Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכת שינויים בפלסטיות סינפטית באמצעות מודל פגיעת ראש סגורה ערה של פגיעה מוחית טראומטית קלה

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

כאן, הוא מדגים כיצד מודל של פגיעת ראש סגור ער יכול לשמש לבחינת ההשפעות של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית (r-mTBI) על פלסטיות סינפטית בהיפוקמפוס. המודל משכפל תכונות חשובות של r-mTBI בחולים ומשמש בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה חוץ גופית .

Abstract

פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) הן בעיה בריאותית נפוצה בצפון אמריקה. ישנו לחץ גובר להשתמש במודלים תקפים מבחינה אקולוגית של mTBI עם ראש סגור בסביבה הפרה-קלינית כדי להגביר את יכולת התרגום לאוכלוסייה הקלינית. מודל הפציעה הסגורה של ערות (ACHI) משתמש בהשפעה קורטיקלית מבוקרת שונה כדי לספק פציעה עם ראש סגור, ולגרום לליקויים התנהגותיים רלוונטיים מבחינה קלינית ללא צורך בקרניוטומיה או שימוש בחומר הרדמה.

טכניקה זו אינה גורמת בדרך כלל למקרי מוות, שברים בגולגולת או דימומים מוחיים, והיא עקבית יותר עם פציעה קלה. ואכן, האופי המתון של הליך ACHI הופך אותו לאידיאלי עבור מחקרים החוקרים mTBI חוזר (r-mTBI). עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך ש-r-mTBI יכול לגרום לפציעה מצטברת שמייצרת תסמינים התנהגותיים, שינויים נוירופתולוגיים וניוון עצבי. r-mTBI נפוץ בקרב בני נוער העוסקים בספורט, ופציעות אלה מתרחשות במהלך תקופה של ארגון מחדש סינפטי חזק ומיאלינציה, מה שהופך את האוכלוסייה הצעירה לפגיעה במיוחד להשפעות ארוכות הטווח של r-mTBI.

יתר על כן, r-mTBI מתרחש במקרים של אלימות בין בני זוג אינטימיים, מצב שעבורו יש מעט אמצעי סינון אובייקטיביים. בניסויים אלה, תפקוד סינפטי הוערך בהיפוקמפוס בחולדות צעירות שחוו r-mTBI באמצעות מודל ACHI. בעקבות הפציעות, נעשה שימוש בכלי חיתוך רקמה כדי ליצור פרוסות בהיפוקמפוס כדי להעריך את הפלסטיות הסינפטית הדו-כיוונית בהיפוקמפוס 1 או 7 ימים לאחר ה-r-mTBI. בסך הכל, מודל ACHI מספק לחוקרים מודל תקף מבחינה אקולוגית לחקר שינויים בפלסטיות סינפטית בעקבות mTBI ו-r-mTBI.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא בעיה בריאותית משמעותית, עם ~2 מיליון מקרים בקנדה ובארצות הברית מדי שנה 1,2. פגיעה מוחית טראומטית משפיעה על כל קבוצות הגיל והמגדרים ויש לה שיעור היארעות גדול יותר מכל מחלה אחרת, במיוחד כולל סרטן השד, איידס, מחלת פרקינסון וטרשת נפוצה3. למרות השכיחות של פגיעה מוחית טראומטית, הפתופיזיולוגיה שלה עדיין אינה מובנת היטב, ואפשרויות הטיפול מוגבלות. באופן חלקי, הסיבה לכך היא ש-85% מכל ה-TBI מסווגים כקלים (mTBI), ובעבר חשבו ש-mTBI גורם רק לשינויים התנהגותיים מוגבלים וחולפים ללא השלכות נוירופסיכיאטריות ארוכות טווח 4,5. כיום ידוע כי התאוששות mTBI יכולה להימשך שבועות עד שנים5,6, לזרז מצבים נוירולוגיים חמורים יותר4, ושאפילו השפעות חוזרות ונשנות של "זעזוע מוח" משפיעות על המוח7. זה מדאיג מכיוון שלספורטאים בענפי ספורט כמו הוקי/כדורגל יש >10 פגיעות תת-זעזוע מוח בראש לכל משחק/אימון 7,8,9,10.

למתבגרים יש את השכיחות הגבוהה ביותר של mTBI, ובקנדה, בערך אחד מכל 10 בני נוער יפנה לטיפול רפואי לזעזוע מוח הקשור לספורט מדי שנה11,12. במציאות, כל פגיעת ראש תת-זעזועית או mTBI יכולה לגרום נזק מפוזר למוח, וזה יכול גם ליצור מצב פגיע יותר לפציעות הבאות ו/או למצבים נוירולוגיים חמורים יותר 13,14,15,16,17. בקנדה, החוק של רואן מכיר באופן חוקי בכך שפגיעה קודמת יכולה להגביר את הפגיעות של המוח לפגיעה נוספת18, אבל הבנה מכניסטית של r-mTBI עדיין לא מספקת. ברור, עם זאת, כי יחיד ו- r-mTBI יכולים להשפיע על יכולת הלמידה במהלך שנות בית הספר 19,20, יש תוצאות ספציפיות למין 21,22,23,2 4, ולפגוע ביכולת הקוגניטיבית מאוחר יותר בחיים 16,25,26. ואכן, ניתוחי עוקבה מקשרים קשר חזק r-mTBI בשלב מוקדם בחיים עם דמנציה מאוחר יותר 27,28. r-mTBI קשור באופן פוטנציאלי גם לאנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE), המאופיינת בהצטברות של חלבון טאו היפרפוספורילציה וניוון קליפת המוח פרוגרסיבי ומואצת על ידי דלקת משמעותית 27,29,30,31. למרות שהקשרים בין r-mTBI ו-CTE שנויים כיום במחלוקת32, מודל זה יאפשר לחקור אותם בפירוט רב יותר במסגרת פרה-קלינית.

mTBI מתואר לעתים קרובות כ"פציעה בלתי נראית", מכיוון שהיא מתרחשת בתוך גולגולת סגורה וקשה לזהות אותה אפילו בשיטות הדמיה מודרניות33,34. מודל ניסויי מדויק של mTBI צריך לדבוק בשני עקרונות. ראשית, הוא צריך לשחזר את הכוחות הביומכניים שנצפו בדרך כלל באוכלוסייה הקלינית35. שנית, המודל אמור לגרום לתוצאות התנהגותיות הטרוגניות, דבר הנפוץ מאוד גם באוכלוסיות קליניות36,37,38. כיום, רוב המודלים הפרה-קליניים נוטים להיות חמורים יותר, וכוללים קרניוטומיה, ריסון ראש סטריאוטקסי, הרדמה והשפעות קורטיקליות מבוקרות (CCI) המייצרות נזק מבני משמעותי וליקויים התנהגותיים נרחבים יותר ממה שנצפה בדרך כלל מבחינה קלינית33. דאגה נוספת במודלים פרה-קליניים רבים של זעזוע מוח המערבים קרניוטומיות היא שהליך זה עצמו יוצר דלקת במוח, וזה יכול להחמיר תסמיני mTBI ונוירופתולוגיה מכל פגיעה עוקבת39,40. ההרדמה מציגה גם מספר בלבולים מורכבים, כולל הפחתת דלקת 41,42,43, ויסות תפקוד מיקרוגליאה44, שחרור גלוטמט 45, כניסה Ca2+ דרך קולטני NMDA 46, לחץ תוך גולגולתי ומטבוליזם מוחי 47. הרדמה גם מציגה בלבול על ידי הגדלת חדירות מחסום הדם-מוח (BBB), זרחן טאו, ורמות סטרואידים, תוך הפחתת תפקוד קוגניטיבי 48,49,50,51. נוסף על כך, פציעות מפוזרות וסגורות מייצגות את הרוב המכריע של mTBIs52 קליניים. הם גם מאפשרים ללמוד טוב יותר את מגוון הגורמים שיכולים להשפיע על תוצאות התנהגותיות, כולל מין21, גיל 53, מרווח בין פציעות15, חומרה54, ומספר פציעות23.

כיוון הכוחות המאיץ/מתעתע (אנכי או אופקי) הוא גם שיקול חשוב לתוצאות התנהגותיות ומולקולריות. מחקר של Mychasiuk ועמיתיו השוו בין שני מודלים של mTBI מפוזר בעל ראש סגור: ירידה במשקל (כוחות אנכיים) ופגיעה צידית (כוחות אופקיים)55. הן הניתוח ההתנהגותי והן הניתוח המולקולרי חשפו תוצאות הטרוגניות תלויות מודל ומין בעקבות mTBI. לפיכך, מודלים של בעלי חיים המסייעים להימנע מהליכים כירורגיים, תוך שילוב כוחות ליניאריים וסיבוביים, מייצגים יותר את התנאים הפיזיולוגיים שבהם פציעות אלה מתרחשות בדרך כלל33,56. מודל ACHI נוצר כמענה לצורך זה, ומאפשר השראת mTBI מהירה וניתנת לשחזור בחולדות תוך הימנעות מפרוצדורות (כלומר, הרדמה) הידועות כמטות הבדלים בין המינים57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האישור לכל ההליכים בבעלי חיים ניתן על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ויקטוריה בהתאם לתקני המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). כל הזכרים של חולדות לונג-אוונס גודלו בבית או נרכשו (ראו טבלת חומרים).

1. תנאי דיור וגידול

  1. לאפשר לבעלי החיים להתאקלם בסביבת המגורים שלהם במשך שבוע אחד לפני הגמילה ביום שלאחר הלידה (PND) 21.
  2. שמור על החולדות בדיור כלוב סטנדרטי ב 22.5 ° C ± 2.5 ° C, עם גישה אד libitum למזון ומים, על מחזור אור / חושך 12 שעות.
  3. קבצו את בעלי החיים ושכנו אותם עם שתיים או שלוש המלטות תואמות מין, והקצו אותן באופן אקראי לתנאי דמה או r-mTBI.
  4. בצע את כל ההליכים בין השעות 07:30 עד 23:30.

2. הגדרת נוהל פגיעת ראש סגור ער

  1. מיקום 2.75 אינץ'. כרית קצף בצפיפות נמוכה (100 ס"מ x 15 ס"מ x 7 ס"מ) מתחת למפגע כדי לאפשר תנועת ראש סיבובית.
    הערה: כרית הקצף היה קבוע קפיץ של ~ 2,500 N / m אבל יכול לנוע בין 3,100 ל 5,600 N / m58. רמת הקשיחות (נמוכה, בינונית וגבוהה) לא הוכחה כמנבאת את תוצאת הפציעה59. כרית הקצף היא חומר שאינו מתכלה. הוא מוחלף בדרך כלל מדי שנה או אם הוא מלוכלך או פגום.
  2. הפעילו את מכשיר ההשפעה של קליפת המוח שעבר שינוי (איור 1A), והגדירו את המהירות ל-6 מ"ש.
    הערה: מפרטים אלה נועדו לגרום לליקוי נוירולוגי חריף בחולדות צעירות ומתבגרים המקבילים למאפיינים של mTBI, אך פרמטרים כאלה עשויים שלא להתאים לבעלי חיים מבוגרים או למינים אחרים (למשל, עכברים או חמוסים). לסקירה של פרמטרים נפוצים של ACHI, ראה60.

3. השראת mTBI

  1. כאשר החולדות מגיעות ל-PND 24, העבירו אותן לחדר הפרוצדורות שבו יבוצעו ההליכים. ודאו שחדר זה נפרד מסביבת המגורים הרגילה שלהם.
  2. הניחו את החולדה בעדינות בתוך חרוט ריסון, וודאו שהחוטם והנחיריים קרובים לפתח הקטן של החרוט כדי לאפשר אוורור הולם. השתמשו בקליפס שיער מפלסטיק כדי להחזיק את החרוט סגור בקצה הקאודלי כדי למנוע תזוזה ברגע שהחולדה מונחת בחרוט הריסון.
    1. השתמש בציוני ריסון כדי לתעד את הציות או הסובלנות של בעלי החיים עם קונוס הריסון ונוהל ACHI.
      הערה: ציון הריסון יכול לשמש כהערכה של לחץ אצל בעלי חיים. לפיכך, ניתן לפתח קריטריוני הרחקה באמצעות ציון האיפוק כדי להפחית את השונות בין נושאים המתעוררת עקב תגובת לחץ מוגזמת.
      1. תן ציון מ-0 עד 4 בהתבסס על נכונות החיה להיכנס לחרוט, תנועותיו וקולותיו. תן ציון של 0 אם אין התנגדות לריסון, בעוד ציון של 1 מתאים לחיה שהופכת 1-2x ומעט מאוד קולות או התפתלויות. תן ציון של 2 אם החיה מלאו לה 2-3 פעמים ומפגינה קול או התפתלויות. תן ציון איפוק של 3 אם החיה הגיעה לגיל 5-10 ומפגינה יותר קולות והתפתלות. לבסוף, תן ציון של 4 אם החיה הסתובבה יותר מ -10x עם קולות תכופים והתפתלות.
        הערה: מידע זה נמצא גם בגיליון הניקוד עצמו (טבלה משלימה S1 וטבלה משלימה S2).
  3. בזמן שהחולדה מרוסנת, מקמו ידנית את הקסדה (איור 1B) מעל קו האמצע, כאשר דיסק המטרה נמצא מעל האונה הקודקודית השמאלית (איור 1C,D).
  4. הניחו את החולדה על כרית הקצף והגדירו ידנית את המשפיען למצב הרחבה. הנמיכו ידנית את קצה המשפיע כך שיבוא במגע עם דיסק המטרה בקסדה. הגדר ידנית את המשפיע למצב נסיגה כדי לגרום למשפיע לסגת 10 מ"מ מעל הקסדה.
  5. השתמש בחוגה על הזרוע הסטריאוטקסית כדי להקטין את קצה הפגיעה ב -10 מ"מ כך שהוא ייגע שוב בדיסק המטרה בקסדה. הפוך את מתג הפגיעה כך שראשו של בעל החיים יואץ במהירות למשך 10 מ"מ במהירות של 6 מ"מ לשנייה.
  6. לאחר הפעלת המכשיר, הסר מיד את בעל החיים מחרוט הריסון והמשך לביצוע פרוטוקול הערכה נוירולוגית מיידית (NAP).
    הערה: עבור הניסויים הנוכחיים, פרוטוקול זה חזר על עצמו שמונה פעמים בסך הכל במרווחים של שעתיים.

4. השראת פגיעה בושה

  1. בצע את כל הליכי הניסוי כמתואר לעיל בסעיף 3 אך מקם את החולדה בסמוך לנתיב של בוכנה הפגיעה, כך שלא תימסר פגיעה.

5. פרוטוקול הערכה נוירולוגית

הערה: ניתן להשתמש ב-NAP כדי למדוד את רמת התודעה, כמו גם את התפקוד הקוגניטיבי והסנסומוטורי.

  1. בתחילת המחקר ומיד לאחר השראת ה-mTBI או פציעת דמה, העריכו את החולדות באמצעות NAP כמתוארב-56,61. על שולחן, הניחו את כלוב הבית של החולדות וכלוב התאוששות במרווחים של 100 ס"מ זה מזה. מרכז באופן שווה את קרן האיזון מעל שני הכלובים. בנוסף, הניחו מגבת מקופלת או ריפוד נוסף מתחת לקורת האיזון.
  2. במידת הצורך, להעריך את רמת התודעה. אם בעלי חיים אינם מגיבים לאחר mTBI, העריכו את דום הנשימה (הפסקת נשימה) וכל עיכוב ברפלקס הנכון על ידי שימוש בסטופר כדי לתעד את הזמן שלקח לבעל החיים לחזור לנשום ו/או לתקן את עצמו משכיבה למצב נוטה.
    הערה: אובדן רפלקס התיקון ודום נשימה הם נדירים במודל ACHI, אך לעיתים ניתן לצפות בהם בבעלי חיים צעירים.
  3. הערך את התפקוד הקוגנטיבי והתחושתי-מוטורי של החולדה באמצעות רצף הבדיקות הבא. בצע בדיקות אלה במהירות ברצף לאחר הערכת ההכרה.
    הערה: סיכום ארבעת המבחנים הללו מניב ציון כולל מתוך 12, אם לא נצפים ליקויים התנהגותיים. גירעונות גורעים מציון זה.
    1. תגובת בהלה
      1. הכניסו את החולדה לכלוב ההתאוששות הריק ומחאו כפיים בקול רם (50 ס"מ) מעל הכלוב. הקלט את תגובת בעל החיים לרעש באמצעות מערכת הניקוד הבאה:
        3 = תגובת בהלה מהירה לצליל (למשל, תנועת אוזן/עוויתות, קפיצה, קופא כל הגוף).
        2 = תגובה איטית או תגובת הקפאה קלה לצליל.
        1 = רק תנועות אוזניים שנצפו.
        0 = אין תגובה לצליל.
    2. הארכת גפיים
      1. כאשר הקרן (100 ס"מ אורך x 2 ס"מ רוחב x 0.75 ס"מ עובי) מונחת אופקית על פני בית החולדה וכלובי ההתאוששות, הרימו את החולדה בבסיס הזנב והחזיקו אותה ליד הקורה. ודאו שהחולדה קרובה מספיק כדי שתוכלו לתפוס אותה בקלות. העריכו את יכולתה של החולדה להאריך את שתי הגפיים אל הקרן בעזרת שיטת הניקוד הבאה:
        3 = הרחבה מלאה של שתי הגפיים הקדמיות ואוחזת בקורה.
        2 = רק איבר אחד מורחב.
        1 = הארכה או נסיגה לסירוגין של הגפיים הקדמיות.
        0 = Forelimbs הם צולעים/ללא הרחבה.
    3. הליכת קרן
      1. הניחו את בעל החיים במרכז הקורה האופקית בגובה 50 ס"מ הפונה לכלוב הביתי שלו. ודא שהקרן מרווחת באופן שווה בין הכלוב הביתי של החולדה לכלוב ההתאוששות (ממוקם ~ 80 ס"מ זה מזה). אפשרו לחולדה לחצות את הקורה. העריכו את יכולתה של החולדה לאזן וללכת בעזרת שיטת הניקוד הבאה:
        3 = הולך בהצלחה על פני הקרן עם פחות משתי החלקות רגל בתוך 10 שניות.
        2 = הולך בהצלחה את הקורה, אבל יותר משני החלקות רגל נצפים.
        1 = תנועה ללא קטר, תנועת 'שחייה'.
        0 = לא מסוגל ללכת לאורך הקרן או לא מסוגל לנוע בתוך 10 שניות.
    4. קורה מסתובבת
      1. מקמו מחדש את החולדה במרכז האלומה, וודאו שהחולדה מאוזנת. הרימו את הקורה 80 ס"מ מעל מגבת או משטח מרופד והתחילו לסובב את הקורה ידנית בקצב של סיבוב אחד לשנייה למשך 4 שניות (סה"כ ארבעה סיבובים). העריכו את יכולתה של החולדה להישאר על הקרן בזמן שהיא מסתובבת בעזרת שיטת הניקוד הבאה:
        3 = חולדה נשארת על הקרן במשך כל ארבעת הסיבובים.
        2 = חולדה נופלת בסיבוב הרביעי.
        1 = חולדה נופלת בסיבוב השני או השלישי.
        0 = חולדה נופלת במהלך הסיבוב הראשון.
  4. עם השלמת NAP, החזירו חולדות mTBI וחולדות דמה לכלובים הביתיים שלהן. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור הליכי r-mTBI. עקוב אחר רווחתם של בעלי החיים לאחר פציעות באמצעות רשימת הבדיקה לניטור בצד הכלוב (קובץ משלים 1). אם יש אינדיקציה כלשהי לחריגה (כל ציון שאינו N) במהלך ניטור בצד הכלוב, יש לקחת ציון כאב מלא עם סולם הכאב ורשימת הבדיקה לניטור מתקדם לאחר פגיעת ראש (קובץ משלים 2).

6. הכנת פרוסות

הערה: במחקר הנוכחי, פלסטיות סינפטית הוערכה בבעלי חיים לאחר r-mTBI 1 או 7 ימים לאחר mTBI. בימים אלה הובאו בעלי החיים בנפרד למעבדה בכלובים מכוסים לפני הקרבתם.

  1. הכניסו למקרר (-20°C) למשך הלילה את כל כלי הניתוח (איור 2A) הדרושים להכנת פרוסות בהיפוקמפוס: מספריים סטנדרטיים, מספריים לניתוח, מלקחיים, רונגורים, מריות ובלוק קירור.
    הערה: אין לקרר את דבק הרקמה ואת תא הדגירה.
  2. הכן נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) המכיל 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1.3 mM MgCl 2 ו- 10 mM דקסטרוז (300 ± 10 mOsm; pH 7.2-7.4).
    הערה: הפתרון העיקרי של aCSF חייב להיות מבעבע ברציפות עם קרבוגן (95% O 2/5% CO2) למשך הפרוטוקול.
  3. לפני המתת חסד החיה (שלב 6.8), להכין 12.5 מ"ל של agarose. להמיס 0.25 גרם של אגרוז ב 12.5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (1x PBS) על ידי microwaving בצינור חרוטי 50 מ"ל במרווחים של 10 שניות.
  4. שמרו על האגרוז חם (42°C) ונערו בצלחת חימום כדי למנוע ממנו להתמצק.
  5. הקימו תחנת חיתוך על קרח, כולל צלחת פטרי וכוס קטנה (50 מ"ל) מלאה ב-aCSF קר כקרח (4°C) וצלוחית פטרי הפוכה עם פיסת נייר מסנן רטוב מעליה (איור 2A). מבעבעים ללא הרף את ה-aCSF בכד הקטן עם קרבוגן.
  6. חממו את אמבט המים ל 32 °C (75 °F). מלאו את תא ההתאוששות ב-aCSF והמשיכו לבעבע בקרבוגן (איור 2B).
  7. להעביר את החיה לחדר הניסויים.
  8. מרדימים את בעל החיים באמצעות איזופלורן 5% כממס נדיף (עד היעדר רפלקס נסיגה) ולאחר מכן ערפו את ראשו במהירות באמצעות גיליוטינה קטנה.
  9. נתחו את המוח מהגולגולת בצלחת פטרי מלאה ב-aCSF קר כקרח (4°C), והחזיקו את הגולגולת שקועה ב-aCSF כדי לעזור לקרר במהירות את הרקמה.
    הערה: הליך זה דורש בדרך כלל פחות מ -5 דקות, אך מהירות הסרת המוח אינה גורם קריטי אם המוח שקוע ב- aCSF מקורר.
  10. הכניסו את המוח לתוך הכוס הקטנה של aCSF מצונן וקרבוגני כדי לנקות ולצנן עוד יותר את הדגימה.
  11. העבירו את המוח לצלוחית פטרי הפוכה והניחו אותה על נייר הפילטר. השתמש באזמל חד כדי להסיר את המוח הקטן ואת קליפת המוח הקדם-מצחית כדי "לחסום" את המוח. להפריד את שתי ההמיספרות על ידי ביצוע חתך קו האמצע של המוח.
    הערה: הפרוטוקול הבא מבוצע חצי כדור אחד בכל פעם. זה הכרחי כי חצי הכדור לא מוכן כרגע נשאר שקוע בכד של aCSF קר כקרח (4 ° C) carbogenated.
  12. כדי ליצור פרוסות היפוקמפוס רוחביות, הניחו את חצי הכדור על המשטח המדיאלי. הטה את להב האזמל ב~30° פנימה והסר פרוסה דקה מהמשטח הגבי של המוח כדי לספק משטח שטוח למוח להיות מותקן על הבוכנה המשמשת את כלי הפריסה. הפכו את המוח על המשטח הגבי וטפחו בעדינות את הרקמה על נייר סינון יבש כדי להסיר עודפי aCSF. באמצעות דבק ציאנואקרילט, לחבר את המשטח הגבי של המוח אל הבוכנה, משאיר את משטח הגחון זקוף.
    הערה: יש לוודא שהדבק אינו עובר על קצה הבוכנה, שכן הדבר יגרום לה להיצמד לצינור המתכת המשמש להכלת האגרוז ולמנוע תזוזה של הבוכנה.
  13. מרחיבים את הצינור החיצוני של הבוכנה מעל המוח ושופכים את האגרוז הנוזלי לתוך הצינור עד שהמוח מכוסה לחלוטין. מצקו במהירות את האגרוז על-ידי הידוק גוש קירור מעל צינור הבוכנה (איור 2A).
  14. מקם את הבוכנה לתוך התא של כלי הפריסה ולאבטח את החדר עם בורג. אבטחו את הלהב והוסיפו aCSF מחומצן וקר כקרח לתא כלי הפריסה.
  15. בכלי הפריסה (איור 2B), כוונו את מהירות החיתוך ל-4, את התנודה ל-6, והעבירו את מתג החיתוך הרציף/יחיד לרציף. התחילו לחתך את המוח במהירות של 400 מיקרומטר.
  16. כאשר כלי החיתוך חותך את המוח, השתמשו בפיפטת פסטר בקוטר גדול כדי להעביר כל פרוסה לאמבט ההתאוששות של aCSF מחומצן בזמן שהיא מחולקת (איור 2C).
    הערה: כאשר כל פרוסה נחתכת, ניתן למקם אותה ברצף בבארות השונות של אמבט ההתאוששות. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל בין שש לשמונה פרוסות, המכילות את ההיפוקמפוס עבור כל חצי כדור. אטלסחולדה 62 יכול לשמש לזיהוי המיקום הגבי-גחוני של פרוסות בודדות במוח החולדה.
  17. תן לפרוסות להתאושש ב 32 ° C במשך 30 דקות ולאחר מכן להשאיר להתאושש במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר (23 ° C).
  18. חזור על שלבים אלה כדי ליצור פרוסות מחצי הכדור השני.

7. אלקטרופיזיולוגיה של השדה

הערה: כדי להשיג הקלטות שדה חוץ-תאי מהבליטה המשוננת (DG), בצע את השלבים הבאים. לאחר התאוששות של 60 דקות, פרוסות היפוקמפוס בודדות מוכנות להקלטות שדה חוץ-תאי.

  1. באמצעות מושך מיקרופיפטה זמין מסחרית, למשוך אלקטרודות הקלטה (1-2 MΩ) מ 10 נימי זכוכית בורוסיליקט עם קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ וקוטר פנימי של 1.1 מ"מ.
    הערה: אלקטרודת הקלטה צריכה להיות בעלת התנגדות של ~1 MΩ והקצוות צריכים להיות בגודל ~1 מ"מ. עקביות בפרמטרים של אלקטרודות חשובה להקלטות טובות.
  2. הפעל את המחשב והציוד שישמשו להקלטות: המגבר, הדיגיטציה, הסטימולטור, המיקרומניפולטור, וסת הטמפרטורה, אור המיקרוסקופ ומשאבת הוואקום.
  3. מלאו ב-aCSF וחברו אותה למערכת זילוח מבוקרת כבידה. פתח את שסתום ה- aCSF במערכת הזילוח כדי להתחיל זרימה של aCSF דרך תא הזילוח. לשמור על קצב זרימה של כטפטוף אחד או שניים או 2 מ"ל/דקה. קרבוגנטי aCSF רציף למשך רישומים אלקטרופיזיולוגיים.
    הערה: הכרחי לשמור על קצב טפטוף קבוע של aCSF קרבוגני במהלך הקלטות השדה. זה גם הכרחי כי אלקטרודת הייחוס הוא שקוע לחלוטין aCSF.
  4. השתמש פיפטה פסטר להעביר פרוסת היפוקמפוס מן האמבטיה התאוששות אל תא זילוח כי הוא מחורר ברציפות עם aCSF carbogenated ונשמר ב 30 ± 0.5 ° C. כוונו את פרוסת המוח כך שהפיתול המשונן ושכבת תאי הגרגיר ייראו בשדה הראייה. ייצבו את הפרוסה בעזרת משקולות תיל כפופות. הפעל את תוכנת המחשב לרכישת נתונים.
    הערה: זה יכול להיות מועיל לכבות את משאבת ואקום במהלך שלב זה כדי לאפשר מניפולציה חופשית של הרקמה. זה צריך להיעשות במהירות כמו מניפולציה יותר מדי יכול להזיק לרקמה. בנוסף, תא הזילוח יכול לעלות על גדותיו עם aCSF אם זה לוקח יותר מדי זמן. לאחר שהרקמה מכוונת כראוי ומיוצבת, הפעל את משאבת הוואקום.
  5. השתמש במיקרוסקופ זקוף כדי להמחיש את ה- DG עם אופטיקה אלכסונית. מקם אלקטרודה מגרה דו-קוטבית קונצנטרית כדי להפעיל את סיבי הנתיב הפרפורנטי המדיאלי (MPP) בשליש האמצעי של השכבה המולקולרית. לאחר מכן, מקמו מיקרופיפטה מזכוכית, מלאה ב-aCSF ב-MPP (איור 3A,B). התחילו עם האלקטרודות רחוקות יותר זו מזו (כלומר, האלקטרודה המגרה ליד CA3 והאלקטרודה הקולטת ממש מעל הסוג של ה-DG), שכן נגיעה ברקמה תגרום נזק לסיבים.
    הערה: באופן אופטימלי, כל ההקלטות צריכות לכלול את האלקטרודות ממוקמות במרחק שווה משכבת התא, במרחק של כ-200 מיקרומטר זו מזו.
  6. לאחר מיקום אלקטרודות הגירוי וההקלטה, דמיינו את תגובות השדה המעורר באמצעות מגבר, דיגיטציה ותוכנת הקלטה.
  7. כדי למצוא שדה מתאים פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר (fEPSP), עורר את הרקמה עם פעימות זרם של 0.12 אלפיות השנייה ב- 0.2 הרץ (כל 5 שניות) כאשר המשתמש מיומן במציאת תגובות, או ב- 0.067 הרץ (כל 15 שניות) למשתמשים פחות מיומנים כדי להימנע מגירוי יתר. ודא כי fEPSP יש משרעת מינימלית של 0.7 mV עם מטח סיבים ברור כי הוא קטן יותר fEPSP.
    הערה: קריטי למקם את שתי האלקטרודות במרחק שווה משכבת התא כדי לקבל תגובות שדה מקסימליות ורחוקות מספיק זו מזו (כלומר, ~200 מיקרומטר) כדי ליצור מטח סיבים קטן. התאמות קטנות במיקום האלקטרודה עשויות לסייע בשיפור המשרעת של התגובה, אם כי יש לשמור עליהן למינימום כדי למנוע נזק לרקמות.
  8. קבע את המשרעת המרבית של fEPSP על ידי הגדלת עוצמת הגירוי ולאחר מכן הגדר את עוצמת ההדמיה כך שה- fEPSP יהיה ב- 70% מהמשרעת המרבית.
    הערה: המשרעת המרבית מוגדרת ל-70% עבור מחקרי דיכאון ארוך טווח (LTD) ול-50% עבור מחקרי הגברה לטווח ארוך (LTP). המשרעת המקסימלית נקבעת על ידי התאמת עוצמת הגירוי עד שה- fEPSP כבר לא גדל באמפליטודה. עבור fEPSP עם משרעת מקסימלית של 2 mV, גודל התגובה יותאם ל- 1.4 mV עבור מחקרי LTD ו- 1.0 mV עבור מחקרי LTP, כדי לאפשר מקום ל- fEPSP לדכא או להגביר (בהתאמה).
  9. קבע קו בסיס יציב של מיזוג מוקדם למשך 20 דקות עם פולסים של 0.12 אלפיות השנייה המסופקים ב- 0.067 הרץ. כדי שפרוסות ייחשבו יציבות, חפש שונות של <10% בשיפוע ההתחלתי של fEPSP ושהשיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר דרך שיפועי fEPSP המשורטטים יהיה <0.5. המשך בשלבים הבאים של ההקלטה כאשר EPSPs מאומתים כיציבים למשך 20 דקות.
    הערה: ניתן להוסיף אנטגוניסטים קולטנים שונים ל- aCSF כדי לחסום או לשפר LTD ו- LTP. אם הם נדרשים, ודא שהפרוסות חשופות לחומרים פרמקולוגיים אלה במהלך תקופת בסיס זו וכי הדרישות לרישומים יציבים מתקיימות. לדוגמה, ראה63,64,65.
  10. ראשית, לקבוע שינויים בתכונות סינפטיות בסיסיות על ידי שימוש בגירויים זוגיים של פולסים ועל ידי בניית עקומות קלט-פלט של גירוי-תגובה. עבור בדיקת הדופק הזוגי, החל סדרה של פולסים זוגיים עם מרווח אינטרפולס של 50 אלפיות השנייה ב- 0.033 הרץ. עבור עקומות קלט-פלט, החל סדרה (10) של עוצמות גירוי גדלות (0.0-0.24 אלפיות השנייה) ב- 0.033 הרץ כדי להתוות את השינוי בגודל התגובה של fEPSP.
  11. כדי לחקור LTD התלוי בעיקר בהפעלת קולטני CB164,66, השתמש בפרוטוקול 10 הרץ (6,000 פולסים ב 10 הרץ). ניהול פרוטוקול זה אורך 10 דקות.
  12. עבור הקלטות לאחר ההתניה, המשך להשתמש בגירוי בפולס יחיד (0.12 אלפיות השנייה בתדר של 0.067 הרץ) למשך 60 דקות נוספות.
  13. לאחר ההקלטה שלאחר ההתניה, שוב לנהל את הגירויים הדופק הזוגי, ואחריו עקומת קלט-פלט. השווה אותן להקלטות בסיסיות כדי לצפות בשינויים בתכונות השחרור הפרה-סינפטי ולעזור להעריך את תקינות הפרוסה עבור הקלטות לטווח ארוך.
  14. במהלך הניתוח, היה שמרני ודבוק בקריטריוני ההדרה בעת קביעה אם הנתונים מפרוסות בודדות צריכים להישמר בערכת הנתונים של הפלסטיות הסינפטית. אל תכלול פרוסות המציגות שיפוע גדול בקו המתאים ביותר של שיפועי fEPSP במהלך קו הבסיס של המיזוג מראש (שיפוע >0.5), חוסר יציבות בקו הבסיס של המיזוג מראש (שינוי של >10%) או חוסר יציבות בתקופה שלאחר ההתניה (שיפוע >1.5 ב- 50-60 דקות לאחר ההתניה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל פגיעת ראש סגור ער הוא שיטה מעשית לגרימת r-mTBI בחולדות צעירות. חולדות שנחשפו ל-r-mTBI עם מודל ACHI לא הראו ליקויים התנהגותיים גלויים. הנבדקים בניסויים אלה לא הראו חביון לימין או לדום נשימה בשום שלב במהלך הליך r-mTBI, מה שמצביע על כך שאכן היה זה הליך TBI קל. הבדלים התנהגותיים עדינים אכן התגלו ב-NAP; כפי שתואר לעיל, החולדות קיבלו ניקוד בארבע משימות סנסומוטוריות (תגובת בהלה, הארכת גפיים, הליכת קרן וקרן מסתובבת) בסולם מ-0 עד 3, כאשר 3 לא ייצגו שום ליקוי במשימה. לכן, ככל שציון NAP נמוך יותר, כך בעל החיים היה לקוי יותר. בנקודת ההתחלה, לא היו הבדלים בציוני NAP בין חולדות דמה וחולדות r-mTBI. לאחר כל מפגשי ה-ACHI, חולדות r-mTBI הראו ליקויים משמעותיים במשימות NAP בהשוואה ל-Shams (איור 4). עם זאת, כפי שדווח בעבר עבור פגיעות שניתנו במשך מספר ימים (כלומר, יומיים או ארבעה ימים), תוספת הפציעות שלאחר מכן במהלך היום לא החמירה או יצרה ליקויים התנהגותיים נוספים. לפיכך, מודל ACHI של r-mTBI מייצר ליקויים התנהגותיים עדינים, אך משמעותיים, במהלך נקודות זמן אקוטיות אלה לאחר פציעה.

בעקבות פרוטוקול הפציעה, תגובות שדה מעוררות ופלסטיות סינפטית נבדקו בקלט MPP ל-DG של ההיפוקמפוס ביום 1 שלאחר הפציעה (PID1), וב-PID7. בריאות הפרוסה נבדקה באמצעות fEPSPs בתגובה לסדרה עולה של רוחב פולסים בכל פרוסה. כפי שניתן לראות באיור 3C, לא היה הבדל בעקומות הקלט-פלט שנוצרו בפרוסות שהתקבלו מחולדות דמה ו-r-mTBI. כדי לבחון את שחרור המשדר הפרה-סינפטי, בוצעה סדרה של פולסים זוגיים (מרווח אינטרפולס של 50 מילישניות), וחושב היחס בין גודל ה-fEPSP השני ביחס ל-fEPSP הראשון. יחסי הדופק הזוגי לא היו שונים בין חולדות דמה וחולדות r-mTBI (איור 3D). לפיכך, נתונים אלה מצביעים על כך ש-r-mTBI לא שינה פיזיולוגיה סינפטית בסיסית בקלט MPP ל-DG. כדי לבחון בע"מ, ניתן פרוטוקול 10 הרץ בע"מ להשראת בע"מ התלוי באנדוקנבינואידים64. ב-PID1 חלה ירידה משמעותית ביכולת של קלט MPP ל-DG לקיים LTD (איור 3E). עם זאת, ירידה זו ב-LTD הייתה חולפת, ולפי PID7, פרוסות מחיות דמה ו-r-mTBI הציגו מקבילות LTD (איור 3F), אם כי הייתה אינדיקציה למגמה קלה של פרוסות מחיות r-mTBI להציג עלייה ב-LTD.

Figure 1
איור 1: מערך פרוצדורות ACHI המשמש למדל r-mTBI . (A) נעשה שימוש במפגע קורטיקלי מבוקר שונה כדי להזיז במהירות את ראש החיה 10 מ"מ במהירות של 6.0 מ"מ לשנייה. (B,C) קסדה מודפסת תלת-ממדית מותאמת אישית עם אתר מטרה של קליפת המוח הקודקודית השמאלית. (D) הנבדקים הונחו בשקית ריסון מפלסטיק על משטח קצף, כאשר הקסדה הונחה סביב חרוט הריסון ומוקמה כך שאתר המטרה נמצא ישירות מתחת לקצה המשפיע. קיצורים: ACHI = פגיעת ראש סגורה ערה; r-mTBI = פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: החומרים וההתקנה הדרושים להכנת הפרוסה. (A) כלים המשמשים לחילוץ, הרכבה, חיתוך ודגירת המוח: (א) צלחת תרבית עם נייר פילטר; (ב) כלי נתיחה שונים, לרבות מספריים תקניים, מספריים לניתוח, מלקחיים, רונגר ומרית; (ג) דבק רקמות; (ד) בוכנה קומפרסטום וצינור דגימה; (ה) להב נוצה ומחזיק להב; (ו) בלוק קירור; (ז) תא דגירה פרוס. (B) חותך רקמות דחוס. (C) פרוסות המודרות באמבטיה המכילה נוזל מוחי מלאכותי שדרתי המחומצן ברציפות ב-95% O 2/5% CO2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ליקויים חריפים בפלסטיות סינפטית בחולדות זכרים צעירים כתוצאה מ-r-mTBI באמצעות מודל ACHI . (A) מסלולי ההיפוקמפוס העיקריים. המסלול הפרפורנטי המדיאלי מורכב מהקלט מקליפת המוח האנטורינלית אל הבליטה המשוננת (כחול). הנתיב הפרפורנטי המדיאלי מזין סינפסה על תאי גרגיר בבליטה המשוננת (סגול). (B) פוטומיקרוגרף ברייטפילד של פרוסת מוח בהיפוקמפוס (הגדלה פי 4), המראה את המיקום בפועל של אלקטרודה מגרה דו-קוטבית (משמאל) ופיפטה של אלקטרודת הקלטה מזכוכית (מימין) בנתיב הביצוע המדיאלי של הבליטה המשוננת. (C) תרשים קלט-פלט (שיפוע fEPSP) לעוצמות סימולציה שונות (10-300 μs) ב-PID1 וב-PID7 עבור חולדות דמה ו-r-mTBI. (D) יחסי פולס זוגיים עבור חולדות דמה וחולדות r-mTBI (מרווח אינטרפולס של 50 מילישניות). (E) מהלך הזמן של שינויי fEPSP לפני ואחרי מתן פרדיגמת אינדוקציה LTD בפרוסות היפוקמפוס שהתקבלו מחולדות דמה ו-r-mTBI ב-PID1. (F) מהלך הזמן של שינויי fEPSP לפני ואחרי מתן פרדיגמת אינדוקציה LTD בפרוסות היפוקמפוס שהתקבלו מחולדות דמה ו-r-mTBI ב-PID7. קיצורים: ACHI = פגיעת ראש סגורה ערה; r-mTBI = פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית; PID = יום לאחר פציעה; fEPSP = פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר שדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ליקוי נוירולוגי חריף בחולדות זכרים צעירים עקב r-mTBI באמצעות מודל ACHI. החולדות עברו שמונה ניתוחי ACHI במרווחים של שעתיים במשך יום אחד, עם פרוטוקול הערכה נוירולוגית שנערך בתחילת המחקר ולאחר כל פציעה. ה-NAP כלל ארבע משימות: תגובת בהלה, הארכת גפיים, הליכת קרן וקרן מסתובבת. כל משימה קיבלה ציון מתוך 3, מה שנתן ציון אפשרי כולל של 12 לכל מפגש. הנתונים המוצגים כממוצע ± SEM. (*) מציין p < 0.05. קיצורים: ACHI = פגיעת ראש סגורה ערה; r-mTBI = פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית; NAP = פרוטוקול הערכה נוירולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: נוהל ACHI מידע על בעלי חיים והשפעה. קיצור: ACHI = פגיעת ראש סגורה ערה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: ניקוד ריסון עבור mTBI ער. קיצור: mTBI = פגיעה מוחית טראומטית קלה. "להסתובב באיפוק" מתייחס לחוקר המניח את בעל החיים בריסון, לפני סגירת השקית סביב הזנב. לאחר סגירת השקית, החיה לא אמורה להיות מסוגלת להסתובב. השמעת קול והתפתלות יש להבקיע לאחר סגירת התיק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: רשימת תיוג לניטור בצד הכלוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: סולם כאב ורשימת תיוג מתקדמת לניטור. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רוב המחקרים הפרה-קליניים השתמשו במודלים של mTBI שאינם משחזרים את הכוחות הביומכניים שנצפו באוכלוסייה הקלינית. כאן, הוא מראה כיצד מודל ACHI יכול לשמש כדי לגרום r-mTBIs בחולדות צעירות. למודל סגור זה של r-mTBI יש יתרונות משמעותיים על פני הליכים פולשניים יותר. ראשית, ה-ACHI אינו גורם בדרך כלל לשברים בגולגולת, דימומים מוחיים או מקרי מוות, שכולם יהיו התוויות נגד לפגיעה מוחית טראומטית "קלה" באוכלוסיות קליניות61. שנית, ACHI אינו דורש שימוש craniotomies, וזה משמעותי כי הם ידועים לגרום לתגובות דלקתיות שיכולות להחמיר סימפטומולוגיות נוירופתולוגיה67. שלישית, ACHI אינו דורש שימוש בהרדמה. זה גם משמעותי, כמו הרדמה יכול להיות תכונות neuroprotective יכול לפגוע פלסטיות סינפטית, בנוסף למידה וזיכרוןביצועים 48,49,50,51,68. לבסוף, ACHI יכול לייצר שינויים חולפים עדינים בתפקוד הנוירולוגי שניתן להעריך מיד לאחר הפציעה.

מאחר שה-ACHI בדרך כלל אינו גורם לאובדן הכרה או דום נשימה, מודל זה מחקה mTBI בחלק משמעותי מהאוכלוסייה הקלינית 69,70,71. למרות זאת, מודל ACHI הביא לירידה משמעותית בציוני NAP. הפחתה זו נמשכה עם מתן חוזר ונשנה של הליך ACHI, אך לא החמירה ליקויים סנסומוטוריים בקבוצת r-mTBI. זה מצביע על כך שמודל ACHI גורם לפציעה קלה המקבילה לזו שנצפתה לאחר זעזוע מוח או תת-זעזוע מוח באוכלוסיות קליניות72,73. יתרון עיקרי של NAP הוא זיהוי ליקויים התנהגותיים עדינים הנראים במסגרת הזמן החריפה לאחר r-mTBI. בדיקה מהירה זו עשויה לאפשר לחוקרים לסווג חולדות על סמך תגובותיהן ההתנהגותיות. עם זאת, השימוש במבחנים התנהגותיים חזקים יותר בנקודות זמן תת-חריפות וכרוניות עשוי להיות נחוץ כדי לזהות סימפטומולוגיות מוטוריות, קוגניטיביות ורגשיות74,75,76. חשוב לציין כי בעוד שלא היו הבדלים בציוני NAP על פני שמונה הפציעות, התנהגות מכרסמים יכולה להיות מושפעת משינויים בסביבה והיכרות עם הנסיין77,78. יש לאפשר לחולדות להתאקלם בחדר ההליכים לפני מתן r-mTBI או פציעות דמה. בנוסף, חשוב שאדם אחד יהיה אחראי לניהול ההשפעות כדי להבטיח עקביות.

למרות היתרונות שהוזכרו לעיל של מודל ACHI, זה לא בלי מגבלות. ראשית, הפרדיגמה תוכננה לחקות הצטברות של פגיעות בפגישה אחת ולא פציעות חוזרות לאחר תקופת החלמה. לאחר הפציעה, המוח שוכן בחלון של פגיעות מוחית הנמשך בין יום אחד לחמישה ימים לאחר הפגיעה במכרסמים 15,79,80. קבלת שמונה פציעות ביום בודד אינה מאפשרת למפל פציעות אקוטי ותת-חריף להתפתח. לכן, בהתאם לשאלת המחקר המעניינת, ייתכן שיהיה צורך להתאים את פרדיגמת הפציעה בתוך חלון הפגיעות. שנית, בעוד שכדאי להגביל את השימוש בחומר הרדמה, תוצאה לא מכוונת של מודל ACHI היא חשיפת החולדות ללחץ ריסון. הוכח כי חשיפה לגורמי עקה חריפים וכרוניים עלולה ליזום תגובה דלקתית, להשפיע על מגוון התנהגויות ולשנות את הפלסטיות הסינפטית בהיפוקמפוס81,82,83.

הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה ברורה לייצור פרוסות היפוקמפוס רוחביות באיכות גבוהה מבעלי חיים המנוהלים על ידי r-mTBI באמצעות מודל ACHI. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים ומראה כי ההיפוקמפוס עדיין מסוגל להפגין פלסטיות סינפטית לאחר r-mTBI, אם כי ייתכנו שיבושים חולפים. עם כל הקלטה אלקטרופיזיולוגית, בריאות הפרוסה היא בעלת חשיבות עליונה ליכולת להקליט fEPSPs מתאימים. כדי לשמר את רקמת המוח, לפני החיתוך, הכרחי שהמוח יישאר קר כקרח ב-aCSF קרבוגני. הסרת המוח וחיתוך המוח צריך להיעשות במהירות, אבל לא אם זה בא על חשבון הטיפול. פרוטוקול זה על בעלי חיים צעירים משתמש ב- aCSF כתמיסת חיתוך, אך בהתאם לגיל החיה, פתרונות חיתוך מגנים (כגון תמיסות מבוססות כולין, סוכרוז, NMDG או גליצרול) עשויות להידרש84,85,86.

רישומים אלקטרופיזיולוגיים בשדה מאפשרים לחוקרים לאמוד את הפלסטיות הסינפטית של ההיפוקמפוס. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לטכניקה. תהליך חיתוך המוח הוכח כגורם לשינויים בעמוד השדרה מספר87, אשר עשויים להשפיע על הפלסטיות הסינפטית. השימוש בהקלטות in vivo ישמר מסלולים ויאפשר מדידה של פלסטיות סינפטית בבעלי חיים מורדמים או חיים88. נוסף על כך, השימוש ברישומי שדה בוחן את התכונות של קבוצות נוירונים, אך אינו מודיע על שינויים בתאי עצב בודדים. השימוש בהקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים יכול לתת מידע מפורט באופן זמני על תכונות עצביות בתגובה למניפולציות פרמקולוגיות או אופטוגנטיות89. בנוסף, השילוב של רישומים אלקטרופיזיולוגיים עם טכניקות משלימות, כגון דימות סידן, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופ אלקטרונים, יאפשר לחוקרים לקבל תובנה לגבי מנגנוני הפעולה.

ליקויים קוגניטיביים מדווחים בדרך כלל בעקבות r-mTBI, והפרוטוקול הנוכחי יכול לעזור לחקור כמה מהתהליכים הפיזיולוגיים הבסיסיים הקשורים לליקויים אלה. בפרט, אופיו המתון של הליך ACHI פותח את האפשרות לבחון שינויים בפיזיולוגיה הסינפטית לאורך תוחלת החיים של בעלי חיים שסבלו מ-r-mTBI. מודל ACHI נראה כמודל תקף מבחינה אקולוגית של mTBI שניתן להשתמש בו כדי לחקור r-mTBI. מחקרים ראשוניים המשתמשים במודל ACHI הראו ליקוי נוירולוגי חריף ללא נזק מבני גלוי, תוך מתן פרדיגמת פציעה חוזרת, אחת, ארבע ושמונה61,90. מחקרים עתידיים יבחנו כיצד mTBI יכול להשפיע על גמישות סינפטית בתקופות התפתחותיות ובמוח מזדקן. על ידי הבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה של mTBI ו-r-mTBI עבור תפקוד סינפטי, התקווה היא לכוון טוב יותר התערבויות טיפוליות פוטנציאליות שיעזרו להפחית את התפקוד הקוגניטיבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לכל חברי מעבדת כריסטי באוניברסיטת ויקטוריה, בעבר ובהווה, על תרומתם לפיתוח פרוטוקול זה. פרויקט זה נתמך במימון המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR: FRN 175042) ו-NSERC (RGPIN-06104-2019). גרפיקת הגולגולת איור 1 נוצרה באמצעות BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 191
הערכת שינויים בפלסטיות סינפטית באמצעות מודל פגיעת ראש סגורה ערה של פגיעה מוחית טראומטית קלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter