Expression von Transgenen im nativen Blasenurothel mittels Adenovirus-vermittelter Transduktion

Zusammenfassung

Es werden Methoden zur Erzeugung großer Mengen rekombinanter Adenoviren beschrieben, die dann zur Transduktion des nativen Nagetier-Urothels verwendet werden können, was die Expression von Transgenen oder die Herunterregulierung endogener Genprodukte ermöglicht.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass das Urothel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhre auskleidet, nicht nur eine hochresistente Barriere bildet und Informationen über seine Umgebung an das darunter liegende Gewebe überträgt, wodurch die Entleerungsfunktion und das Verhalten gefördert werden. Eine Störung der Urothelbarriere oder ihrer sensorischen/Schallkopffunktion kann zu Erkrankungen führen. Die Untersuchung dieser komplexen Ereignisse wird durch das Fehlen einfacher Strategien zur Veränderung der Gen- und Proteinexpression im Urothel behindert. Hier werden Methoden beschrieben, die es den Forschern ermöglichen, große Mengen an Adenoviren mit hohem Titer zu erzeugen, die dann verwendet werden können, um Nagetier-Urothel mit hoher Effizienz und auf relativ einfache Weise zu transduzieren. Sowohl cDNAs als auch kleine interferierende RNAs können mittels adenoviraler Transduktion exprimiert werden, und der Einfluss der Transgenexpression auf die Urothelfunktion kann 12 h bis mehrere Tage später beurteilt werden. Diese Methoden haben eine breite Anwendbarkeit auf Studien der normalen und abnormalen Urothelbiologie unter Verwendung von Maus- oder Rattentiermodellen.

Einleitung

Das Urothel ist das spezialisierte Epithel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhre^{auskleidet 1}. Es besteht aus drei Schichten: einer Schicht hochdifferenzierter und polarisierter, oft zweikerniger Schirmzellen, deren apikale Oberflächen in Urin gebadet sind; eine intermediäre Zellschicht mit einer Population von zweikernigen transitamplifizierenden Zellen, die als Reaktion auf ihren akuten Verlust zu oberflächlichen Regenschirmzellen führen können; und eine einzelne Schicht von Basalzellen, von denen eine Teilmenge als Stammzellen fungiert, die das gesamte Urothel als Reaktion auf chronische Verletzungen regenerieren können. Regenschirmzellen sind hauptsächlich für die Bildung der hochresistenten Urothelbarriere verantwortlich, zu deren Bestandteilen eine apikale Membran (reich an Cholesterin und Cerebrosiden) mit geringer Durchlässigkeit für Wasser und gelöste Stoffe sowie ein hochresistenter apikaler Verbindungskomplex (bestehend aus Tight Junctions, Adherens Junctions, Desmosomen und einem zugehörigen Actomyosin-Ring) ^gehören1 . Sowohl die apikale Oberfläche der Regenschirmzelle als auch ihr Verbindungsring dehnen sich während der Blasenfüllung aus und kehren nach dem Entleeren von 1,2,3,4,5 schnell in ihren vorgefüllten Zustand zurück. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Barrierefunktion wird angenommen, dass das Urothel auch sensorische und Wandlerfunktionen hat, die es ihm ermöglichen, Veränderungen im extrazellulären Milieu (z. B. Dehnung) zu erfassen und diese Informationen über die Freisetzung von Mediatoren (einschließlich ATP, Adenosin und Acetylcholin) an darunter liegende Gewebe zu übertragen, einschließlich suburothelialer afferenter Nervenprozesse ^6,7,8 . Neuere Beweise für diese Rolle finden sich bei Mäusen, denen die urotheliale Expression von Piezo1 und Piezo2 fehlt, was zu einer veränderten Hohlraumfunktion^{führt 9}. Darüber hinaus entwickeln Ratten, die das porenbildende Protein CLDN2 in der Regenschirmzellschicht überexprimieren, Entzündungen und Schmerzen, die denen bei Patienten mit interstitieller Zystitis entsprechen¹⁰. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine Störung der urothelialen Sensorik/Transducer- oder Barrierefunktion zu mehreren Blasenstörungen beitragen kann ^6,11.

Ein besseres Verständnis der Biologie des Urothels in normalen und Krankheitszuständen hängt von der Verfügbarkeit von Werkzeugen ab, die es den Forschern ermöglichen, die endogene Genexpression leicht herunterzuregulieren oder die Expression von Transgenen im nativen Gewebe zu ermöglichen. Während ein Ansatz zur Herunterregulierung der Genexpression darin besteht, bedingte Urothel-Knockout-Mäuse zu erzeugen, hängt dieser Ansatz von der Verfügbarkeit von Mäusen mit floxierten Allelen ab, ist arbeitsintensiv und kann Monate bis Jahre dauern, bis er abgeschlossen ist¹². Es überrascht daher nicht, dass Forscher Techniken entwickelt haben, um das Urothel zu transfizieren oder zu transduzieren, was zu Ergebnissen auf einer kürzeren Zeitskala führen kann. Veröffentlichte Methoden zur Transfektion umfassen die Verwendung von kationischen Lipiden¹³, Antisense-phosphorothioierten Oligodesoxynukleotiden¹⁴ oder Antisense-Nukleinsäuren, die an das HIV-TAT-Protein gebunden sind, das das 11-mer-Peptid¹⁵ durchdringt. Der Schwerpunkt dieses Protokolls liegt jedoch auf der Verwendung der adenoviral-vermittelten Transduktion, einer gut untersuchten Methodik, die bei der Genabgabe an ein breites Spektrum von Zellen effizient ist, in zahlreichen klinischen Studien getestet wurde und zuletzt verwendet wurde, um die cDNA, die für das COVID-19-Kapsidprotein kodiert, an Empfänger einer Variante des COVID-19-Impfstoffs zu liefern^{16, 17}. Sonstiges Für eine ausführlichere Beschreibung des Lebenszyklus des Adenovirus, der adenoviralen Vektoren und der klinischen Anwendungen von Adenoviren wird der Leser auf Referenz¹⁷ verwiesen.

Ein wichtiger Meilenstein bei der Verwendung von Adenoviren zur Transduktion des Urothels war ein Bericht von Ramesh et al., der zeigte, dass kurze Vorbehandlungen mit Detergenzien, einschließlich N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM), die die Transduktion des Urothels durch ein Adenovirus, das für β-Galactosidase¹⁸ kodiert, dramatisch verbesserten. Unter Verwendung dieser Proof-of-Principle-Studie wurde nun die adenoviral vermittelte Transduktion des Urothels verwendet, um eine Vielzahl von Proteinen zu exprimieren, darunter GTPasen der Rab-Familie, Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Myosin-Motorfragmente, porenbildende Tight-Junction-assoziierte Claudine und ADAM17 10,19,20,21,22 . Derselbe Ansatz wurde angepasst, um kleine interferierende RNAs (siRNA) zu exprimieren, deren Effekte durch die Co-Expression von siRNA-resistenten Varianten des Transgens²² gerettet wurden. Das hier beschriebene Protokoll umfasst allgemeine Methoden zur Erzeugung großer Mengen hochkonzentrierter Adenoviren, eine Voraussetzung für diese Techniken, sowie Anpassungen der Methoden von Ramesh et ^al.18, um Transgene im Urothel mit hoher Effizienz zu exprimieren.

Protokoll

Experimente zur Erzeugung von Adenoviren, für die eine BSL2-Zertifizierung erforderlich ist, wurden mit Genehmigung der Umweltgesundheits- und Sicherheitsbüros der University of Pittsburgh und des Institutional Biosafety Committee durchgeführt. Alle durchgeführten Tierversuche, einschließlich der adenoviralen Transduktion (für die eine ABSL2-Zertifizierung erforderlich ist), wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien/Vorschriften der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und des Tierschutzgesetzes sowie mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh durchgeführt. Handschuhe, Augenschutz und entsprechende Kleidung werden bei allen Eingriffen mit rekombinanten Viren getragen. Flüssige oder feste Abfälle sollten wie unten beschrieben entsorgt werden. Die Einstreu der Tiere nach der Transduktion und alle daraus resultierenden Tierkadaver sollten als biologisch gefährliche Stoffe behandelt und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

1. Präparation von Adenovirus-Vorräten mit hohem Titer

HINWEIS: Die effektive Transduktion von Nagetierblasen hängt von der Verwendung gereinigter und konzentrierter Virusvorräte ab, typischerweise 1 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ infektiöse Viruspartikel (IVP) pro μl. Dieser Teil des Protokolls konzentriert sich auf die Generierung von Adenovirus-Vorräten mit hohem Titer aus bestehenden Viruspräparaten. Alle Schritte sollten in einer Zellkulturhaube mit sterilen Reagenzien und Werkzeugen durchgeführt werden. Während die heute verwendeten verfügbaren Adenovirus-Stämme replikationsfehlerhaft sind, benötigen die meisten Institutionen eine Genehmigung für die Verwendung von Adenoviren und rekombinanter DNA. Dazu gehört häufig die Ausweisung eines Zellkulturraums als BSL2-zugelassene Einrichtung zur Herstellung und Amplifikation von Adenoviren. Einige allgemeine Überlegungen umfassen die Verwendung von Masken, Augenschutz, Handschuhen und geeigneter Kleidung in allen Phasen der Virusproduktion und -reinigung. Bei der Zentrifugation werden Sicherheitskappen empfohlen, wenn die Zentrifugenröhrchen keine dicht schließenden Kappen haben. Alle Einwegmaterialien, einschließlich potenziell kontaminierter Zentrifugen-Sicherheitskappen, Flaschen und Rotoren, werden mit einer antiviralen Lösung behandelt (siehe Materialtabelle) und dann mit Wasser oder 70% Ethanol gespült. Flüssige Abfälle werden durch Zugabe von Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10% (v/v) behandelt. Die Entsorgung dieser flüssigen Abfälle hängt von der institutionellen Politik ab. Feste Abfälle werden in der Regel in biologisch gefährlichen Abfällen entsorgt.

1. Kultur von HEK293T-Zellen
   1. Tauen Sie ein gefrorenes Fläschchen mit HEK293T-Zellen in einem Wasserbad bei 37 °C auf und verwenden Sie eine 5-ml-Pipette, um die Zellen in eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 15 cm zu überführen. Geben Sie mit einer 25-ml-Pipette langsam 20 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum und Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum (DMEM-FBS-PS) in die Schale. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Zellkultur-Inkubator, der mit 5% (v/v) CO₂ begast ist, bis sie eine Konfluenz von 80% -90% erreichen (~2 x 10⁷ Zellen).
   2. Saugen Sie das Medium mit einer Glaspipette ab, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, und spülen Sie dann die Zellen aus, indem Sie 20 ml steriles PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl und 8,9 mM Na₂HPO₄) mit einer 25-ml-Pipette in die Schale geben. Aspirieren Sie das verbrauchte PBS und geben Sie dann mit einer 5-ml-Pipette 3 ml warme (37 °C) Proteinaselösung (siehe Materialtabelle) in die Schale und inkubieren Sie die Schale im Zellkulturinkubator, bis sich die Zellen lösen (~3-4 min).
      HINWEIS: Eine effektive Proteolyse kann am besten beurteilt werden, indem die Schale langsam hin und her gekippt wird, um nach der Freisetzung von Zellen aus allen Teilen der Schale in die sich bewegende Flüssigkeit zu suchen. HEK293T-Zellen reagieren empfindlich auf eine verlängerte Proteinase-Behandlung und sterben ab, wenn sie länger als ein paar Minuten in Proteinaselösung belassen werden.
   3. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um 7 ml DMEM-FBS-PS in die Schale mit abgelösten Zellen zu überführen, und verwenden Sie dann dieselbe Pipette, um die Zellen und das Medium abzusaugen. Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen dann, indem Sie die Suspension in einer klinischen Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit bei 200 x g für 5 Minuten zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einer Glaspipette ab, die an einer Vakuumquelle befestigt ist. Verwenden Sie eine 25-ml-Pipette, um das Zellpellet in 15 ml DMEM-FBS-PS zu resuspendieren.
   4. Geben Sie 1 ml der Zellsuspension in jede der fünfzehn 15-cm-Schalen mit 19 ml DMEM-FBS-PS.
   5. Züchten Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator, bis sie 85%-90% Konfluenz erreichen (~3-4 Tage).
2. Bereiten Sie eine verdünnte Viruslösung vor
   1. Fügen Sie ~ 1,5 x 10 9 bis 3 x 10⁹ IVP eines vorhandenen Virusvorrats (5-10 IVP / Zelle) zu einem konischen 50-ml-Röhrchen hinzu, das mit 45 ml DMEM ohne FBS oder Antibiotika gefüllt ist.
      HINWEIS: Es ist möglich, eine niedrigere Konzentration des Virus (1-5 IVP / Zelle) zu verwenden. Es wird jedoch länger dauern, bis die Virusproduktion einsetzt.
3. Infizieren Sie die kultivierten Zellen mit dem Virus.
   1. Mit einer Glaspipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, wird das Medium in Schritt 1.1.5 aus den fast konfluenten Zellen abgesaugt.
   2. Verwenden Sie eine 25-ml-Pipette, um 3,0 ml verdünnte Viruslösung (hergestellt in Schritt 1.2.1) in jede Zellkulturschale zu überführen. Verwenden Sie dann eine 10-ml-Pipette, um 7,0 ml DMEM-Medium (ohne FBS oder Antibiotika) zu jeder Schale zu geben. Inkubieren Sie 60 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator und geben Sie dann 10 ml DMEM mit 20% (v/v) FBS und 2x PS in jede Schale.
      HINWEIS: Die Verwendung einer der 15 Schalen als Kontrollplatte (in der kein Virus hinzugefügt wird) erleichtert die Identifizierung von virusinduzierter Zellrundung und Zelltod in infizierten Zellen im nächsten Schritt.
   3. Inkubieren Sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator für 2-4 Tage, bis die Mehrheit von ihnen zu runden beginnt und >60% der Zellen sich gelöst haben.
      HINWEIS: Wenn Sie einen niedrigeren Titer des Virus verwenden, kann es bis zu einer Woche dauern, bis der Zelltod eintritt. Wenn der Zelltod nicht innerhalb einer Woche eintritt, ist es wahrscheinlich, dass der Vorgang mit einem höheren Titer des Virus wiederholt werden muss.
4. Rückgewinnung von Viren aus Zelllysaten
   1. Verwenden Sie einen Zellschaber, um den Boden jeder Schale abzukratzen und anhaftende Zellen in das Medium freizugeben.
   2. Sammeln Sie mit einer 25-ml-Pipette das Medium, die Zellen und die Zelltrümmer aus jeder Zellkulturschale und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Zellkulturröhrchen.
      HINWEIS: Um Ressourcen zu sparen, kann das Medium aus zwei Schalen in einem 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.
   3. Pelletieren Sie das Zellmaterial durch Zentrifugation mit einer Tischzentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit: 5 min bei Raumtemperatur bei 3.000 x g. Verwenden Sie eine Glaspipette, die an einem Vakuumgerät befestigt ist, um den Überstand abzusaugen.
   4. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette in Kombination mit einer Verreibung, um das gesamte resultierende pelletierte Material in insgesamt 7 ml sterilfiltriertem 100 mM Tris-HCl pH 7,4 mit 10 mM EDTA (Tris-EDTA-Lösung) zu konsolidieren. Übertragen Sie das gepoolte Material in ein steriles konisches 15-ml-Zellkulturröhrchen und legen Sie es auf Eis.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Virusvorbereitung unbegrenzt bei -80 °C eingefroren werden.
5. Zelllysate vorbereiten
   1. Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die verbleibenden Zellen zu zerstören und so die gebildeten Viruspartikel weiter freizusetzen. Das gepoolte Material wird in Schritt 1.4.4 eingefroren, indem das Röhrchen in flüssigen Stickstoff getaucht wird (~30-60 s). Tauen Sie die Probe schnell auf, indem Sie das Röhrchen in einen 37 °C heißen Inkubator geben. Wirbeln Sie die Probe 15 s lang und wiederholen Sie dann den schnellen Gefrier- und Auftauvorgang weitere 2x.
      HINWEIS: Die Viruslösung kann bei 37 °C in einem Wasserbad schnell aufgetaut werden, es ist jedoch Vorsicht geboten, da die Temperaturschwankungen dazu führen können, dass das Röhrchen reißt und die Viruslösung in das Wasserbad gelangt. Um dies zu verhindern, legen Sie das Röhrchen mit dem Virusüberstand in ein größeres Röhrchen, das dann in das Wasserbad gestellt wird.
   2. Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um das dreimal gefrieraufgetaute Zellmaterial in ein Superspeed-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Zentrifugieren Sie das Material im Röhrchen für 30 min bei 4 °C, Zentrifuge mit Supergeschwindigkeit bei ~18.500 x g.
   3. Die ~7 ml des virusreichen Überstands werden mit einer 10-ml-Pipette zurückgewonnen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Bewahren Sie die Probe bis zum nächsten Schritt auf Eis auf.
      HINWEIS: Erwägen Sie an dieser Stelle, ein Aliquot des ungereinigten Virusüberstands als Präambel für den Start einer neuen Virusvorbereitung (oder als Backup) aufzubewahren. Lagern Sie dieses Aliquot bei -80 °C.
6. Isolieren und reinigen Sie das Virus mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation.
   1. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten von CsCl in einem dünnwandigen, klaren 12-ml-PET-Ultrazentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) oder einem gleichwertigen Röhrchen vor. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze, die mit einer 18-g-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl-Lösung in den Boden des Röhrchens einzuführen, und verwenden Sie dann eine neue Spritze/Nadel, um sie mit 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl-Lösung zu schichten.
      HINWEIS: Das Abtropfen von Lösungen direkt auf eine bereits vorhandene Schicht führt zu einer erheblichen und unerwünschten Vermischung. Legen Sie stattdessen den abgeschrägten Teil der Nadel gegen den Rand des Röhrchens und drücken Sie dann sehr langsam auf den Spritzenkolben, wobei Sie die Position der Nadel erhöhen, während die Lösung das Röhrchen füllt.
   2. Laden Sie den ~7 ml Virusüberstand auf ähnliche Weise mit einer 10-ml-Spritze auf den Gradienten. Wenn zwischen dem Virusüberstand und der Oberseite des Röhrchens mehr als 2-3 mm Abstand ist, fügen Sie zusätzliche Tris-EDTA-Lösung hinzu, um das Röhrchen zu füllen, bis nur noch 2-3 mm Platz verbleiben.
   3. Stellen Sie ein ähnlich vorbereitetes Ausgleichsröhrchen her, das CsCl-Schichten enthält, aber den Virusüberstand durch Tris-EDTA-Lösung ersetzt.
      HINWEIS: Die beiden Röhrchen müssen identische Gewichte (und ähnliche Dichten) haben, um eine potenziell gefährliche Unwuchtbelastung in der Ultrazentrifuge zu vermeiden.
7. Isolieren Sie das Virus mit geschwindigkeitszonaler Ultrazentrifugation.
   1. Laden Sie die in den Schritten 1.6.2 bis 1.6.3 gebildeten Gradienten in die Schaufeln eines SW41-Rotors oder eines gleichwertigen Rotors. Becherverschlüsse einschrauben, Rotor in eine Ultrazentrifuge (vorgekühlt auf 4 °C) geben und 1 h bei ~150.000 x g zentrifugieren.
   2. Während der Zentrifugation wird die in Schritt 1.9.1 beschriebene Säule äquilibriert.
8. Rückgewinnung isolierter Viruspartikel
   1. Nehmen Sie am Ende des Zentrifugationsschritts die Eimer vorsichtig vom Rotor ab und entfernen Sie in einer Zellkulturhaube die Eimerkappen, entfernen Sie dann die Röhrchen und legen Sie sie in ein Gestell.
   2. Sammeln Sie das gebänderte Material, das reich an Viruspartikeln ist und an der Grenzfläche zwischen der 1,25 g/ml und 1,4 g/ml CsCl-Lösung schwimmt. Halten Sie das Röhrchen mit dem Gradienten über die untere Hälfte einer Zellkulturschale (die verschüttete Materialien auffängt) und verwenden Sie eine 1-Zoll-18-G-Nadel, die an einer 3-ml-Spritze befestigt ist, um das Röhrchen direkt unter dem gebänderten Virus vorsichtig zu punktieren. Saugen Sie das Virus langsam ab, das normalerweise in ~ 1 ml wiederhergestellt wird.
   3. Entfernen Sie die Nadel aus dem Röhrchen, was dazu führt, dass das verbleibende Material im Gefälle aus dem Röhrchen in die untere Hälfte der Zellkulturschale fließt (alle Flüssigkeiten sollten als Sondermüll behandelt werden).
   4. Übertragen Sie die Viruslösung in der Spritze in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
      HINWEIS: Wenn Sie das Virus in diesem Schritt wiederherstellen, positionieren Sie die Nadel so, dass das Lumen der Nadel nach oben zeigt, wobei die Nadelöffnung einige mm unter dem virusreichen Band liegt. Vermeiden Sie eine Kontamination durch das dünne Band des unsachgemäß zusammengesetzten Virus, das manchmal 2-3 mm über dem gebänderten Virus beobachtet wird (siehe dünner schwarzer Pfeil in Abbildung 1A).
9. Entfernen Sie CsCl durch Gelfiltration aus der Probe.
   1. Eine PD-10-Säule (vorgepackt mit Sephadex G-25M), die an einen Ständer geklemmt ist, wird mit 50 ml sterilfiltriertem 0,2 μm sterilfiltriertem PBS mit 10 % (v/v) Glycerin äquilibriert.
      HINWEIS: Der anfängliche Äquilibrierungsschritt dauert 2-3 Stunden und ist notwendig, um ein vollständiges Auswaschen der Konservierungsstoffe zu gewährleisten, die vom Hersteller zur Stabilisierung der Säule verwendet werden.
   2. Lassen Sie die Waschlösung unter die Fritte (eine Schutzscheibe aus weißem Material an der Oberseite des Säulenmediums) zurücktreten, und übertragen Sie dann die in Schritt 1.8 gesammelte gereinigte Viruslösung vorsichtig auf die Oberseite der Säule. Lassen Sie die virusreiche Lösung unter die Fritte zurücktreten und beginnen Sie dann, die Säule mit PBS-Glycerin zu füllen.
      HINWEIS: Eine Funktion der Fritte besteht darin, zu verhindern, dass die Säule trocken läuft. Infolgedessen werden kurze Verzögerungen toleriert, bevor der Säule mehr Elutionsmittel zugesetzt wird.
   3. Sammeln Sie das Eluat in 12 sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 ml pro Fraktion.
10. Bestimmen Sie die Virusausbeute.
    1. Bestimmen Sie die maximalen Virusfraktionen mittels Spektrophotometrie. Bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung jeder Fraktion in PBS vor und messen Sie den OD₂₆₀ in einem Spektralphotometer, wobei eine 1:100-Verdünnung des Puffers allein als Leerwert verwendet wird. Die Viruspartikel sollten sich im Hohlraumvolumen eluieren, beginnend bei Fraktion 6. Fassen Sie die Fraktionen zusammen, die die höchsten OD_{260-Messwerte} enthalten.
    2. Nehmen Sie eine Verdünnung der gepoolten Virusfraktionen von 1:100 vor und messen Sie den OD₂₆₀ erneut. Berechnen Sie die Endkonzentration der Viruspartikel und die Anzahl der IVP in den gepoolten Fraktionen nach folgender Formel: Viruspartikel pro ml = OD₂₆₀ × 100 (dies korrigiert den Verdünnungsfaktor) × 10¹². Eine allgemeine Schätzung ist, dass 1% der Viruspartikel IVP sind, als solche: IVP/ml = OD 260 × 100 × 10^{10 oder} IVP/μL = OD₂₆₀ × 100 ×^{10 7}.
11. Aliquotieren Sie die gepoolten Virusfraktionen (die 5 x 10,⁷ bis 1 x 10,⁸ IVP enthalten) in sterile Mikrozentrifugenröhrchen oder Kryozellen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

2. Transduktion der Nagetierblase

HINWEIS: Wenn Sie mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, wird empfohlen, die Anzahl der gleichzeitig übertragenen Tiere auf 2-4 zu begrenzen. Dies kann erreicht werden, indem die Startzeiten für jedes Tier gestaffelt werden, insbesondere während der Waschmittelbehandlung in Schritt 2.2 und dann der Virusinkubation in Schritt 2.3. Erfahrene Ermittler können bis zu sechs Tiere gleichzeitig transduzieren.

1. Katheterisierung der Blase
   1. Betäuben Sie weibliche C57Bl/6J-Mäuse (typischerweise 8-10 Wochen alt, ~20-25 g) oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten (typischerweise 2-3 Monate alt, ~250 g) mit einem Vaporizer mit aufgesetztem Nasenkonus. Kalibrieren Sie den Verdampfer so, dass er 3,0 % (v/v) Isofluran, 97 % (v/v) O 2 für Mäuse oder 4,0 % (v/v) Isofluran, 96 % (v/v) O₂ für Ratten erzeugt. Vergewissern Sie sich, dass die Tiere betäubt sind, indem Sie sicherstellen, dass sie nicht auf Zehenkneifen reagieren (normalerweise nach 1-2 Minuten).
   2. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres aufrecht, indem Sie die Tiere auf ein beheiztes Pad legen. Überwachen Sie das Tier während des gesamten Transduktionsprotokolls, um sicherzustellen, dass die Tiere betäubt sind und während dieses Vorgangs keine Schmerzen verspüren.
   3. Reduzieren Sie Isofluran auf 1,5 % (v/v) bei Mäusen oder 2,0 % (v/v) bei Ratten und halten Sie die Tiere für die Dauer des Protokolls unter Narkose.
   4. Um zu verhindern, dass Luft in die Blase gelangt, füllen Sie den Kunststoffkatheterteil eines IV-Katheters (siehe Materialtabelle) und die zugehörige Nabe mit sterilem PBS mit einer Transferpipette.
   5. Tupfen Sie das Tier in Rückenlage mit 70% Alkohol ab und führen Sie den sterilen Katheter in den äußeren Meatus, dann in die Harnröhre und dann in die Blase ein.
      1. Um diese Aufgabe auszuführen, greifen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig nach dem Gewebe, das den äußeren Meatus bildet, und strecken Sie es vertikal vom Tier weg aus. Führen Sie den Katheter mit der anderen Hand vorsichtig senkrecht etwa 3-4 mm in den Harnröhrengang (ein Fleischhügel direkt über der Öffnung der Vagina) ein. Senken Sie dann aufgrund einer Biegung der Harnröhre den Katheter, der in den äußeren Meatus eingeführt wird, in Richtung des Schwanzes des Tieres, was den Eintritt in den Teil der Harnröhre, der unter dem Schambein verläuft, und schließlich in die Blase erleichtert
         . HINWEIS: Insbesondere bei der Maus kann der Katheter zu lang sein, und es sollten nicht mehr als 1,0-1,1 cm davon in das Tier eingeführt werden. Andernfalls kommt es zu einer Schädigung der Blasenschleimhaut. Um dies zu verhindern, markieren Sie den Katheter ~1 cm unterhalb seiner Spitze und führen Sie den Katheter dann nicht über diese Markierung hinaus ein.
   6. Lassen Sie den Urin in der Blase austreten. Entfernen Sie den Restharn, indem Sie das Credé-Manöver ausführen: Massieren Sie den Blasenbuckel im Unterbauchbereich ein und drücken Sie ihn sanft nach unten.
2. Machen Sie das Urothel für die Transduktion empfänglich, indem Sie es mit einer Reinigungslösung behandeln.
   1. Waschen Sie die Blase der Maus oder Ratte, indem Sie eine sterile 1-ml-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an der Katheternabe anbringen. Injizieren Sie 100 μl steriles PBS in die Mausblase (oder 450 μl im Fall der Rattenblase). Lösen Sie die Spritze vom Katheteranschluss und lassen Sie den PBS-Abfluss zu. Führen Sie bei Bedarf das Crede-Manöver durch, um überschüssige Blasenflüssigkeit zu entfernen.
   2. 100 μl 0,1 % (w/v) N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) (gelöst in PBS und 0,2 μm filtersterilisiert) mit einer sterilen 1-ml-Spritze in die Mausblase einträufeln. Halten Sie das DDM 10 Minuten lang in der Blase, indem Sie die Spritze an Ort und Stelle lassen. Bei Ratten ist das Volumen von DDM auf 450 μl erhöht.
   3. Entfernen Sie das DDM aus der Blase, indem Sie die Spritze abnehmen und abtropfen lassen. Führen Sie bei Bedarf das Manöver von Crede durch.
3. Führen Sie das Virus in die Blase ein.
   1. Befestigen Sie eine sterile 1-ml-Spritze an der Katheternabe und träufeln Sie 0,5 x 10⁷ bis 1 x 10⁸ IVP des Adenovirus (hergestellt in Schritt 1), verdünnt in 100 μl sterilem PBS für Mäuse oder 450 μl für Ratten, in die Blase. Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um zu verhindern, dass die Viruslösung entweicht.
   2. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Spritze ab und lassen Sie die Viruslösung die Blase auf ein Einwegkissen evakuieren. Tupfen Sie alle Restvirenlösung mit einem saugfähigen Tuch ab, entsorgen Sie das Pad und wischen Sie es in biologisch gefährlichen Abfällen.
      HINWEIS: Glycerin ist zytotoxisch. Daher ist das maximale Volumen der Viruslösung, die Mäusen eingeflößt wird, auf 5 μl begrenzt (was bei Verdünnung auf 100 μl PBS zu einer endgültigen Glycerinkonzentration von ~0,5% [v/v] führen würde). Darüber hinaus ist es möglich, die Transduktionseffizienz zu verbessern, indem die Anzahl der instillierten IVP erhöht und die Virusinkubation auf 45 Minuten verlängert wird.
   3. Optionaler Schritt: Die Blase kann mit PBS gespült werden, wie in Schritt 2.2.1 oben beschrieben; Dies ist jedoch nicht erforderlich.
4. Lassen Sie das Tier sich erholen.
   1. Stoppen Sie den Fluss von Isofluran und lassen Sie das Tier sich erholen und vollständig mobil sein, bevor Sie es in seinen Käfig zurückbringen, insbesondere wenn die Tiere in Gruppen gehalten werden.
      HINWEIS: Da die Virustransduktion an sich keine beobachtbaren Symptome oder Schmerzen der unteren Harnwege verursacht, besteht in der Regel keine Notwendigkeit für eine postoperative Behandlung. Wenn das kodierte Transgen jedoch toxisch ist, kann nach dem Eingriff eine Analgesie oder Antibiotika erforderlich sein, wie von der Einrichtung gefordert.
5. Analysieren Sie die Auswirkungen der Transgenexpression 12-72 h nach der Behandlung mit Methoden wie mRNA-in-situ-Hybridisierung, Western Blot oder Immunfluoreszenz ^9,10,23 (siehe repräsentative Ergebnisse).

Ergebnisse

Vorbereitung auf Viren
Ein Beispiel für die Virusreinigung durch Dichtegradientenzentrifugation ist in Abbildung 1A dargestellt. Das hellrosa Band, das sich an der Grenzfläche zwischen dem beladenen Zellmaterial und der 1,25 g/ml CsCl-Schicht befindet, besteht hauptsächlich aus zerrissenen Zellen und ihren Trümmern (siehe magentafarbener Pfeil in Abbildung 1A). Es leitet seine rosafarbene Farbe von der geringen Menge an Nährmedium ab, die aus...

Diskussion

Während sich Ramesh et al. auf die Entwicklung von Strategien zur Verwendung der adenoviralen Transduktion bei der Behandlung von Blasenkrebs konzentrierten 18, haben neuere Berichte den Nutzen dieser Techniken bei der Untersuchung der normalen Urothelbiologie/-physiologie und Pathophysiologie gezeigt 10,18,19,20,21 . Zu den wichtigen M...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mL Pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serologische Pipette, einzeln verpackt
12 mL Ultrazentrifugenröhrchen	ThermoFisher	06-752	PET dünnwandiges Ultrazentrifugenröhrchen
15 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G Nadel	BD	305196	18 G x 1,5 Zoll Nadel
20 mL Pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serologische Pipette, einzeln verpacktes
konisches 50 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon (Corning)	352098
sterile 5 mL Pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serologische Pipette, einzeln verpackt
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-virale Lösung
Zellkulturschale - 15 cm	Falcon (Corning)	353025	steril, mit Gewebekulturen behandelt  (150 mm x 25 mm Schale)
Zellschaber	Sarstedt	893.1832	Grifflänge 24 cm, Klingenlänge 1,7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molekularbiologie Grade ≥ 98%
DMEM Kulturmedium (hohe Glukose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	mit 4,5 g/L Glukose + L-Glutamin + Phenolrot
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra Qualität ≥ 99%
Fötales Rinderserum	Hyklon (Cytiva)	SH30070,03	definiertes Serum
Glaspipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5,75 in Glaspipette, autoklaviert
Glycerin	Millipore Sigma	G-5516	Molekularbiologie Qualität ≥ 99%
HEK293 Zellen	ATCC	CRL-3216	HEK293T Zellen sind eine Variante von HEK293-Zellen, die das SV40 große T-Antigen
Isofluran	exprimierenCovetrus	29405
IV-Katheter - Maus	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 Zoll Sicherheits-IV-Katheter - röntgendichter
IV-Katheter - Ratte	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 Zoll Sicherheits-IV-Katheter röntgendicht
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molekularbiologie Klasse > 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Zellkulturqualität  ≥ 99%
2HPO4• 7 H2O	Millipore Sigma 431478		≥ 99,99 %
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molekularbiologie Gütegrad ≥ 99 %
N-Dodecyl-β -D-Maltosid	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nasenkonus für mehrere Tiere	, kundenspezifische		kommerzielle Optionen, einschließlich einer von Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 Säule	GE Healthcare	17-085-01	Vorgepackte Säulen gefüllt mit Sephadex G-25M
Penicillin/Streptomycin Antibiotikum (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x konzentrierte Lösung
Spektralphotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stativ und Zange	Fisher Scientific	14-679Q und 05-769-8FQ	von zahlreichen Lieferanten erhältlich
Sterilfiltereinheit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0,2 & micro; m Schnellstromfiltereinheit (150 mL)
Sterilfiltereinheit 0,2 &Mikro; m (Spritze)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0,22 &Mikro; m Filtereinheit, die an der Spritze
befestigt wird Super Speed Zentrifuge	Eppendorf	5810R	mit Eppendorf F34-6-38 Festwinkelrotor (12.000 U/min)
Spritze (1 mL)	BD	309628	1-mL-Spritze Luer-Lok-Spitze - sterile Spritze
(3 mL)	BD	309656	3-mL-Spritzenaufsteckspitze - steril
Tischzentrifuge (niedrige Drehzahl)	Eppendorf	5702	mit schwingendem Schaufelrotor
Transferpipetten	Fisher Scientific	13-711-9AM	Transferpipette aus Polyethylen 3,4 mL
Tris-Base	Millipore Sigma	648310-M	Molekularbiologie Qualität
TrypLE select Proteaselösung	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE Express Enzym (1x), kein Phenolrot
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	mit Beckman SW41 Rotor (41.000 U/min)
Verdampfer	Allgemeine Anästhesiedienste, Inc.	Tec 3	Isoflurane Vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analoger Vortex-Mixer