sie sie über Nacht in 5 ml YPD-reichem Medium bei 240 U/min bei 30 °C. Fügen Sie morgens 500 μl der Zelllösung zu 20 ml frischem YPD hinzu und lassen Sie sie bei 240 U/min bei 30 °C wachsen, bis OD₆₀₀ 0,6 erreicht.
   2. Nehmen Sie 5 ml der Kultur und mischen Sie sie mit 500 μl 37%igem Formaldehyd. Lassen Sie die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) stehen. Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 x g für 5 Minuten.
   3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml Fixierungspuffer (0,1 M_KH2PO4, 0,5 M _MgCl2, 3,7% Formaldehyd, pH = 6,5). Lassen Sie die Zelllösung 20 Minuten lang bei RT.
   4. Zentrifugieren Sie die Zelllösung bei 1.500 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Waschpuffer (0,1 M_KH2PO4, 1,2 M Sorbitol, pH = 6,5), ergänzt mit 4 μl Beta-Mercaptoethanol und 4 μl Lysatlösung (5 mg/ml). Die Zelllösung wird für 20 min bei 37 °C in einen Inkubator gegeben.
   5. Zentrifugieren Sie die Zelllösung bei 1.500 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 1 ml PBS durch Zentrifugieren (1.500 x g für 5 Minuten).
   6. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS plus 0,05 % Tween 20 und fügen Sie 4 μl BSA-Lösung (10 mg/ml) hinzu. Lassen Sie die Zelllösung 20 Minuten lang bei RT.
2. Inkubation mit Primärantikörpern
   1. Fügen Sie dem Gemisch in Schritt 7.1.6 den Anti-His-Tag-Primärantikörper in einer Verdünnung von 1:400 hinzu. Lassen Sie die Lösung 2 Stunden lang bei RT.
   2. Das Gemisch wird in Schritt 7.2.1 bei 1.500 x g für 5 min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Fügen Sie 1 ml PBST hinzu und zentrifugieren Sie (1.500 x g) für 5 Minuten, um das Zellpellet zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Zum Schluss wird der Überstand verworfen und die Zellen in 100 μl 1x PBST suspendiert.
3. Mikroskopische Zelldetektion
   1. Montieren Sie die Zellen auf einem Objektträger. Nehmen Sie 2 μl der Zelllösung aus Schritt 7.2.2 und legen Sie sie auf einen Objektträger. Decken Sie es mit einem Deckglas ab.
   2. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Schalten Sie die Leuchtstofflampe, das Mikroskop und den Computer ein. Notieren Sie sich die Nummer der Leuchtstofflampe und öffnen Sie die Mikroskopsoftware auf dem Computer.
   3. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie das 40-fach-Objektiv und beobachten Sie die Zellen unter grünem Licht (550 nm). Bewegen Sie den groben Fokusknopf, bis die Kontur der Hefezellen erscheint. Bewegen Sie den Feinfokusknopf, um die Zellen zu fokussieren.
   4. Erkennen Sie die Zellen mit der Mikroskop-Software. Schließen Sie das Sichtfeld des Mikroskops und wechseln Sie zum Computerbildschirm. Klicken Sie auf Live, warten Sie 3-5 Sekunden und klicken Sie auf Aufnehmen , um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie das Bild.
   5. Schalten Sie den Computer, das Mikroskop und die Leuchtstoffröhre aus.

8. Datenerfassung: FACS

HINWEIS: Die grüne Fluoreszenz wird mittels Durchflusszytometrie (d. h. fluoreszenzaktivierte Zellsortierung [FACS]-Messungen) nachgewiesen. Hefezellen werden in der Regel bei 30 °C und 240 U/min kultiviert, um FACS-Experimente durchzuführen. Zellen können jedoch je nach genetischem Inhalt einige Vorsichtsmaßnahmen erfordern. Zellen, die das dCas12a-VPR-Gen (kontrolliert durch den konstitutiven Promotor GPD ) enthalten, müssen 24 h lang in der SDC-Lösung kultiviert werden. Danach werden die Zellen im Verhältnis 1:100 in frischem SDC verdünnt und weitere 12 Stunden gezüchtet, bevor die Fluoreszenzintensität gemessen wird. Zellen, die mit dem AcrIIA4-HBD(hER)- Gen modifiziert wurden, benötigen ebenfalls eine Verdünnung. Darüber hinaus muss OD₆₀₀ kontrolliert werden. Zuerst werden die Zellen über Nacht (über 14 h) in SDC wachsen gelassen. Morgens wird OD₆₀₀ gemessen. Dann wird die Kultur in SDC verdünnt, mit einer unterschiedlichen Konzentration von β-Östradiol bis hinunter zu OD₆₀₀ = 0,1. Vor den FACS-Experimenten werden die Zellen für weitere 7 Stunden so gezüchtet, dass OD₆₀₀ 0,8-1,0 erreicht. Zellen, die dCas9-VP64 oder dCas12a-VP64 exprimieren, werden in SDC für 20-24 h ohne Verdünnung und weiteres Wachstum vor den Messungen an der FACS-Maschine gezüchtet.

1. Schalten Sie das FACS-Gerät 20 Minuten vor den Messungen ein, um den Laser aufzuwärmen.
2. Bereiten Sie die Proben vor (Verdünnung): Mischen Sie 20 μL der Zellkultur mit 300 μL ddH_2O.
3. Führen Sie die FACS-Software auf dem Computer aus, der mit dem FACS-Computer verbunden ist, und erstellen Sie ein neues Experiment. Stellen Sie die Messparameter ein (d. h. FSC(SSC)-A/H/W und Histogramm).
4. Wählen Sie den Filter entsprechend den Anregungs- und Emissionswellenlängen der Proben aus. Das Zielprotein ist hier beispielsweise yEGFP, dessen Anregungs- und Emissionswellenlängen 488 nm bzw. 507 nm betragen. Wählen Sie also den FITC- oder GFP-Filter (Anregungswellenlänge: 488 nm; Emissionswellenlängen: 527/32 nm). Legen Sie die Erfassungszellennummer auf 10.000 fest.
5. Stellen Sie die FITC-Filterspannung ein, indem Sie die Intensität der fluoreszierenden Kügelchen messen. Stellen Sie sicher, dass der relative Unterschied in der Intensität der Kügelchen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Versuchen 5 % nicht überschreitet.
6. Waschen Sie die Maschine einige Sekunden lang mit ddH₂O, um eventuelle überschüssige Perlen zu entfernen.
7. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Probe. Klicken Sie auf Vorschau und warten Sie 3-5 Sekunden auf die Stabilität der Probeninjektion. Klicken Sie abschließend auf Erwerben.
8. Messen Sie die Perlen am Ende des Experiments erneut. Die Spannung ist diejenige, die bei der anfänglichen Messung der Beads verwendet wurde (siehe Schritt 8.4, 438-441 V). Prüfen Sie, ob die relative Differenz zwischen den Maßen der beiden Perlen mehr als 5 % beträgt.
9. Exportieren Sie die FACS-Daten als FCS-Dateien.
10. Analysieren Sie die FCS-Dateien mit der R Studio-Software.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Verwenden Sie das Flowcore R Bioconductor-Paket ³² in R Studio. Die FCS-Dateien wurden mit einem Skript analysiert, das in der Sprache R geschrieben wurde.

1. Öffnen Sie R Studio, und laden Sie das Skript Bdverse analysis. R , um die FCS-Dateien zu analysieren.
2. Legen Sie den Namen des Experiments (ename) und das Verzeichnis (Pfad) fest, in dem sich die FCS-Dateien befinden
   Gespeichert (dir_d) und wo die Ergebnisdateien erstellt werden (dir_r).
3. Stellen Sie den Fluoreszenzkanal ein. Zum Beispiel select_ch = "GPA-A", wenn grüne Fluoreszenz gemessen wurde.
4. Legen Sie die Anzahl der gemessenen Proben fest (s_num).
5. Legen Sie die Abmessungen jedes Punktdiagramms (sxlim, sylim) fest. Legen Sie die maximale Länge der x- und y-Achse für Balkendiagramme und Boxplots (xlimit, ylimit) fest. xlimit muss größer oder gleich s_num sein.
6. Wählen Sie die Verknüpfungsmethode, indem Sie das # aus den entsprechenden Zeilen entfernen.
   HINWEIS: morphGate ist eine automatische Gating-Methode, die vom Skript ausgeführt wird (d.h. der Bereich der Punktdiagramme, in dem die Zellen dichter sind, wird vom Programm erkannt und ausgewählt). polygonGate und rectangleGate erfordern, dass die Punktdiagramme betrachtet und entweder die Scheitelpunkte eines Polygons oder die Seite eines Rechtecks definiert werden, die die Zone umfasst, in der die meisten Zellen liegen.
7. Wählen Sie das flowSet-Objekt mit Gated aus, das der gewählten Gating-Methode entspricht. Wählen Sie die Punktdiagrammauflösung (Auflösung; sollte mindestens 256 betragen).
8. Auskommentieren flt_low <- filter_low(sp), um Messungen zu entfernen, bei denen die Fluoreszenz negativ ist. Kommentieren Sie flt_sp <- filter(flt_lw), um Ausreißer aufgrund anderer Experimente zu entfernen.
9. Drücken Sie auf Quelle und führen Sie das Skript aus. Alle Dateien, die die Ergebnisse der Analyse enthalten, werden in dir_r erstellt.

Ergebnisse

sgRNA/crRNA-Expression durch einen RNA-Polymerase-III-Typ-Promotor
Zunächst befasste sich diese Arbeit mit der Konstruktion des in Abbildung 1A gezeigten transkriptionellen Aktivierungsschaltkreises (Schaltkreis 1). Es enthielt drei grundlegende Komponenten: 1) das Gen, das für yEGFP (den Reporter) kodiert, dem eine Reihe verschiedener synthetischer Promotoren vorausging, die Zielstellen für dCas9/dCas12a-AD lieferten; 2) eine Hefecodon-optimierte Version von dCas9 oder d...

Diskussion

Das Protokoll zeigte einen möglichen vollständigen Workflow für digitale Schaltkreise mit synthetischen Genen auf, der dem "Design-Build-Test-Learn"-Zyklus (DBTL) folgt und sowohl Trocken- als auch Laborexperimente umfasst. Hier konzentrierten wir uns auf das CRISPR-Cas-System, hauptsächlich dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a und die entsprechenden Anti-CRISPR-Proteine, indem wir kleine transkriptionelle Netzwerke in S. cerevisiae entwarfen und aufbauten. Einige von ihnen ahmten Boolesche Gatter nach, die die Grund...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,1 mL PCR 8-Streifen-Röhrchen	NEST	403112
0,2 mL PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02-C
1,5 mL Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C
15 mL Zentrifugenröhrchen	BIOFIL	CFT011150
2 mL Mikroröhrchen	Axygen	MCT-200-C
50 mL Zentrifugenröhrchen	BIOFIL	CFT011500
Agarose-molekularbiologische Qualität	Invitrogen	75510-019
Ampicillin-Natriumsalz	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-Well-Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep DNA-Gel-Extraktionskit	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS& Ampere; T Forschungsperlen	BD	650621	Fluoreszierende Kügelchen
BD FACSVeres Durchflusszytometer		BD-Zentrifuge
	Eppendorf	5424
Zentrifuge Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli kompetente Zellen (Stamm DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL select Western Blotting Detektionsreagenz	GE Healthcare	RPN2235
Elektrophoresegerät	Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
Flache 8-Streifen-Kappen	NEST	406012
Gensyntheseunternehmen	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA-Synthesekit	CWBIO	CW2569M	Kit verwendet in Schritt 6.2.2.1
Lysatlösung (Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Nikon Eclipse 80i Fluoreszenzmikroskop	Nikon	-	Fluoreszenzmikroskop
Pipettenspitzen– 10 μ L	Axygen	T-300-R-S
Pipettenspitzen– 1000 μ L	Axygen	T-1000-B-R-S
– 200 μ L	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 High-Fidelity-DNApolymerase	New England Biolabs	M0491
Restriktionsenzym-Acc65I	New England Biolabs	R0599
Restriktionsenzym-BamHI	New England Biolabs	R0136
Restriktionsenzym-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
Restriktionsenzym-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96			Roche-Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN. PK2-1C	-		Der Elternstamm. Der Genotyp ist: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; TRP1-289; MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit	SparkJade	AG0502	Kit verwendet in Schritt 6.2.1.3
T100 Thermocycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202
T5 Exonuklease	New England Biolabs	M0363
Taq DNA-Ligase	New England Biolabs	M0208
Taq DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0495
TB Grün Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Grün I Farbstoff)	Takara	RR820Q
YeaStar RNA Kit	Zymo Research	R1002
β-Östradiol	Sigma-Aldrich	E8875