Summary
ここでは、海馬のシナプス可塑性に対する軽度の外傷性脳損傷(r-mTBI)の繰り返しの影響を調べるために、覚醒閉鎖頭部損傷モデルをどのように使用できるかを示しています。このモデルは、患者におけるr-mTBIの重要な特徴を再現し、 in vitro 電気生理学と組み合わせて使用 されます。
Abstract
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、北米で一般的な健康問題です。臨床集団への翻訳可能性を高めるために、前臨床環境でクローズドヘッドmTBIの生態学的に有効なモデルを利用するという圧力が高まっています。覚醒閉鎖頭損傷(ACHI)モデルは、修正された制御された皮質インパクターを使用して閉鎖頭損傷を提供し、開頭術や麻酔薬の使用を必要とせずに臨床的に関連する行動障害を誘発します。
この技術は通常、死亡、頭蓋骨骨折、または脳出血を誘発せず、軽度の傷害であることとより一致しています。実際、ACHI手順は軽度であるため、反復mTBI(r-mTBI)を調査する研究に最適です。r-mTBIは、行動症状、神経病理学的変化、および神経変性を引き起こす累積損傷を引き起こす可能性があることを示す証拠が増えています。r-mTBIはスポーツをしている若者によく見られ、これらの損傷は強力なシナプス再編成と髄鞘形成の期間中に発生し、若い人口をr-mTBIの長期的な影響に対して特に脆弱にします。
さらに、r-mTBIは、客観的なスクリーニング手段がほとんどない状態である親密なパートナーの暴力の場合に発生します。これらの実験では、ACHIモデルを使用してr-mTBIを経験した幼若ラットの海馬のシナプス機能を評価しました。損傷後、組織スライサーを使用して海馬スライスを作成し、r-mTBIの1日後または7日後の海馬の双方向シナプス可塑性を評価しました。全体として、ACHIモデルは、mTBIおよびr-mTBI後のシナプス可塑性の変化を研究するための生態学的に有効なモデルを研究者に提供します。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は重大な健康問題であり、カナダと米国では毎年~200万件の症例があります1,2。TBIはすべての年齢層と性別に影響を及ぼし、特に乳がん、エイズ、パーキンソン病、多発性硬化症など、他のどの疾患よりも発生率が高くなっています3。TBIの有病率にもかかわらず、その病態生理学は十分に理解されておらず、治療の選択肢は限られています。部分的には、これはすべてのTBIの85%が軽度(mTBI)に分類されており、mTBIはこれまで、長期的な神経精神医学的影響なしに限定的で一時的な行動変化のみを引き起こすと考えられていたためです4,5。現在、mTBIの回復には数週間から数年かかることがあり、5,6、より深刻な神経学的状態を引き起こし4、繰り返される「脳震盪下」の影響でさえ脳に影響を与えることが認識されています7。ホッケー/サッカーなどのスポーツのアスリートは、ゲーム/練習セッションごとに>10頭の脳震盪の影響があるため、これは憂慮すべきことです7,8,9,10。
青年はmTBIの発生率が最も高く、カナダでは、10代の若者の約10人に1人が毎年スポーツ関連の脳震盪の治療を求めています11,12。実際には、脳震盪以下の頭部衝撃またはmTBIは、脳にびまん性損傷を引き起こす可能性があり、これはまた、その後の損傷および/またはより深刻な神経学的状態に対してより脆弱な状態を作り出す可能性があります13、14、15、16、17。カナダでは、ローワンの法則により、以前の損傷が脳のさらなる損傷に対する脆弱性を高める可能性があることが法的に認められていますが18、r-mTBIの機構的理解は依然としてひどく不十分です。しかし、シングルおよびr-mTBIは、学年19,20の学習能力に影響を与え、性別固有の結果21,22,23,2 4を持ち、後年の認知能力を損なう可能性があることは明らかです16,25,26。実際、コホート解析では、r-mTBIの早期性と認知症の後期が強く関連している27,28。r-mTBIはまた、高リン酸化タウタンパク質の蓄積と進行性の皮質萎縮を特徴とし、重大な炎症によって沈殿する慢性外傷性脳症(CTE)に関連している可能性があります27,29,30,31。r-mTBIとCTEの関係は現在議論の余地がありますが32、このモデルにより、前臨床環境でより詳細に調査できるようになります。
mTBIは、閉じた頭蓋骨内で発生し、最新のイメージング技術でも検出が難しいため、「目に見えない損傷」とよく説明されます33,34。mTBIの正確な実験モデルは、2つの原則に従う必要があります。第1に、臨床集団35において通常観察される生体力学的力を要約すべきである。第二に、モデルは異質な行動結果を誘発するはずであり、これは臨床集団でも非常に普及している36,37,38。現在、前臨床モデルの大部分はより重症である傾向があり、開頭術、定位固定術、麻酔、および制御された皮質衝撃(CCI)が含まれ、臨床的に通常観察されるよりも重大な構造的損傷とより広範な行動障害を引き起こします33。開頭術を伴う脳震盪の多くの前臨床モデルの別の懸念は、この手順自体が脳に炎症を引き起こし、これがその後の損傷からmTBI症状と神経病理を悪化させる可能性があることです39,40。麻酔はまた、炎症の軽減41、42、43、ミクログリア機能の調節44、グルタミン酸放出45、NMDA受容体を介したCa2+侵入46、頭蓋内圧、および脳代謝47を含むいくつかの複雑な交絡因子を導入する。麻酔はさらに、認知機能を低下させながら、血液脳関門(BBB)透過性、タウ過剰リン酸化、およびコルチコステロイドレベルを増加させることによって交絡を導入します48,49,50,51。さらに、びまん性の閉鎖性損傷は、臨床mTBIの大部分を占めています52。また、性別21、53歳、負傷間隔15、重症度54、負傷数23など、行動の結果に影響を与える可能性のある多数の要因をよりよく研究することもできます。
加速力/減速力(垂直または水平)の方向も、行動的および分子的結果にとって重要な考慮事項です。Mychasiukらの研究では、拡散性閉鎖頭mTBIの2つのモデル、重量減少(垂直方向の力)と横方向の衝撃(水平方向の力)を比較しました55。行動解析と分子解析の両方で、mTBI後のモデルおよび性別依存の不均一な結果が明らかになりました。したがって、直線力と回転力を組み込んでいる間、外科的処置を回避するのに役立つ動物モデルは、これらの損傷が通常発生する生理学的条件をより代表しています33,56。ACHIモデルはこのニーズに応えて作成され、性差を偏らせることが知られている手順(すなわち麻酔)を回避しながら、ラットにおけるmTBIの迅速かつ再現性のある誘導を可能にしました57。
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Protocol
すべての動物の手順の承認は、カナダ動物管理評議会(CCAC)の基準に準拠して、ビクトリア大学動物管理委員会によって提供されました。すべてのオスのLong-Evansラットは、社内で飼育または購入されました( 資料表を参照)。
1.住居と繁殖条件
- 動物が生後(PND)21で離乳する前に、動物を1週間住居環境に順応させます。
- ラットを22.5°C±2.5°Cの標準的なケージハウジングに維持し、12時間の明暗サイクルで餌と水を 自由 にアクセスできるようにします。
- 2人または3人の性別が一致した同腹仔と動物をグループ化して収容し、偽またはr-mTBI条件のいずれかにランダムに割り当てます。
- 午前 7 時 30 分から午後 11 時 30 分の間にすべての手順を実行します。
2.覚醒閉鎖頭部外傷手順のセットアップ
- 位置 a 2.75 インチインパクターの下に低密度フォームパッド(100 cm x 15 cm x 7 cm)があり、回転ヘッドの動きを可能にします。
注:フォームパッドのバネ定数は~2,500 N / mでしたが、3,100〜5,600 N / m58の間で変化する可能性があります。硬さのレベル(低、中、高)は、怪我の結果を予測することは示されていません59。フォームパッドは非消耗品です。通常、毎年、または汚れたり損傷したりした場合は交換されます。 - 変更された皮質衝撃装置(図1A)の電源を入れ、速度を6 m / sに設定します。
注:これらの仕様は、mTBIの特徴に類似した若年および青年期の高齢ラットの急性神経障害を引き出すように設計されていますが、そのようなパラメーターは、高齢の動物または他の種(マウスやフェレットなど)には適さない場合があります。一般的なACHIパラメータのレビューについては、60を参照してください。
3. mTBIの導入
- ラットがPND 24に達したら、手順が実行される手順室に移動します。この部屋が通常の住宅環境から離れていることを確認してください。
- ラットを拘束コーンにそっと置き、鼻と鼻孔がコーンの小さな開口部の近くにあることを確認して、適切な換気を可能にします。プラスチック製のヘアクリップを使用して、ラットを拘束コーンに入れた後の動きを防ぐために、尾端でコーンを閉じたままにします。
- 拘束スコアを使用して、拘束コーンおよびACHI手順に対する動物のコンプライアンスまたは耐性を記録します。
注:拘束スコアは、動物のストレスの評価として使用できます。したがって、過度のストレス応答のために生じる被験者間の変動性を減らすために、拘束スコアを使用して除外基準を開発することができる。- 円錐に入る動物の意欲、その動き、および発声に基づいて、0から4までのスコアを与えます。拘束に抵抗がない場合はスコア0を与え、スコア1は動物が1〜2倍になり、発声や身もだえがほとんどまたはまったくないことに対応します。動物が2〜3倍になり、発声や身もだえを示す場合は、スコア2を付けます。動物が5〜10倍になり、より多くの発声と身もだえを示す場合は、拘束スコア3を与えます。最後に、動物が頻繁な発声と身もだえで10倍以上回転した場合は、4のスコアを与えます。
注:この情報は、スコアリングシート自体(補足表S1および補足表S2)にもあります。
- 円錐に入る動物の意欲、その動き、および発声に基づいて、0から4までのスコアを与えます。拘束に抵抗がない場合はスコア0を与え、スコア1は動物が1〜2倍になり、発声や身もだえがほとんどまたはまったくないことに対応します。動物が2〜3倍になり、発声や身もだえを示す場合は、スコア2を付けます。動物が5〜10倍になり、より多くの発声と身もだえを示す場合は、拘束スコア3を与えます。最後に、動物が頻繁な発声と身もだえで10倍以上回転した場合は、4のスコアを与えます。
- 拘束スコアを使用して、拘束コーンおよびACHI手順に対する動物のコンプライアンスまたは耐性を記録します。
- ラットが拘束されている間に、ヘルメットを手動で正中線の上に配置します(図1B)、ターゲットディスクを左頭頂葉の上に配置します(図1C、D)。
- ラットをフォームパッドに置き、インパクターを手動で延長位置に設定します。インパクターの先端を手動で下げて、ヘルメットのターゲティングディスクに接触するようにします。インパクターを手動でリトラクト位置に設定して、インパクターをヘルメットから10mm上に引き出します。
- 脳定位固定装置アームのダイヤルを使用して、インパクトチップを10 mm下げ、ヘルメットのターゲティングディスクに再び触れるようにします。 インパクト スイッチを切り替えて、動物の頭が10 m / sで6 mm急速に加速されるようにします。
- デバイスがアクティブになったら、すぐに動物を拘束コーンから取り外し、即時神経学的評価プロトコル(NAP)の実行に進みます。
注:現在の実験では、このプロトコルを2時間間隔で合計8回繰り返しました。
4.偽傷害の誘発
- 上記のセクション3で説明したすべての実験手順に従いますが、ラットをインパクトピストンの経路に隣接して配置して、怪我をしないようにします。
5.神経学的評価プロトコル
注:NAPは、意識レベル、ならびに認知および感覚運動機能を測定するために使用できます。
- ベースライン時およびmTBIまたは偽損傷の誘発直後に、56,61に記載されているようにNAPを使用してラットを評価する。テーブルの上に、ラットのホームケージと100 cm間隔を空けた回復ケージを置きます。平均台を両方のケージの上に均等に中央に配置します。さらに、折りたたんだタオルまたは追加のクッションを平均台の下に置きます。
- 必要に応じて、 意識レベルを評価します。mTBI後に動物が反応しない場合は、ストップウォッチを使用して動物が呼吸を再開したり、仰臥位から腹臥位になったりするのにかかった時間を記録することにより、 無呼吸 (呼吸の停止)と 右反射 の遅延を評価します。
注:ACHIモデルでは、右反射と無呼吸の喪失はまれですが、幼若動物で時折観察されることがあります。 - 次の一連のテストを使用して、ラットの 認知および感覚運動機能を 評価します。意識の評価に続いて、これらのテストを連続して迅速に実施します。
注:これら4つのテストの合計は、観察された行動障害がない場合、12点満点の合計スコアをもたらします。赤字はこのスコアを損ないます。- 驚愕の反応
- ラットを空の回復ケージに入れ、ケージの上で大声(50 cm)たたきます。次のスコアリングシステムを使用して、ノイズに対する動物の反応を記録します。
3 =音に対する素早い驚愕反応(例:耳の動き/けいれん、ジャンプ、全身のフリーズ)。
2 =音に対する反応が遅い、またはわずかに凍結する反応。
1 =耳の動きのみが観察されます。
0 = 音に反応しない。
- ラットを空の回復ケージに入れ、ケージの上で大声(50 cm)たたきます。次のスコアリングシステムを使用して、ノイズに対する動物の反応を記録します。
- 四肢伸展
- 梁(長さ100 cm x 幅2 cm x 厚さ0.75 cm)をラットの家と回復ケージに水平に置いた状態で、尾の付け根でネズミを拾い上げ、梁の近くに保持します。ラットが簡単につかむことができるほど十分近くにいることを確認してください。次のスコアリングシステムを使用して、両方の手足をビームまで伸ばすラットの能力を評価します。
3 =両方の前肢を完全に伸ばし、ビームをつかみます。
2 = 片方の手足だけが伸びています。
1 =前肢の断続的な伸展または収縮。
0 = 前肢はぐったりしている/伸展なし。
- 梁(長さ100 cm x 幅2 cm x 厚さ0.75 cm)をラットの家と回復ケージに水平に置いた状態で、尾の付け根でネズミを拾い上げ、梁の近くに保持します。ラットが簡単につかむことができるほど十分近くにいることを確認してください。次のスコアリングシステムを使用して、両方の手足をビームまで伸ばすラットの能力を評価します。
- ビームウォーク
- 動物を水平ビームの中央、ホームケージに面した50 cmのマークに置きます。ビームがラットのホームケージと回収ケージ(~80 cm離れて配置)の間に等間隔に配置されていることを確認します。ラットが梁を横切って歩くのを待ちます。次のスコアリングシステムでバランスを取り、歩くラットの能力を評価します。
3 = 10秒以内に2フィート未満のスリップでビームを横切ることに成功します。
2 = ビームを正常に歩行しますが、2 フィートを超えるスリップが観察されます。
1 =非機関車の動き、「水泳」の動き。
0 = ビームに沿って歩くことができないか、10秒以内に移動できません。
- 動物を水平ビームの中央、ホームケージに面した50 cmのマークに置きます。ビームがラットのホームケージと回収ケージ(~80 cm離れて配置)の間に等間隔に配置されていることを確認します。ラットが梁を横切って歩くのを待ちます。次のスコアリングシステムでバランスを取り、歩くラットの能力を評価します。
- 回転ビーム
- ラットをビームの中心に再配置し、ラットのバランスが取れていることを確認します。ビームをタオルまたはパッド入りの表面から80 cm持ち上げ、ビームを毎秒1回転の速度で4秒間手動で回転させ始めます(合計4回転)。次のスコアリングシステムで、ラットが回転するときにビーム上に留まるラットの能力を評価します。
3 = ラットは4回転すべてビーム上に残ります。
2 =ラットは4番目の回転に落ちます。
1 =ラットは2番目または3番目の回転に落ちます。
0 = ラットは最初の回転中に落下します。
- ラットをビームの中心に再配置し、ラットのバランスが取れていることを確認します。ビームをタオルまたはパッド入りの表面から80 cm持ち上げ、ビームを毎秒1回転の速度で4秒間手動で回転させ始めます(合計4回転)。次のスコアリングシステムで、ラットが回転するときにビーム上に留まるラットの能力を評価します。
- 驚愕の反応
- NAPが完了したら、mTBIと偽ラットをホームケージに戻します。必要に応じて、r-mTBI手順を繰り返します。ケージサイドモニタリングチェックリスト(補足ファイル1)を使用して、怪我をした後の動物の健康状態を監視します。ケージ側のモニタリング中に異常の兆候(N以外のスコア)がある場合は、頭の衝撃後の痛みの尺度と高度なモニタリングチェックリスト(補足ファイル2)を使用して完全な痛みのスコアを取得する必要があります。
6.スライスの準備
注:現在の研究では、シナプス可塑性は、mTBIの1日後または7日後にr-mTBI後の動物で評価されました。これらの日、動物は犠牲になる前に屋根付きのケージで個別に実験室に運ばれました。
- 海馬スライスの作成に必要なすべての手術器具(標準はさみ、解剖ハサミ、鉗子、ロンジャー、ヘラ、および冷却ブロック)を一晩冷蔵(-20°C)します。
注意: ティッシュグルーとインキュベーションチャンバーは冷蔵しないでください。 - 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaHPO 4、25 mM NaHCO 3、2 mM CaCl 2、1.3 mM MgCl 2、および10 mM デキストロース(300 ± 10 mOsm、pH 7.2-7.4)を含む人工脳脊髄液(aCSF)を調製します。
注:aCSFの主な溶液は、プロトコルの期間中、カルボゲン(95%O 2 / 5%CO2)で連続的にバブリングする必要があります。 - 動物を安楽死させる前に(ステップ6.8)、12.5 mLのアガロースを準備します。0.25 gのアガロースを12.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に、50 mLのコニカルチューブに10秒刻みでマイクロウェーブして溶解します。
- アガロースを保温(42°C)し、固まらないように加熱プレートで振ってください。
- 氷冷したaCSF(4°C)で満たされたペトリ皿と小さなビーカー(50 mL)、および濡れたろ紙を上に置いたひっくり返したペトリ皿を含む、氷上にカッティングステーションを設置します(図2A)。小さなビーカーのaCSFをカルボゲンで連続的に泡立てます。
- 水浴を32°Cに温める。 回収チャンバーにaCSFを満たし、カルボゲンで連続的にバブリングします(図2B)。
- 動物を実験室に輸送する。
- 吸入剤として5%イソフルランを使用して動物を麻酔し(離脱反射がなくなるまで)、次に小さなギロチンを使用して迅速に断頭する。
- 氷冷(4°C)のaCSFで満たされたペトリ皿で頭蓋骨から脳を解剖し、頭蓋骨をaCSFに沈めたままにして、組織を急速に冷却します。
注:この手順は通常5分未満を必要としますが、脳が冷えたaCSFに沈められている場合、脳の除去速度は重要な要素ではありません。 - 冷やして炭水化物化したaCSFの小さなビーカーに脳を入れて、サンプルをさらにきれいにして冷やします。
- 脳を逆さまのペトリ皿に移動し、ろ紙の上に置きます。鋭いメスを使用して小脳と前頭前野を取り除き、脳を「ブロック」します。脳の正中線を切り取って、2つの半球を分離します。
注意: 次のプロトコルは、一度に1つの半球で実行されます。現在準備されていない半球は、氷冷(4°C)の炭素化aCSFのビーカーに沈んだままであることが不可欠です。 - 海馬横スライスを作成するには、半球を内側面に置きます。メスの刃を~30°内側に傾け、脳の背側表面から薄いスライスを取り除き、スライサーが使用するピストンに取り付ける脳の平らな面を提供します。脳を背側にひっくり返し、乾いたろ紙で組織を軽くたたいて、余分なaCSFを取り除きます。シアノアクリレート接着剤を使用して、脳の背側表面をピストンに取り付け、腹側表面を直立させます。
注意: 接着剤がアガロースを収容するために使用される金属管に付着し、ピストンの動きを妨げるため、接着剤がピストンの端を越えないようにしてください。 - ピストンの外側のチューブを脳の上に伸ばし、脳が完全に覆われるまで液体アガロースをチューブに注ぎます。ピストンチューブに冷却ブロックをクランプして、アガロースをすばやく固化させます(図2A)。
- ピストンをスライサーのチャンバーに配置し、チャンバーをネジで固定します。ブレードを固定し、氷冷した酸素化aCSFをスライサーチャンバーに追加します。
- スライサー(図2B)で、 切削速度 を 4、 振動 を 6に設定し、連続 /単一スライススイッチ を 連続に切り替えます。プッシュ スタート して、 400μmで脳の切片化を開始します。
- 脳を切片化するスライサーとして、大口径パスツールピペットを使用して、各スライスを切片化した酸素化aCSFの回収浴に移します(図2C)。
注:各スライスがカットされると、回収浴の異なるウェルに順次配置できます。このプロトコルは通常、各半球の海馬を含む6〜8スライスを生成します。ラットアトラス62 は、ラット脳内の個々のスライスの背側腹側位置を識別するために使用することができる。 - スライスを32°Cで30分間回復させた後、室温(23°C)でさらに30分間回復させます。
- これらの手順を繰り返して、2 番目の半球からスライスを作成します。
7.フィールド電気生理学
注:歯状回(DG)から細胞外視野記録を取得するには、次の手順を実行します。60分の回復後、個々の海馬スライスは細胞外フィールド記録の準備ができています。
- 市販のマイクロピペットプーラーを用いて、外径1.5mm、内径1.1mmの10cmホウケイ酸ガラスキャピラリーから記録電極(1-2MΩ)を引き抜く。
注:記録電極の抵抗は~1MΩで、先端のサイズは~1mmである必要があります。電極パラメータの一貫性は、良好な記録のために重要です。 - 録音に使用するコンピューターと機器(アンプ、デジタイザー、刺激装置、マイクロマニピュレーター、温度調節器、顕微鏡ライト、真空ポンプ)の電源を入れます。
- ビーカーにaCSFを満たし、重力制御灌流システムに接続します。灌流システムのaCSFバルブを開いて、灌流チャンバーを通るaCSFの流れを開始します。約1回または2回の滴下/秒または2mL/分の流量を維持します。電気生理学的記録の期間中、aCSFを継続的にカルボゲン化します。
注意: フィールドレコーディング中は、炭水化物化されたaCSFの滴下速度を一定に保つことが不可欠です。また、参照電極をaCSFに完全に沈めることも不可欠です。 - パスツールピペットを使用して、海馬スライスを回収浴から灌流チャンバーに移し、灌流チャンバーに炭水化物化aCSFを連続的に灌流し、30 ± 0.5°Cに維持します。 歯状回と顆粒細胞層が視野に見えるように脳スライスの向きを変えます。曲がったワイヤーウェイトでスライスを安定させます。データ収集用のコンピュータソフトウェアを起動します。
注意: このステップ中に真空ポンプをオフにすると、組織を自由に操作できるようになります。操作が多すぎると組織が損傷する可能性があるため、これは迅速に行う必要があります。さらに、灌流チャンバーは、時間がかかりすぎるとCSFでオーバーフローする可能性があります。組織が適切に向き付けられて安定したら、真空ポンプをオンにします。 - 正立顕微鏡を使用して、斜め光学系でDGを視覚化します。同心円バイポーラ刺激電極を配置して、分子層の中央3分の1の内側穿孔経路(MPP)繊維を活性化します。次いで、ガラス製マイクロピペットを置き、MPP中にaCSFを充填した(図3A、B)。組織に触れると繊維が損傷するため、電極をさらに離して開始します(つまり、CA3の近くの刺激電極とDGの属のすぐ上の記録電極)。
注:最適には、すべての記録では、電極をセル層から等距離、約200μm離して配置する必要があります。 - 刺激電極と記録電極を配置したら、アンプ、デジタイザ、および記録ソフトウェアを使用して、誘発された電界応答を視覚化します。
- 適切な場興奮性シナプス後電位(fEPSP)を見つけるには、ユーザーが反応を見つけるのに熟練している場合は0.2 Hz(5秒ごと)で0.12 msの電流パルスで組織を刺激し、熟練していないユーザーの場合は0.067 Hz(15秒ごと)で組織を刺激して過剰刺激を避けます。fEPSP の最小振幅が 0.7 mV で、クリア・ファイバ・ボレーが fEPSP よりも小さいことを確認します。
注:最大の電界応答を得るには、両方の電極をセル層から等距離に配置し、小さなファイバーボレーを生成するのに十分な距離(つまり、~200μm)に配置することが重要です。電極位置のわずかな調整は、応答の振幅を高めるのに役立つ場合がありますが、組織の損傷を避けるために、これらは最小限に抑える必要があります。 - 刺激強度を上げて最大fEPSP振幅を決定し、fEPSPが最大振幅の70%になるようにシミュレーション強度を設定します。
注:最大振幅は、長期うつ病(LTD)研究では70%、長期増強(LTP)研究では50%に設定されています。最大振幅は、fEPSPの振幅が増加しなくなるまで刺激強度を調整することによって決定されます。最大振幅が2 mVのfEPSPの場合、応答サイズは、fEPSPがそれぞれ低下または増強する余地を確保するために、LTDスタディでは1.4 mV、LTPスタディでは1.0 mVに調整されます。 - 0.067Hzで0.12msのパルスを供給して、20分間安定したプレコンディショニングベースラインを確立します。スライスが安定していると見なされるには、fEPSPの初期傾きの変動が<10%であり、プロットされたfEPSPの傾きを通る最適適合線の傾きが<0.5であることを探します。EPSP が 20 分間安定していることが確認されたら、記録の次のステップに進みます。
注:さまざまな受容体アンタゴニストをaCSFに追加して、LTDおよびLTPをブロックまたは増強することができます。必要な場合は、このベースライン期間中にスライスがこれらの薬理学的物質にさらされ、安定した記録の要件が満たされていることを確認してください。.例については、63、64、65を参照してください。 - まず、ペアパルス刺激を使用し、刺激-応答の入出力曲線を構築することにより、基本的なシナプス特性の変化を決定します。ペアパルステストでは、0.033Hzで50msのパルス間隔を持つ一連のペアパルスを適用します。入出力曲線には、0.033Hzで刺激強度が増加するシリーズ(10)(0.0-0.24ms)を適用して、fEPSP応答サイズの変化をプロットします。
- CB1受容体64,66の活性化に主に依存するLTDを研究するには、10Hzプロトコル(10Hzで6,000パルス)を採用します。このプロトコルの管理には 10 分かかります。
- ポストコンディショニング録音の場合は、シングルパルス刺激(0.067 Hzの周波数で0.12 ms)をさらに60分間使用を再開します。
- ポストコンディショニング記録に続いて、再びペアパルス刺激を行い、続いて入出力曲線を投与します。これらをベースライン記録と比較して、シナプス前放出特性の変化を観察し、長期記録のスライスの健全性を評価するのに役立ちます。
- 分析中は、個々のスライスからのデータをシナプス可塑性データセットに保持する必要があるかどうかを判断するときは、保守的であり、除外基準に従ってください。プレコンディショニングベースライン中のfEPSPスロープの最適適合ラインに大きなスロープ(スロープ>0.5)、プレコンディショニングベースラインの不安定性(>10%の変化)、またはポストコンディショニング期間の不安定性(ポストコンディショニングの50〜60分でスロープ>1.5)を示すスライスを除外します。
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Representative Results
覚醒閉鎖頭部損傷モデルは、幼若ラットにおいてr-mTBIを誘導する実行可能な方法である。ACHIモデルでr-mTBIに曝露されたラットは、明白な行動障害を示さなかった。これらの実験の被験者は、r-mTBI手順中のどの時点でも右への潜時または無呼吸を示さず、これが実際に軽度のTBI手順であったことを示しています。NAPでは微妙な行動の違いが現れました。上記のように、ラットは、0から3までのスケールで4つの感覚運動課題(驚愕反応、四肢伸展、ビーム歩行、および回転ビーム)でスコアリングされ、3はタスクに障害がないことを表した。したがって、NAPスコアが低いほど、動物はより障害がありました。ベースラインでは、偽ラットとr-mTBIラットの間でNAPスコアに差はありませんでした。.すべてのACHIセッションの後、r-mTBIラットは、偽と比較してNAPタスク内で有意な障害を示しました(図4)。しかし、複数日(すなわち、2日または4日)にわたってもたらされた影響について以前に報告されたように、その後の1日にわたる傷害の追加は、追加の行動障害を悪化または生成しなかった。したがって、r-mTBIのACHIモデルは、これらの急性の損傷後の時点で、微妙でありながら重大な行動障害を引き起こします。
損傷プロトコルに続いて、誘発された野外応答とシナプス可塑性が、損傷後1日目の海馬のDGへのMPP入力(PID1)およびPID7で調べられました。スライスの健全性は、各スライスにおけるパルス幅の上昇系列に応答してfEPSPを用いて調べた。 図3Cに示すように、偽ラットとr-mTBIラットから得られたスライスで生成された入出力曲線に差はありませんでした。シナプス前伝達物質の放出を調べるために、一連のペアパルス(50ミリ秒のパルス間隔)を投与し、第1のfEPSPに対する第2のfEPSPのサイズの比を計算した。ペアパルス比は、偽ラットとr-mTBIラットの間で差はありませんでした(図3D)。したがって、これらのデータは、r-mTBIがDGへのMPP入力の基本的なシナプス生理機能を変化させなかったことを示しています。LTDを調べるために、10HzのLTDプロトコルを投与して、内在性カンナビノイドに依存するLTDを誘導しました64。PID1では、LTDを維持するためにDGへのMPP入力の容量が大幅に減少しました(図3E)。しかし、このLTDの減少は一時的なものであり、PID7では、偽動物およびr-mTBI動物からのスライスは同等のLTD(図3F)を示しましたが、r-mTBI動物からのスライスがLTDの増加を示すわずかな傾向が示されました。
図1:r-mTBIをモデル化するために使用されたACHI手順のセットアップ 。 (A)修正された制御された皮質インパクターを使用して、動物の頭を6.0 m / sの速度で10 mm急速に変位させました。 (B、C)左頭頂皮質の標的部位を備えたカスタム3Dプリントヘルメット。(D)被験者は、フォームプラットフォーム上のプラスチック製の拘束バッグに入れられ、ヘルメットは拘束コーンの周りに置かれ、標的部位がインパクターチップの真下になるように配置されました。略語:ACHI =覚醒した閉鎖性頭部外傷;r-mTBI =軽度の外傷性脳損傷を繰り返す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:スライスの準備に必要な材料とセットアップ。 (A)脳の抽出、取り付け、スライス、およびインキュベーションに使用されるツール:(a)ろ紙を含む培養皿;(b)標準的なはさみ、解剖はさみ、鉗子、ロンゲール、およびヘラを含むさまざまな解剖ツール。(c)組織接着剤;(d)圧縮ピストンおよび試験片チューブ。(e)羽毛ブレードおよびブレードホルダー。(f)冷却ブロック;(g)スライスインキュベーションチャンバー。(B)圧縮トーム組織スライサー。(c)95%O2/5%CO2で連続的に酸素化された人工脳脊髄液を含む浴中でインキュベートするスライス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ACHIモデルを用いたr-mTBIによる若年雄ラットのシナプス可塑性の急性障害 。 (A)主要な海馬経路。内側穿孔経路は、嗅内皮質から歯状回(青色)への入力で構成されています。内側穿孔経路は、歯状回(紫色)の顆粒細胞にシナプスを入力します。(B)海馬脳スライスの明視野顕微鏡写真(倍率4倍)、歯状回の内側性能経路におけるバイポーラ刺激電極(左)とガラス記録電極ピペット(右)の実際の配置を示す。(C)偽ラットおよびr-mTBIラットのPID1およびPID7の異なるシミュレーション強度(10〜300μs)の入出力プロット(fEPSPスロープ)。(D)偽ラットとr-mTBIラットのペアパルス比(50ミリ秒のインターパルス間隔)。(E)PID1の偽およびr-mTBIラットから得られた海馬スライスにおけるLTD誘導パラダイムの投与前および投与後のfEPSPの時間経過変化。(F)PID7の偽およびr-mTBIラットから得られた海馬スライスにおけるLTD誘導パラダイムの投与前および投与後のfEPSP変化の時間経過。略語:ACHI =覚醒した閉鎖性頭部外傷;r-mTBI =軽度の外傷性脳損傷を繰り返す。PID =負傷後の日。fEPSP =電磁界興奮性シナプス後電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ACHIモデルを用いたr-mTBIによる若年雄ラットの急性神経障害。 ラットは、ベースライン時および各損傷後に神経学的評価プロトコルを実施して、1日にわたって2時間間隔で8回のACHI手順を受けました。NAPは、驚愕応答、四肢伸展、ビーム歩行、回転ビームの4つのタスクで構成されていました。各タスクは3点満点中採点され、各セッションで合計12点のスコアが与えられました。SEM±平均値として提示されるデータ(*)は p <0.05を示す。略語:ACHI =覚醒した閉鎖性頭部外傷;r-mTBI =軽度の外傷性脳損傷を繰り返す。NAP =神経学的評価プロトコル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表S1:ACHI手順動物および影響情報。 略称:ACHI =覚醒した閉鎖性頭部外傷。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:覚醒mTBIの拘束スコアリング。 略称:mTBI =軽度の外傷性脳損傷。「拘束して向きを変える」とは、研究者が尾の周りのバッグを閉じる前に、動物を拘束具に置くことを指します。袋を閉じた後、動物は向きを変えることができないはずです。発声と身もだえは、バッグを閉じた後にスコアを付ける必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ケージ側の監視チェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:痛みのスケールと高度なモニタリングチェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ほとんどの前臨床研究では、臨床集団に見られる生体力学的力を再現しないmTBIのモデルを利用しています。ここでは、ACHIモデルを使用して幼若ラットにr-mTBIを誘導する方法が示されています。r-mTBIのこのクローズドヘッドモデルは、より侵襲的な手順に比べて大きな利点があります。第一に、ACHIは通常、頭蓋骨骨折、脳出血、または死亡を引き起こさず、これらはすべて臨床集団における「軽度の」TBIの禁忌となる61。第二に、ACHIは開頭術の使用を必要としませんが、これは症状や神経病理学を悪化させる可能性のある炎症反応を引き起こすことが知られているため重要です67。第三に、ACHIは麻酔の使用を必要としません。麻酔は神経保護特性を持ち、学習と記憶能力に加えてシナプス可塑性を損なう可能性があるため、これも重要です48,49,50,51,68。最後に、ACHIは、損傷直後に評価できる神経機能に微妙な一時的な変化を引き起こす可能性があります。
ACHIは通常、意識喪失や無呼吸を誘発しないため、このモデルは臨床集団のかなりの割合でmTBIを模倣しています69,70,71。それにもかかわらず、ACHIモデルはNAPスコアの有意な減少をもたらした。この減少は、ACHI手順の反復投与で持続しましたが、r-mTBIグループ内の感覚運動障害を悪化させませんでした。.これは、ACHIモデルが、臨床集団における脳震盪性または亜脳震盪性の頭部衝撃の後に観察されたものと同様の軽度の傷害を誘発することを示している72,73。NAPの主な利点は、r-mTBI後の急性時間枠で見られる微妙な行動障害の検出です。この迅速な検査により、研究者は行動反応に基づいてラットを分類できる可能性があります。しかし、亜急性および慢性の時点でのより堅牢な行動テストの使用は、運動、認知、および感情の症状を検出するために必要かもしれません74、75、76。8つの傷害にわたってNAPスコアに差はなかったが、げっ歯類の行動は環境の変化および実験者77,78との親しみやすさによって影響を受ける可能性があることに注意することが重要です。ラットは、r-mTBIまたは偽の怪我を投与する前に、処置室に順応させる必要があります。.さらに、一貫性を確保するために、1人の個人が影響を管理する責任を持つことが重要です。
前述のACHIモデルの利点にもかかわらず、制限がないわけではありません。まず、パラダイムは、回復期間後の反復的な怪我ではなく、単一のセッションでの衝撃の累積を模倣するように設計されました。損傷後、脳はげっ歯類の損傷後1〜5日で広がる脳の脆弱性のウィンドウに存在します15,79,80。特異な日に8つの傷害を受けた場合、急性および亜急性の傷害カスケードが発生することはできません。したがって、関心のある研究課題によっては、脆弱性のウィンドウ内で傷害パラダイムを調整する必要がある場合があります。第二に、麻酔薬の使用を制限することは有益ですが、ACHIモデルの意図しない結果は、ラットを拘束ストレスにさらすことです。急性および慢性のストレッサーへの曝露は、炎症反応を開始し、さまざまな行動に影響を及ぼし、海馬のシナプス可塑性を変化させる可能性があることが示されています81,82,83。
上記のプロトコルは、ACHIモデルを用いてr-mTBI投与動物から高品質の海馬横断スライスを生成するための明確な方法を提供します。さらに、このプロトコルは安定した電気生理学的記録を可能にし、一過性の混乱があるかもしれないが、海馬がr-mTBI後もシナプス可塑性を示すことができることを示しています。電気生理学的記録では、適切なfEPSPを記録する能力のためにスライスの健全性が最も重要です。脳組織を保存するには、スライスする前に、脳が炭水化物化されたaCSFで氷のように冷たいままであることが不可欠です。脳の除去とスライスは迅速に行われるべきですが、これがケアを犠牲にしている場合はそうではありません。幼若動物に対するこのプロトコルは、切断溶液としてaCSFを利用するが、動物の年齢に応じて、保護切断溶液(コリン、スクロース、NMDG、またはグリセロールベースの溶液など)が必要な場合がある84,85,86。
野外電気生理学的記録により、研究者は海馬シナプス可塑性を測定することができます。ただし、この手法にはいくつかの制限があります。脳をスライスするプロセスは、シナプス可塑性に影響を与える可能性のある脊椎番号87の変化を引き起こすことが示されています。 in vivo 記録の使用は経路を保存し、麻酔された動物または生きた動物のシナプス可塑性の測定を可能にします88。さらに、フィールド記録の使用は、ニューロンのグループの特性を調査しますが、個々のニューロンの変化については通知しません。全細胞パッチクランプ記録の使用は、薬理学的または光遺伝学的操作に応答してニューロンの特性に関する時間的に詳細な情報を与えることができる89。さらに、電気生理学的記録とカルシウムイメージング、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、電子顕微鏡などの補完的な技術を組み合わせることで、研究者は作用機序についての洞察を得ることができます。
認知障害はr-mTBIの後に一般的に報告されており、現在のプロトコルは、これらの欠陥に関連する根本的な生理学的プロセスのいくつかを調査するのに役立ちます。特に、ACHI手順の穏やかな性質は、r-mTBIを患った動物の寿命にわたるシナプス生理学の変化を調べる可能性を開きます。ACHIモデルは、r-mTBIの研究に使用できるよりも生態学的に有効なmTBIモデルであるように思われます。ACHIモデルを利用した予備研究では、明白な構造的損傷のない急性神経障害が示され、1つ、4つ、および8つの反復損傷パラダイムが投与されました61,90。今後の研究では、are-mTBIが発生期および老化した脳のシナプス可塑性にどのように影響するかを調べます。シナプス機能に対するmTBIとr-mTBIの病態生理学をよりよく理解することにより、認知機能の低下に役立つ潜在的な治療介入をより適切に指示することが期待されています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ビクトリア大学のクリスティ研究所のすべてのメンバーに、過去と現在のこのプロトコルの開発への貢献に感謝します。このプロジェクトは、カナダ健康研究所(CIHR:FRN 175042)およびNSERC(RGPIN-06104-2019)からの資金提供を受けて支援されました。 図1 の頭蓋骨グラフィックは、BioRenderで作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed helment | Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) | ||
| Agarose | Fisher Scientific (BioReagents) | BP160500 | |
| Anesthesia chamber | Home Made | N/A | Plexiglass Container |
| Automatic Heater Controller | Warner Electric | TC-324B | |
| Axon Digidata | Molecular Devices | 1440A | Low-noise Data Acquisition System |
| Balance beam | Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick) | ||
| Calcium Chloride | Bio Basic Canada Inc. | CD0050 | For aCSF |
| Camera | Dage MTI | NC-70 | |
| Carbogen tank | Praxair | MM OXCD5C-K | Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95% |
| Clampex Software | Molecular Devices | Clampex 10.5 Version | |
| Compresstome Vibrating Microtome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC Inc. | CBAPC75 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific (Chemical) | D16-3 | aCSF |
| Digital Stimulus Isolation Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 4D | |
| Disodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S373-500 | PBS |
| Dissection Tools | |||
| Feather Double Edge Blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-10 | |
| Filter Paper | Whatman 1 | 1001-055 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Hair Claw Clip | Can be obtained from any department store | ||
| Home and Recovery Cages | Normal rat cages from animal care unit. | ||
| Hum Bug Noise Eliminator | Quest Scientific | 726300 | |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Isotemp 215 Digital Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-15 | |
| Leica Impact One CCI unit | Leica Biosystems | Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip | |
| Long-Evans rats, male | Charles River Laboratories (St. Constant, PQ) | ||
| Low-Density Foam Pad | 3" polyurethane foam sheet | ||
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | M33-500 | aCSF |
| Male Long Evans Rats | Charles River Laboratories | Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria | |
| MultiClamp 700B Amplifier | Molecular Devices | Model 700B | |
| pH Test Strips | VWR Chemicals BDH | BDH83931.601 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | P217-500 | aCSF, PBS |
| Potassium Phosphate | Sigma | P9791-500G | PBS |
| Push Button Controller | Siskiyou Corporation | MC1000e | Four-axis Closed Loop Controller Push-Button |
| Sample Discs | ELITechGroup | SS-033 | For use with Vapor Pressure Osmometer |
| Small towel | |||
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific (Chemical) | S233-500 | aCSF |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | S271-3 | For aCSF, PBS |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S369-500 | aCSF |
| Soft Plastic Restraint Cones | Braintree Scientific | model DC-200 | |
| Stopwatch | Many lab members use their iPhone for this | ||
| Table or large cart with raised edges | For NAP and ACHI | ||
| Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm |
| Upright Microscope | Olympus | Olympus BX5OWI | 5x MPlan 0.10 NA Objective lens |
| Vapor Pressure Osmometer | Vapro | Model 5600 | aCSF should be 300-310 mOSM |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| Vibraplane Vibration Isolation Table | Kinetic Systems | 9101-01-45 |
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