Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के एक जागृत बंद-सिर चोट मॉडल का उपयोग करके सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में परिवर्तन का आकलन करना

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

यहां, यह प्रदर्शित किया गया है कि हिप्पोकैम्पस में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी पर बार-बार हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (आर-एमटीबीआई) के प्रभावों की जांच के लिए एक जागृत बंद-सिर की चोट मॉडल का उपयोग कैसे किया जा सकता है। मॉडल रोगियों में आर-एमटीबीआई की महत्वपूर्ण विशेषताओं को दोहराता है और इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है।

Abstract

हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोटें (एमटीबीआई) उत्तरी अमेरिका में एक प्रचलित स्वास्थ्य समस्या है। नैदानिक आबादी में संक्रमण को बढ़ाने के लिए प्रीक्लिनिकल सेटिंग में क्लोज्ड-हेड एमटीबीआई के पारिस्थितिक रूप से मान्य मॉडल का उपयोग करने का दबाव बढ़ रहा है। जागृत बंद-सिर वाली चोट (एसीएचआई) मॉडल बंद-सिर वाली चोट देने के लिए एक संशोधित नियंत्रित कॉर्टिकल इम्पैक्टर का उपयोग करता है, जो क्रैनियोटॉमी या एनेस्थेटिक के उपयोग की आवश्यकता के बिना चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक व्यवहार घाटे को प्रेरित करता है।

यह तकनीक आम तौर पर घातक, खोपड़ी के फ्रैक्चर, या मस्तिष्क रक्तस्राव को प्रेरित नहीं करती है, और हल्की चोट होने के साथ अधिक सुसंगत है। दरअसल, एसीएचआई प्रक्रिया की हल्की प्रकृति इसे दोहराए जाने वाले एमटीबीआई (आर-एमटीबीआई) की जांच करने वाले अध्ययनों के लिए आदर्श बनाती है। बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि आर-एमटीबीआई के परिणामस्वरूप एक संचयी चोट हो सकती है जो व्यवहार संबंधी लक्षण, न्यूरोपैथोलॉजिकल परिवर्तन और न्यूरोडीजेनेरेशन पैदा करती है। खेल खेलने वाले युवाओं में आर-एमटीबीआई आम है, और ये चोटें मजबूत सिनैप्टिक पुनर्गठन और माइलिनेशन की अवधि के दौरान होती हैं, जिससे युवा आबादी विशेष रूप से आर-एमटीबीआई के दीर्घकालिक प्रभावों के प्रति कमजोर हो जाती है।

इसके अलावा, आर-एमटीबीआई अंतरंग साथी हिंसा के मामलों में होता है, एक ऐसी स्थिति जिसके लिए कुछ उद्देश्य स्क्रीनिंग उपाय हैं। इन प्रयोगों में, किशोर चूहों में हिप्पोकैम्पस में सिनैप्टिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन किया गया था, जिन्होंने एसीएचआई मॉडल का उपयोग करके आर-एमटीबीआई का अनुभव किया था। चोटों के बाद, आर-एमटीबीआई के बाद 1 या 7 दिनों में हिप्पोकैम्पस में द्विदिश सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए हिप्पोकैम्पल स्लाइस बनाने के लिए एक ऊतक स्लाइसर का उपयोग किया गया था। कुल मिलाकर, एसीएचआई मॉडल शोधकर्ताओं को एमटीबीआई और आर-एमटीबीआई के बाद सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक पारिस्थितिक रूप से मान्य मॉडल प्रदान करता है।

Introduction

दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य मुद्दा है, जिसमें कनाडा और संयुक्त राज्य अमेरिका मेंहर साल ~ 2 मिलियन मामले होते हैं। टीबीआई सभी आयु समूहों और लिंगों को प्रभावित करता है और किसी भी अन्य बीमारी की तुलना में अधिक घटना दर है, विशेष रूप से स्तन कैंसर, एड्स, पार्किंसंस रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस3 सहित। टीबीआई की व्यापकता के बावजूद, इसके पैथोफिज़ियोलॉजी को खराब तरीके से समझा जाता है, और उपचार के विकल्प सीमित हैं। आंशिक रूप से, ऐसा इसलिए है क्योंकि सभी टीबीआई के 85% को हल्के (एमटीबीआई) के रूप में वर्गीकृत किया गया है, और एमटीबीआई को पहले केवल सीमित और क्षणिक व्यवहार परिवर्तन ों का उत्पादन करने के लिए सोचा गया है, जिसमें कोई दीर्घकालिक न्यूरोसाइकिएट्रिक परिणामनहीं हैं। अब यह माना जाता है कि एमटीबीआई रिकवरी में सप्ताह सेलेकर 5,6 वर्ष तक लग सकते हैं, अधिक गंभीर न्यूरोलॉजिकल स्थितियां4 हो सकती हैं, और यहां तक कि बार-बार "उप-संयोग"प्रभाव मस्तिष्क को प्रभावित करते हैं। यह चिंताजनक है क्योंकि हॉकी/फुटबॉल जैसे खेलों में एथलीटों का प्रति खेल/अभ्यास सत्र 7,8,9,10 में >10 सिर पर उप-प्रभाव पड़ता है।

किशोरों में एमटीबीआई की सबसे अधिक घटनाएं होती हैं, और कनाडा में, लगभग 10 में से एक किशोर सालाना11,12 में खेल से संबंधित कनकशन के लिए चिकित्सा देखभाल की तलाश करेगा। वास्तव में, किसी भी उप-उत्तेजक सिर प्रभाव या एमटीबीआई मस्तिष्क को फैलने वाली क्षति का कारण बन सकता है, और यह बाद की चोटों और / या अधिक गंभीर न्यूरोलॉजिकल स्थितियों 13,14,15,16,17 के लिए अधिक कमजोर स्थिति भी पैदा कर सकता है। कनाडा में, रोवन के कानून के माध्यम से यह कानूनी रूप से मान्यता प्राप्त है कि पूर्व चोट मस्तिष्क की भेद्यता को आगे की चोट18 तक बढ़ा सकती है, लेकिन आर-एमटीबीआई की यांत्रिक समझ बुरी तरह से अपर्याप्त है। हालांकि, यह स्पष्ट है कि एकल और आर-एमटीबीआई स्कूल वर्ष19,20 के दौरान सीखने की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं, लिंग-विशिष्ट परिणाम 21,22,23,24 हो सकते हैं, और जीवन में बाद में संज्ञानात्मक क्षमता को कम कर सकते हैं16,25,26। दरअसल, कॉहोर्ट विश्लेषण दृढ़ता से27,28 पर डिमेंशिया के साथ जीवन की शुरुआत में आर-एमटीबीआई को जोड़ते हैं। आर-एमटीबीआई संभावित रूप से क्रोनिक ट्रॉमेटिक एन्सेफैलोपैथी (सीटीई) से भी जुड़ा हुआ है, जो हाइपरफॉस्फोराइलेटेड ताऊ प्रोटीन और प्रगतिशील कॉर्टिकल शोष के संचय की विशेषता है और महत्वपूर्ण सूजन 27,29,30,31 से अवक्षेपित है। यद्यपि आर-एमटीबीआई और सीटीई के बीच के लिंक वर्तमान में विवादास्पदहैं, यह मॉडल उन्हें प्रीक्लिनिकल सेटिंग में अधिक विस्तार से पता लगाने की अनुमति देगा।

एक एमटीबीआई को अक्सर "अनदेखी चोट" के रूप में वर्णित किया जाता है, क्योंकि यह एक बंद खोपड़ी के भीतर होता है और आधुनिक इमेजिंग तकनीकों33,34 के साथ भी पता लगाना मुश्किल है। एमटीबीआई के एक सटीक प्रयोगात्मक मॉडल को दो सिद्धांतों का पालन करना चाहिए। सबसे पहले, इसे नैदानिक आबादी35 में सामान्य रूप से देखे जाने वाले बायोमेकेनिकल बलों को पुन: उत्पन्न करना चाहिए। दूसरा, मॉडल को विषम व्यवहार परिणामों को प्रेरित करना चाहिए, कुछ ऐसा जो नैदानिक आबादी 36,37,38 में भी अत्यधिक प्रचलित है। वर्तमान में, अधिकांश प्रीक्लिनिकल मॉडल अधिक गंभीर होते हैं, जिसमें क्रैनियोटॉमी, स्टीरियोटैक्सिक हेड संयम, संज्ञाहरण और नियंत्रित कॉर्टिकल प्रभाव (सीसीआई) शामिल होते हैं जोसामान्य रूप से नैदानिक रूप से देखे जाने की तुलना में महत्वपूर्ण संरचनात्मक क्षति और अधिक व्यापक व्यवहार घाटे का उत्पादन करते हैं। कनकशन के कई प्रीक्लिनिकल मॉडल के साथ एक और चिंता का विषय है जिसमें क्रैनियोटॉमी शामिल है कि यह प्रक्रिया स्वयं मस्तिष्क में सूजन पैदा करती है, और यह किसी भी बादकी चोट से एमटीबीआई के लक्षणों और न्यूरोपैथोलॉजी को बढ़ा सकती है। संज्ञाहरण भी कई जटिल भ्रम ों का परिचय देता है, जिसमें सूजन को कम करना 41,42,43, माइक्रोग्लियल फ़ंक्शन44 को संशोधित करना, ग्लूटामेट रिलीज 45, एनएमडीए रिसेप्टर्स 46 के माध्यम से सीए2 + प्रवेश, इंट्राक्रैनील दबाव और सेरेब्रल चयापचय 47 शामिल हैं। संज्ञाहरण रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) पारगम्यता, ताऊ हाइपरफॉस्फोराइलेशन और कॉर्टिकोस्टेरॉइड स्तर को बढ़ाकर भ्रम का परिचय देता है, जबकि संज्ञानात्मक कार्य 48,49,50,51 को कम करता है। इसके अतिरिक्त, डिफ्यूज, बंद सिर वाली चोटें नैदानिक एमटीबीआई52 के विशाल बहुमत का प्रतिनिधित्व करती हैं। वे उन कारकों की भीड़ का बेहतर अध्ययन करने की अनुमति देते हैं जो व्यवहार के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें सेक्स21, आयु 53, अंतर-चोट-अंतराल15, गंभीरता54 और चोटों की संख्या23 शामिल हैं।

अवक्षेपक बलों (ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज) की दिशा भी व्यवहार और आणविक परिणामों के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। माइकसियुक और उनके सहयोगियों के शोध ने बंद सिर वाले एमटीबीआई के प्रसार के दो मॉडलों की तुलना की है: वजन-गिरावट (ऊर्ध्वाधर बल) और पार्श्व प्रभाव (क्षैतिज बल)55। व्यवहार और आणविक विश्लेषण दोनों ने एमटीबीआई के बाद विषम मॉडल- और सेक्स-निर्भर परिणामों का खुलासा किया। इस प्रकार, पशु मॉडल जो रैखिक और घूर्णी बलों को शामिल करते हुए सर्जिकल प्रक्रियाओं से बचने में मदद करते हैं, शारीरिक स्थितियों के अधिक प्रतिनिधि हैं जिनके तहत ये चोटें सामान्य रूप से33,56 होती हैं। एसीएचआई मॉडल इस आवश्यकता के जवाब में बनाया गया था, जो प्रक्रियाओं (यानी, संज्ञाहरण) से बचने के दौरान चूहों में एमटीबीआई के तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रेरण की अनुमति देता है जोसेक्स मतभेदों को पूर्वाग्रह करने के लिए जाने जाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

कनाडा काउंसिल ऑन एनिमल केयर (सीसीएसी) मानकों के अनुपालन में विक्टोरिया पशु देखभाल समिति विश्वविद्यालय द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं के लिए अनुमोदन प्रदान किया गया था। सभी नर लॉन्ग-इवांस चूहों को घर में पैदा किया गया था या खरीदा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. आवास और प्रजनन की स्थिति

  1. प्रसवोत्तर दिन (पीएनडी) 21 में स्तनपान करने से पहले जानवरों को 1 सप्ताह के लिए अपने आवास वातावरण में रहने की अनुमति दें।
  2. चूहों को मानक पिंजरे आवास में 22.5 डिग्री सेल्सियस ± 2.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें , 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र पर भोजन और पानी तक पहुंच के साथ।
  3. जानवरों को दो या तीन सेक्स-मिलान वाले कूड़े के साथ समूहीकृत और घर दें और यादृच्छिक रूप से उन्हें या तो दिखावटी या आर-एमटीबीआई स्थितियों में असाइन करें।
  4. सुबह 7:30 बजे से रात 11:30 बजे के बीच सभी प्रक्रियाएं करें।

2. जागृत बंद सिर की चोट प्रक्रिया का सेटअप।

  1. स्थिति 2.75 इंच है। रोटेशनल हेड मूवमेंट की अनुमति देने के लिए इम्पैक्टर के नीचे कम घनत्व वाला फोम पैड (100 सेमी x 15 सेमी x 7 सेमी) है।
    नोट: फोम पैड में ~ 2,500 एन / मीटर का स्प्रिंग स्थिरांक था, लेकिन 3,100 और 5,600 एन / एम58 के बीच भिन्न हो सकता है। दृढ़ता का स्तर (निम्न, मध्यम और उच्च) चोटके परिणाम का पूर्वानुमान नहीं दिखाया गया है। फोम पैड एक गैर-उपभोग्य सामग्री है। यह आम तौर पर वार्षिक रूप से प्रतिस्थापित किया जाता है या यदि मिट्टी या क्षतिग्रस्त हो जाता है।
  2. संशोधित कॉर्टिकल प्रभाव डिवाइस (चित्रा 1 ए) चालू करें, और वेग को 6 मीटर / सेकंड पर सेट करें।
    नोट: ये विनिर्देश किशोर और किशोर आयु वर्ग के चूहों में तीव्र न्यूरोलॉजिकल हानि को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं जो एमटीबीआई की विशेषताओं के अनुरूप हैं, लेकिन ऐसे पैरामीटर पुराने जानवरों या अन्य प्रजातियों (जैसे, चूहों या फेरेट्स) के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। सामान्य ACHI पैरामीटर की समीक्षा के लिए,60 देखें.

3. एमटीबीआई का प्रेरण

  1. जब चूहे पीएनडी 24 तक पहुंच जाते हैं, तो उन्हें प्रक्रिया कक्ष में ले जाएं जहां प्रक्रियाएं की जाएंगी। सुनिश्चित करें कि यह कमरा उनके सामान्य आवास वातावरण से अलग है।
  2. चूहे को धीरे से एक संयम शंकु में रखें, यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त वेंटिलेशन की अनुमति देने के लिए नाक और नथुने शंकु के छोटे उद्घाटन के करीब हैं। चूहे को संयम शंकु में रखने के बाद आंदोलन को रोकने के लिए शंकु को पुच्छल छोर पर बंद रखने के लिए एक प्लास्टिक हेयर क्लिप का उपयोग करें।
    1. संयम शंकु और एसीएचआई प्रक्रिया के साथ जानवरों के अनुपालन या सहिष्णुता को रिकॉर्ड करने के लिए संयम स्कोर का उपयोग करें।
      नोट: संयम स्कोर का उपयोग जानवरों में तनाव के आकलन के रूप में किया जा सकता है। इस प्रकार, अत्यधिक तनाव प्रतिक्रिया के कारण उत्पन्न होने वाले विषयों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए संयम स्कोर का उपयोग करके बहिष्करण मानदंड विकसित किया जा सकता है।
      1. शंकु में प्रवेश करने के लिए जानवर की इच्छा, उनके आंदोलनों और मुखरता के आधार पर 0 से 4 तक का स्कोर दें। यदि संयम का कोई प्रतिरोध नहीं है, तो 0 का स्कोर दें, जबकि 1 का स्कोर जानवर के 1-2 x मुड़ने और थोड़ा सा स्वर या घबराहट से मेल खाता है। 2 का स्कोर दें यदि जानवर 2-3 गुना हो गया है और कुछ मुखरता या घबराहट प्रदर्शित करता है। 3 का संयम स्कोर दें यदि जानवर 5-10 गुना हो गया है और अधिक स्वर और घबराहट प्रदर्शित करता है। अंत में, 4 का स्कोर दें यदि जानवर लगातार स्वर और घबराहट के साथ 10 गुना से अधिक हो गया है।
        नोट: यह जानकारी स्कोरिंग शीट पर भी है (पूरक तालिका एस 1 और पूरक तालिका एस 2)।
  3. जबकि चूहे को नियंत्रित किया जाता है, मैन्युअल रूप से हेलमेट (चित्रा 1 बी) को मध्य रेखा पर रखें, बाएं पार्श्विका लोब (चित्रा 1 सी, डी) पर लक्ष्यीकरण डिस्क के साथ।
  4. चूहे को फोम पैड पर रखें और मैन्युअल रूप से इम्पैक्टर को एक्सटेंड स्थिति में सेट करें। इम्पैक्टर टिप को मैन्युअल रूप से कम करें ताकि यह हेलमेट पर लक्ष्यीकरण डिस्क के संपर्क में आए। इम्पैक्टर को हेलमेट से 10 मिमी ऊपर हटाने के लिए इम्पैक्टर को मैन्युअल रूप से रिकॉल पोजीशन पर सेट करें।
  5. प्रभाव टिप को 10 मिमी तक कम करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक आर्म पर डायल का उपयोग करें ताकि यह फिर से हेलमेट पर लक्ष्यीकरण डिस्क को छू रहा हो। इम्पैक्ट स्विच को फ्लिप करें ताकि जानवर का सिर 6 मीटर / सेकंड पर 10 मिमी के लिए तेजी से तेज हो जाए।
  6. एक बार डिवाइस सक्रिय हो जाने के बाद, तुरंत जानवर को संयम शंकु से हटा दें और तत्काल न्यूरोलॉजिकल मूल्यांकन प्रोटोकॉल (एनएपी) करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: वर्तमान प्रयोगों के लिए, इस प्रोटोकॉल को 2 घंटे के अंतराल पर कुल आठ बार दोहराया गया था।

4. दिखावटी चोट का प्रेरण

  1. अनुभाग 3 में ऊपर वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का पालन करें, लेकिन चूहे को प्रभाव पिस्टन के मार्ग से सटे रखें, ताकि कोई चोट न पहुंचे।

5. न्यूरोलॉजिकल मूल्यांकन प्रोटोकॉल

नोट: एनएपी का उपयोग चेतना के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है, साथ ही संज्ञानात्मक और सेंसरिमोटर कामकाज भी।

  1. बेसलाइन पर और एमटीबीआई या शाम की चोट के प्रेरण के तुरंत बाद, एनएपी का उपयोग करके चूहों का आकलन करें जैसा कि56,61 में वर्णित है। एक मेज पर, चूहों के घर के पिंजरे और 100 सेमी की दूरी पर एक रिकवरी पिंजरे रखें। समान रूप से दोनों पिंजरों के शीर्ष पर बैलेंस बीम को केंद्रित करें। इसके अतिरिक्त, बैलेंस बीम के नीचे एक मुड़ा हुआ तौलिया या अतिरिक्त कुशनिंग रखें।
  2. यदि आवश्यक हो, तो चेतना के स्तर का आकलन करें। यदि एमटीबीआई के बाद जानवर गैर-प्रतिक्रियाशील हैं, तो एपनिया (सांस लेने की समाप्ति) और राइटिंग रिफ्लेक्स में किसी भी देरी का आकलन स्टॉपवॉच का उपयोग करके करें ताकि जानवर को सांस लेने में लगने वाले समय को रिकॉर्ड किया जा सके और / या खुद को लापरवाह से प्रवण स्थिति में सही किया जा सके।
    नोट: एसीएचआई मॉडल के साथ राइटिंग रिफ्लेक्स और एपनिया का नुकसान दुर्लभ है, लेकिन वे कभी-कभी किशोर जानवरों में देखे जा सकते हैं।
  3. परीक्षणों के निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग करके चूहे के संज्ञानात्मक और सेंसरिमोटर फ़ंक्शन का आकलन करें। चेतना के मूल्यांकन के बाद इन परीक्षणों को तेजी से प्रशासित करें।
    नोट: इन चार परीक्षणों का योग 12 में से कुल स्कोर देता है, अगर कोई व्यवहार घाटे नहीं हैं। घाटे इस स्कोर से अलग हो जाते हैं।
    1. Startle Response
      1. चूहे को खाली रिकवरी पिंजरे में रखें और पिंजरे के ऊपर जोर से (50 सेमी) ताली बजाएं। निम्नलिखित स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग करके शोर के लिए जानवर की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करें:
        3 = ध्वनि के लिए त्वरित प्रारंभिक प्रतिक्रिया (उदाहरण के लिए, कान की गति / स्विच, कूद, पूरा शरीर जम जाता है)।
        2 = ध्वनि के लिए धीमी प्रतिक्रिया या मामूली ठंड प्रतिक्रिया।
        1 = केवल कान की गति देखी गई।
        0 = ध्वनि के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं।
    2. अंग विस्तार।
      1. बीम (100 सेमी लंबी x 2 सेमी चौड़ी x 0.75 सेमी मोटी) को चूहे के घर और रिकवरी पिंजरों में क्षैतिज रूप से रखने के साथ, चूहे को पूंछ के आधार से उठाएं और उसे बीम के पास रखें। सुनिश्चित करें कि चूहा आसानी से इसे समझने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त करीब है। निम्नलिखित स्कोरिंग सिस्टम के साथ बीम तक दोनों अंगों का विस्तार करने के लिए चूहे की क्षमता का आकलन करें:
        3 = दोनों अग्रअंगों का पूर्ण विस्तार और बीम को पकड़ना।
        2 = केवल एक अंग बढ़ाया गया है।
        1 = आंतरायिक विस्तार या अग्रअंगों का मुड़ना।
        0 = अग्रभाग लंगड़ा/कोई विस्तार नहीं है।
    3. बीम वॉक
      1. जानवर को क्षैतिज बीम के केंद्र में उसके घर के पिंजरे के सामने 50 सेमी के निशान पर रखें। सुनिश्चित करें कि बीम को चूहे के घर के पिंजरे और रिकवरी पिंजरे (~ 80 सेमी अलग) के बीच समान रूप से रखा गया है। चूहे को बीम के पार चलने दें। निम्नलिखित स्कोरिंग सिस्टम के साथ संतुलन और चलने की चूहे की क्षमता का आकलन करें:
        3 = 10 सेकंड के भीतर दो फुट से कम फिसलन के साथ बीम पर सफलतापूर्वक चलता है।
        2 = बीम को सफलतापूर्वक चलाता है, लेकिन दो फुट से अधिक स्लिप देखी जाती है।
        1 = गैर-लोकोमोटिव आंदोलन, 'तैराकी' गति।
        0 = बीम के साथ चलने में असमर्थ या 10 सेकंड के भीतर चलने में असमर्थ।
    4. घूर्णन बीम
      1. बीम के केंद्र में चूहे को फिर से रखें, यह सुनिश्चित करें कि चूहा संतुलित है। बीम को एक तौलिया या गद्देदार सतह से 80 सेमी ऊपर उठाएं और बीम को 4 सेकंड (कुल चार घूर्णन) के लिए प्रति सेकंड एक घूर्णन की दर से मैन्युअल रूप से घुमाना शुरू करें। बीम पर रहने के लिए चूहे की क्षमता का आकलन करें क्योंकि यह निम्नलिखित स्कोरिंग सिस्टम के साथ घूमता है:
        3 = चूहा सभी चार घूर्णन के लिए बीम पर रहता है।
        2 = चूहा चौथे घूर्णन पर गिरता है।
        1 = चूहा दूसरे या तीसरे घूर्णन पर गिरता है।
        0 = चूहा पहले घूर्णन के दौरान गिरता है।
  4. एनएपी के पूरा होने पर, एमटीबीआई और शाम चूहों को उनके घर के पिंजरों में वापस कर दें। आर-एमटीबीआई प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं। केज-साइड मॉनिटरिंग चेकलिस्ट (पूरक फ़ाइल 1) के साथ चोटों के बाद जानवरों की भलाई की निगरानी करें। यदि पिंजरे-साइड निगरानी के दौरान असामान्यता (कोई भी स्कोर जो एन नहीं है) का कोई संकेत है, तो हेड इम्पैक्ट (पूरक फ़ाइल 2) के बाद दर्द स्केल और उन्नत निगरानी चेकलिस्ट के साथ पूर्ण दर्द स्कोर लिया जाना चाहिए।

6. स्लाइस तैयारी

नोट: वर्तमान अध्ययन में, एमटीबीआई के 1 या 7 दिनों के बाद आर-एमटीबीआई के बाद जानवरों में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का आकलन किया गया था। इन दिनों, जानवरों को बलिदान से पहले ढके हुए पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से प्रयोगशाला में लाया जाता था।

  1. हिप्पोकैम्पल स्लाइस बनाने के लिए आवश्यक सभी सर्जिकल उपकरणों (चित्रा 2 ए) को रात भर ठंडा करें (-20 डिग्री सेल्सियस): मानक कैंची, विच्छेदन कैंची, फोर्स, रोंगर्स, स्पाटुलस और चिलिंग ब्लॉक।
    नोट: ऊतक गोंद और इनक्यूबेशन कक्ष को प्रशीतित नहीं किया जाना चाहिए।
  2. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) तैयार करें जिसमें 125 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 1.25 एमएम एनएएचपीओ 4, 25 एमएम एनएएचसीओ 3, 2 एमएम सीएसीएल 2,1.3 एमएम एमजीसीएल 2, और 10 एमएम डेक्सट्रोज (300 ± 10 एमएम; पीएच 7.2-7.4) शामिल हैं।
    नोट: एसीएसएफ का मुख्य समाधान प्रोटोकॉल की अवधि के लिए कार्बोजेन (95% ओ 2/5% सीओ2) के साथ लगातार बुलबुला होना चाहिए।
  3. जानवर (चरण 6.8) को यूथेनाइज़ करने से पहले, 12.5 एमएल एगारोस तैयार करें। 12.5 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (1x पीबीएस) में 0.25 ग्राम अगारोस को 10 सेकंड की वृद्धि में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में माइक्रोवेव करके घोलें।
  4. अगारोस को गर्म (42 डिग्री सेल्सियस) रखें और इसे जमने से रोकने के लिए हीटिंग प्लेट में हिलाएं।
  5. बर्फ पर एक कटिंग स्टेशन स्थापित करें, जिसमें एक पेट्री डिश और एक छोटा बीकर (50 एमएल) शामिल है, जो बर्फ-ठंडे एसीएसएफ (4 डिग्री सेल्सियस) से भरा है और शीर्ष पर गीले फिल्टर पेपर के टुकड़े के साथ एक पलटा हुआ पेट्री डिश (चित्रा 2 ए)। कार्बोजेन के साथ छोटे बीकर में एसीएसएफ को लगातार बुलबुला करें।
  6. पानी के स्नान को 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एसीएसएफ के साथ रिकवरी चैंबर भरें और कार्बोजेन के साथ लगातार बुलबुला करें (चित्रा 2 बी)।
  7. जानवर को प्रयोगात्मक कमरे में ले जाएं।
  8. 5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके जानवर को इनहेलेंट के रूप में एनेस्थेटाइज करें (जब तक कि वापसी रिफ्लेक्स की कमी न हो) और फिर एक छोटे गिलोटिन का उपयोग करके इसे तेजी से हटा दें।
  9. बर्फ-ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) एसीएसएफ से भरे पेट्री डिश में खोपड़ी से मस्तिष्क को विच्छेदित करें, ऊतक को तेजी से ठंडा करने में मदद करने के लिए एसीएसएफ में डूबी खोपड़ी को पकड़ें।
    नोट: इस प्रक्रिया में आमतौर पर 5 मिनट से कम की आवश्यकता होती है, लेकिन मस्तिष्क को हटाने की गति एक महत्वपूर्ण कारक नहीं है यदि मस्तिष्क ठंडा एसीएसएफ में डूबा हुआ है।
  10. नमूने को और साफ करने और ठंडा करने के लिए मस्तिष्क को ठंडा और कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ के छोटे बीकर में रखें।
  11. मस्तिष्क को उल्टा पेट्री डिश में ले जाएं और इसे फिल्टर पेपर पर रखें। मस्तिष्क को "अवरुद्ध" करने के लिए सेरिबैलम और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स को हटाने के लिए एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें। मस्तिष्क की मध्य रेखा को काटकर दो गोलार्धों को अलग करें।
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल एक समय में एक गोलार्ध में किया जाता है। यह जरूरी है कि वर्तमान में तैयार नहीं किया जा रहा गोलार्ध बर्फ-ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ के बीकर में डूबा रहे।
  12. अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पल स्लाइस बनाने के लिए, गोलार्ध को औसत दर्जे की सतह पर रखें। एक स्केलपेल के ब्लेड को ~ 30 ° अंदर की ओर झुकाएं और मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह से एक पतली स्लाइस निकालें ताकि मस्तिष्क को स्लाइसर द्वारा उपयोग किए जाने वाले पिस्टन पर एक सपाट सतह प्रदान की जा सके। मस्तिष्क को पृष्ठीय सतह पर फ्लिप करें और किसी भी अतिरिक्त एसीएसएफ को हटाने के लिए ऊतक को सूखे फिल्टर पेपर पर धीरे से दबाएं। साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करके, मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह को पिस्टन से जोड़ें, जिससे उदर सतह सीधी हो जाए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि गोंद पिस्टन के किनारे पर नहीं चलता है, क्योंकि इससे यह अगारोस को शामिल करने और पिस्टन की गति को रोकने के लिए उपयोग की जाने वाली धातु ट्यूब का पालन करेगा।
  13. मस्तिष्क पर पिस्टन की बाहरी ट्यूब का विस्तार करें और तरल अगारोस को ट्यूब में डालें जब तक कि मस्तिष्क पूरी तरह से कवर न हो जाए। पिस्टन ट्यूब (चित्रा 2 ए) पर एक चिलिंग ब्लॉक को दबाकर जल्दी से अगारोस को ठोस बनाएं।
  14. पिस्टन को स्लाइसर के कक्ष में रखें और एक पेंच के साथ कक्ष को सुरक्षित करें। ब्लेड को सुरक्षित करें और स्लाइसर कक्ष में बर्फ-ठंडा, ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ जोड़ें।
  15. स्लाइसर (चित्रा 2 बी) पर, काटने की गति को 4, दोलन को 6 पर सेट करें, और निरंतर / एकल स्लाइसिंग स्विच को निरंतर में टॉगल करें। 400 μm पर मस्तिष्क को विभाजित करना शुरू करें।
  16. मस्तिष्क के स्लाइसर सेक्शन के रूप में, प्रत्येक स्लाइस को ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ के रिकवरी बाथ में स्थानांतरित करने के लिए एक बड़े व्यास के पाश्चर पिपेट का उपयोग करें क्योंकि यह विभाजित है (चित्रा 2 सी)।
    नोट: जैसा कि प्रत्येक टुकड़ा काटा जाता है, इसे पुनर्प्राप्ति स्नान के विभिन्न कुओं में क्रमिक रूप से रखा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आमतौर पर छह से आठ स्लाइस के बीच उपज देता है, जिसमें प्रत्येक गोलार्ध के लिए हिप्पोकैम्पस होता है। चूहे के मस्तिष्क में अलग-अलग स्लाइस की पृष्ठीय-उदर स्थिति की पहचान करने के लिए एक चूहा एटलस62 का उपयोग किया जा सकता है।
  17. स्लाइस को 30 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें और फिर कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए ठीक होने के लिए छोड़ दें।
  18. दूसरे गोलार्ध से स्लाइस बनाने के लिए इन चरणों को दोहराएं।

7. फील्ड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

नोट: डेंटेट गाइरस (डीजी) से बाह्य क्षेत्र रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें। 60 मिनट की वसूली के बाद, व्यक्तिगत हिप्पोकैम्पल स्लाइस बाह्य क्षेत्र रिकॉर्डिंग के लिए तैयार हैं।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके, 1.5 मिमी के बाहरी व्यास और 1.1 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 10 सेमी बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (1-2 एम) खींचें।
    नोट: रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में ~ 1 मीटर का प्रतिरोध होना चाहिए और युक्तियां आकार में ~ 1 मिमी होनी चाहिए। इलेक्ट्रोड मापदंडों में स्थिरता अच्छी रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर और उपकरण को चालू करें: एम्पलीफायर, डिजिटाइज़र, उत्तेजक, माइक्रोमैनिपुलेटर, तापमान नियामक, माइक्रोस्कोप प्रकाश और वैक्यूम पंप।
  3. एसीएसएफ के साथ एक बीकर भरें और इसे गुरुत्वाकर्षण-नियंत्रित छिड़काव प्रणाली से कनेक्ट करें। छिड़काव कक्ष के माध्यम से एसीएसएफ का प्रवाह शुरू करने के लिए छिड़काव प्रणाली पर एसीएसएफ वाल्व खोलें। लगभग एक या दो ड्रिप /सेकंड या 2 एमएल / मिनट की प्रवाह दर बनाए रखें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए लगातार कार्बोजेनेट एसीएसएफ।
    नोट: फील्ड रिकॉर्डिंग के दौरान कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ की निरंतर ड्रिप दर बनाए रखना अनिवार्य है। यह भी जरूरी है कि संदर्भ इलेक्ट्रोड एसीएसएफ में पूरी तरह से डूबा हो।
  4. रिकवरी बाथ से छिड़काव कक्ष में एक हिप्पोकैम्पल स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें जो लगातार कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ के साथ जुड़ा हुआ है और 30 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। मस्तिष्क के टुकड़े को उन्मुख करें ताकि डेंटेट गाइरस और ग्रेन्युल सेल परत दृश्य के क्षेत्र में दिखाई दें। मुड़े हुए तार वजन के साथ स्लाइस को स्थिर करें। डेटा अधिग्रहण के लिए कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
    नोट: ऊतक के मुक्त हेरफेर की अनुमति देने के लिए इस चरण के दौरान वैक्यूम पंप को बंद करना सहायक हो सकता है। यह जल्दी से किया जाना चाहिए क्योंकि बहुत अधिक हेरफेर ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अतिरिक्त, छिड़काव कक्ष एसीएसएफ के साथ अतिप्रवाह कर सकता है यदि इसमें बहुत अधिक समय लगता है। एक बार जब ऊतक ठीक से केंद्रित और स्थिर हो जाता है, तो वैक्यूम पंप चालू करें।
  5. तिरछी प्रकाशिकी के साथ डीजी की कल्पना करने के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। आणविक परत के मध्य तिहाई में मेडियल परफ़ोरेंट पथ (एमपीपी) फाइबर को सक्रिय करने के लिए एक संकेंद्रित द्विध्रुवीय उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखें। फिर, एमपीपी (चित्रा 3 ए, बी) में एसीएसएफ से भरे एक ग्लास माइक्रोपिपेट को रखें। इलेक्ट्रोड को आगे अलग करके शुरू करें (यानी, सीए 3 के पास उत्तेजक इलेक्ट्रोड और डीजी के जीनू के ठीक ऊपर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड), क्योंकि ऊतक को छूने से तंतुओं को नुकसान होगा।
    नोट: बेहतर रूप से, सभी रिकॉर्डिंग में इलेक्ट्रोड को सेल परत से समान दूरी पर रखा जाना चाहिए, लगभग 200 μm अलग।
  6. एक बार उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैनात हो जाने के बाद, एक एम्पलीफायर, एक डिजिटाइज़र और रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न क्षेत्र प्रतिक्रियाओं की कल्पना करें।
  7. एक उपयुक्त क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक क्षमता (एफईपीएसपी) खोजने के लिए, 0.2 हर्ट्ज (हर 5 सेकंड) पर 0.12 एमएस वर्तमान दालों के साथ ऊतक को उत्तेजित करें, जब उपयोगकर्ता प्रतिक्रियाओं को खोजने में कुशल हो, या कम कुशल उपयोगकर्ताओं के लिए 0.067 हर्ट्ज (हर 15 सेकंड) पर अतिउत्तेजना से बचने के लिए। सुनिश्चित करें कि एफईपीएसपी में एक स्पष्ट फाइबर वॉली के साथ 0.7 एमवी का न्यूनतम आयाम है जो एफईपीएसपी से छोटा है।
    नोट: अधिकतम क्षेत्र प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए सेल परत से दोनों इलेक्ट्रोड को समान दूरी पर रखना महत्वपूर्ण है और एक छोटी फाइबर वॉली उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त (यानी, ~ 200 μm) अलग है। इलेक्ट्रोड स्थिति में छोटे समायोजन प्रतिक्रिया के आयाम को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं, हालांकि ऊतक क्षति से बचने के लिए इन्हें न्यूनतम रखा जाना चाहिए।
  8. उत्तेजना तीव्रता को बढ़ाकर अधिकतम एफईपीएसपी आयाम निर्धारित करें और फिर अनुकरण तीव्रता निर्धारित करें ताकि एफईपीएसपी अधिकतम आयाम के 70% पर हो।
    नोट: अधिकतम आयाम दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड) अध्ययनों के लिए 70% और दीर्घकालिक प्रवर्धन (एलटीपी) अध्ययनों के लिए 50% पर सेट है। अधिकतम आयाम उत्तेजना शक्ति को समायोजित करके निर्धारित किया जाता है जब तक कि एफईपीएसपी आयाम में वृद्धि नहीं करता है। 2 एमवी अधिकतम आयाम के साथ एफईपीएसपी के लिए, प्रतिक्रिया आकार को तब लिमिटेड अध्ययनों के लिए 1.4 एमवी और एलटीपी अध्ययनों के लिए 1.0 एमवी में समायोजित किया जाएगा, ताकि एफईपीएसपी को दबाने या शक्तिशाली बनाने के लिए जगह मिल सके (क्रमशः)।
  9. 0.067 हर्ट्ज पर वितरित 0.12 एमएस दालों के साथ 20 मिनट के लिए एक स्थिर पूर्व शर्त आधार रेखा स्थापित करें। स्लाइस को स्थिर माने जाने के लिए, एफईपीएसपी की प्रारंभिक ढलान में <10% परिवर्तनशीलता की तलाश करें और प्लॉट किए गए एफईपीएसपी ढलानों के माध्यम से सबसे अच्छी फिट की रेखा की ढलान <0.5 हो। रिकॉर्डिंग के अगले चरणों के साथ आगे बढ़ें जब ईपीएसपी को 20 मिनट के लिए स्थिर होने के लिए सत्यापित किया जाता है।
    नोट: लिमिटेड और एलटीपी को अवरुद्ध करने या बढ़ाने के लिए एसीएसएफ में विभिन्न रिसेप्टर विरोधी जोड़े जा सकते हैं। यदि उनकी आवश्यकता होती है, तो सुनिश्चित करें कि स्लाइस इस आधारभूत अवधि के दौरान इन औषधीय एजेंटों के संपर्क में हैं और स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यकताओं को पूरा किया जाता है। उदाहरण के लिए, 63,64,65 देखें।
  10. सबसे पहले, युग्मित-नाड़ी उत्तेजनाओं का उपयोग करके और उत्तेजना-प्रतिक्रिया इनपुट-आउटपुट कर्व्स का निर्माण करके बुनियादी सिनैप्टिक गुणों में परिवर्तन निर्धारित करें। युग्मित-पल्स परीक्षण के लिए, 0.033 हर्ट्ज पर 50 एमएस के इंटरपल्स अंतराल के साथ युग्मित दालों की एक श्रृंखला लागू करें। इनपुट-आउटपुट वक्रों के लिए, एफईपीएसपी प्रतिक्रिया आकार परिवर्तन को प्लॉट करने के लिए 0.033 हर्ट्ज पर बढ़ती उत्तेजना तीव्रता (0.0-0.24 एमएस) की एक श्रृंखला (10) लागू करें।
  11. लिमिटेड का अध्ययन करने के लिए जो मुख्य रूप से सीबी 1 रिसेप्टर्स64,66 के सक्रियण पर निर्भर है, 10 हर्ट्ज प्रोटोकॉल (10 हर्ट्ज पर 6,000 दालें) को नियोजित करें। इस प्रोटोकॉल को प्रशासित करने में 10 मिनट लगते हैं।
  12. पोस्टकंडीशनिंग रिकॉर्डिंग के लिए, अतिरिक्त 60 मिनट के लिए एकल-पल्स उत्तेजना (0.067 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 0.12 एमएस) का उपयोग करना फिर से शुरू करें।
  13. पोस्टकंडीशनिंग रिकॉर्डिंग के बाद, फिर से युग्मित-पल्स उत्तेजनाओं को प्रशासित करें, इसके बाद एक इनपुट-आउटपुट वक्र हो। प्रीसिनेप्टिक रिलीज गुणों में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए बेसलाइन रिकॉर्डिंग से इनकी तुलना करें और दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस के स्वास्थ्य का आकलन करने में मदद करें।
  14. विश्लेषण के दौरान, रूढ़िवादी रहें और यह निर्धारित करते समय बहिष्करण मानदंडों का पालन करें कि क्या व्यक्तिगत स्लाइस से डेटा को सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी डेटा सेट में बनाए रखा जाना चाहिए। उन स्लाइस को शामिल न करें जो पूर्व शर्त आधार रेखा (ढलान >0.5), पूर्वशर्त आधार रेखा में अस्थिरता (>10% परिवर्तन), और पोस्टकंडीशनिंग अवधि में अस्थिरता (50-60 मिनट के पोस्टकंडीशनिंग में ढलान >1.5) के दौरान एफईपीएसपी ढलानों के सर्वोत्तम फिट की रेखा में एक बड़ी ढलान प्रदर्शित करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जागृत बंद सिर की चोट मॉडल किशोर चूहों में आर-एमटीबीआई को प्रेरित करने का एक व्यवहार्य तरीका है। एसीएचआई मॉडल के साथ आर-एमटीबीआई के संपर्क में आने वाले चूहों ने व्यवहार की कमी नहीं दिखाई। इन प्रयोगों में विषयों ने आर-एमटीबीआई प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर सही या एपनिया के लिए विलंबता का प्रदर्शन नहीं किया, यह दर्शाता है कि यह वास्तव में एक हल्की टीबीआई प्रक्रिया थी। एनएपी में सूक्ष्म व्यवहार संबंधी अंतर उभरे; जैसा कि ऊपर वर्णित है, चूहों को 0 से 3 के पैमाने पर चार सेंसरिमोटर कार्यों (स्टार्टल प्रतिक्रिया, अंग विस्तार, बीम वॉक और रोटेटिंग बीम) पर स्कोर किया गया था, जिसमें 3 कार्य के साथ कोई हानि का प्रतिनिधित्व नहीं करते थे। इस प्रकार, एनएपी स्कोर जितना कम होगा, जानवर उतना ही बिगड़ा हुआ था। बेसलाइन पर, शाम और आर-एमटीबीआई चूहों के बीच एनएपी स्कोर में कोई अंतर नहीं था। सभी एसीएचआई सत्रों के बाद, आर-एमटीबीआई चूहों ने शम्स (चित्रा 4) की तुलना में एनएपी कार्यों के भीतर महत्वपूर्ण हानि दिखाई। हालांकि, जैसा कि पहले कई दिनों (यानी, 2 या 4 दिनों) में दिए गए प्रभावों के लिए बताया गया था, दिन के दौरान चोटों के बाद के जोड़ ने अतिरिक्त व्यवहार घाटे को कम या उत्पन्न नहीं किया। इस प्रकार, आर-एमटीबीआई का एसीएचआई मॉडल इन तीव्र चोट के बाद के समय बिंदुओं के दौरान सूक्ष्म, अभी तक महत्वपूर्ण, व्यवहार संबंधी घाटे का उत्पादन करता है।

चोट प्रोटोकॉल के बाद, चोट के बाद के दिन 1 (पीआईडी 1), और पीआईडी 7 पर हिप्पोकैम्पस के डीजी को एमपीपी इनपुट में फील्ड प्रतिक्रियाओं और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी की जांच की गई। प्रत्येक स्लाइस में पल्स चौड़ाई की आरोही श्रृंखला के जवाब में एफईपीएसपी का उपयोग करके स्लाइस स्वास्थ्य की जांच की गई थी। जैसा कि चित्र 3 सी में दिखाया गया है, शाम और आर-एमटीबीआई चूहों से प्राप्त स्लाइस में उत्पन्न इनपुट-आउटपुट वक्रों में कोई अंतर नहीं था। प्रीसिनेप्टिक ट्रांसमीटर रिलीज की जांच करने के लिए, युग्मित दालों (50 एमएस इंटरपल्स अंतराल) की एक श्रृंखला प्रशासित की गई थी, और दूसरे एफईपीएसपी के आकार के अनुपात की गणना पहले एफईपीएसपी के सापेक्ष की गई थी। युग्मित-नाड़ी अनुपात शाम और आर-एमटीबीआई चूहों (चित्रा 3 डी) के बीच भिन्न नहीं थे। इस प्रकार, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि आर-एमटीबीआई ने डीजी को एमपीपी इनपुट में बुनियादी सिनैप्टिक फिजियोलॉजी को नहीं बदला। लिमिटेड की जांच करने के लिए, एंडोकैनाबिनोइड्स64 पर निर्भर एक लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए एक 10 हर्ट्ज लिमिटेड प्रोटोकॉल प्रशासित किया गया था। पीआईडी 1 पर, लिमिटेड को बनाए रखने के लिए डीजी को एमपीपी इनपुट की क्षमता में उल्लेखनीय कमी आई थी (चित्रा 3 ई)। हालांकि, लिमिटेड में यह कमी क्षणिक थी, और पीआईडी 7 द्वारा, शाम और आर-एमटीबीआई जानवरों के स्लाइस ने समकक्ष लिमिटेड (चित्रा 3 एफ) प्रदर्शित किया, हालांकि आर-एमटीबीआई जानवरों से स्लाइस के लिए एलटीडी में वृद्धि प्रदर्शित करने के लिए मामूली प्रवृत्ति का संकेत था।

Figure 1
चित्र 1: आर-एमटीबीआई मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एसीएचआई प्रक्रिया सेटअप । (ए) एक संशोधित नियंत्रित कॉर्टिकल इम्पैक्टर का उपयोग 6.0 मीटर / सेकंड (बी, सी) कस्टम 3 डी मुद्रित हेलमेट के बाएं पार्श्विका कॉर्टेक्स लक्ष्य साइट के वेग से जानवर के सिर को तेजी से विस्थापित करने के लिए किया गया था। (डी) विषयों को फोम प्लेटफॉर्म पर एक प्लास्टिक संयम बैग में रखा गया था, जिसमें हेलमेट को संयम शंकु के चारों ओर रखा गया था और तैनात किया गया था ताकि लक्ष्य स्थल सीधे इम्पैक्टर टिप के नीचे हो। संक्षेप: एसीएचआई = जागृत बंद सिर की चोट; आर-एमटीबीआई = बार-बार हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्लाइस तैयारी के लिए आवश्यक सामग्री और सेटअप। (ए) मस्तिष्क निष्कर्षण, माउंटिंग, स्लाइसिंग और इनक्यूबेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण: (ए) फिल्टर पेपर के साथ कल्चर डिश; (बी) मानक कैंची, विच्छेदन कैंची, बल, एक रोंगेर और स्पैटुलस सहित विभिन्न विच्छेदन उपकरण; (सी) ऊतक चिपकने वाला; (डी) संपीड़ित पिस्टन और नमूना ट्यूब; (ई) पंख ब्लेड और ब्लेड धारक; (च) चिलिंग ब्लॉक; (छ) इनक्यूबेशन कक्ष को स्लाइस करें। (बी) संपीड़ित ऊतक स्लाइसर। (सी) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव युक्त स्नान में स्लाइस इंजेक्ट करना जो लगातार 95% ओ 2/5% सीओ2 के साथ ऑक्सीजन युक्त होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एसीएचआई मॉडल का उपयोग करके आर-एमटीबीआई के कारण किशोर पुरुष चूहों में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में तीव्र हानि । (ए) प्रमुख हिप्पोकैम्पल मार्ग। मेडियल परफ़ोरेंट मार्ग में एंटोरिनल कॉर्टेक्स से डेंटेट गाइरस (नीला) में इनपुट शामिल होता है। डेंटेट गाइरस (बैंगनी) में ग्रेन्युल कोशिकाओं पर औसत दर्जे का परफ़ोरेंट पथ सिनेप्स इनपुट करता है। (बी) एक हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस (4x आवर्धन) का ब्राइटफील्ड फोटोमाइक्रोग्राफ, जो एक द्विध्रुवीय उत्तेजक इलेक्ट्रोड (बाएं) और एक ग्लास रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पिपेट (दाएं) के वास्तविक प्लेसमेंट को दर्शाता है। (सी) शाम और आर-एमटीबीआई चूहों के लिए पीआईडी 1 और पीआईडी 7 पर विभिन्न सिमुलेशन तीव्रता (10-300 μs) के लिए इनपुट-आउटपुट प्लॉट (एफईपीएसपी ढलान)। (डी) शाम और आर-एमटीबीआई चूहों के लिए युग्मित-पल्स अनुपात (50 एमएस इंटरपल्स अंतराल)। (ङ) पीआईडी 1 में शाम और आर-एमटीबीआई चूहों से प्राप्त हिप्पोकैम्पल स्लाइस ों में लिमिटेड इंडक्शन प्रतिमान लगाने से पहले और बाद में एफईपीएसपी का समय पाठ्यक्रम बदलता है। (च) पीआईडी 7 में शाम और आर-एमटीबीआई चूहों से प्राप्त हिप्पोकैम्पल स्लाइस में लिमिटेड इंडक्शन प्रतिमान के प्रशासन से पहले और बाद में एफईपीएसपी का समय पाठ्यक्रम बदलता है। संक्षेप: एसीएचआई = जागृत बंद सिर की चोट; आर-एमटीबीआई = बार-बार हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट; पीआईडी = चोट के बाद का दिन; एफईपीएसपी = क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक क्षमता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसीएचआई मॉडल का उपयोग करके आर-एमटीबीआई के कारण किशोर पुरुष चूहों में तीव्र न्यूरोलॉजिकल हानि। चूहों को 1 दिन में 2 घंटे के अंतराल पर आठ एसीएचआई प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ा, जिसमें बेसलाइन पर और प्रत्येक चोट के बाद एक न्यूरोलॉजिकल मूल्यांकन प्रोटोकॉल आयोजित किया गया। एनएपी में चार कार्य शामिल थे: स्टार्टल प्रतिक्रिया, अंग विस्तार, बीम वॉक और रोटेटिंग बीम। प्रत्येक कार्य को 3 में से स्कोर किया गया था, जिससे प्रत्येक सत्र के लिए 12 का कुल संभव स्कोर मिला। माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत डेटा (*) p < 0.05 इंगित करता है। संक्षेप: एसीएचआई = जागृत बंद सिर की चोट; आर-एमटीबीआई = बार-बार हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट; एनएपी = न्यूरोलॉजिकल मूल्यांकन प्रोटोकॉल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: एसीएचआई प्रक्रिया पशु और प्रभाव जानकारी। संक्षिप्त नाम: एसीएचआई = जागृत बंद सिर की चोट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: जागृत एमटीबीआई के लिए संयम स्कोरिंग। संक्षिप्त नाम: एमटीबीआई = हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट। "संयम में घूमना" शोधकर्ता को संदर्भित करता है जो पूंछ के चारों ओर बैग बंद करने से पहले जानवर को संयम में रखता है। बैग बंद होने के बाद, जानवर को मुड़ने में सक्षम नहीं होना चाहिए। बैग बंद होने के बाद मुखरता और घबराहट का स्कोर किया जाना चाहिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: केज-साइड मॉनिटरिंग चेकलिस्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: दर्द पैमाने और उन्नत निगरानी चेकलिस्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अधिकांश प्रीक्लिनिकल अनुसंधान ने एमटीबीआई के मॉडल का उपयोग किया है जो नैदानिक आबादी में देखे गए बायोमेकेनिकल बलों को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। यहां, यह दिखाया गया है कि किशोर चूहों में आर-एमटीबीआई को प्रेरित करने के लिए एसीएचआई मॉडल का उपयोग कैसे किया जा सकता है। आर-एमटीबीआई के इस बंद सिर वाले मॉडल में अधिक आक्रामक प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण फायदे हैं। सबसे पहले, एसीएचआई आमतौर पर खोपड़ी के फ्रैक्चर, मस्तिष्क रक्तस्राव या मृत्यु का कारण नहीं बनता है, जिनमें से सभीनैदानिक आबादी में "हल्के" टीबीआई के मतभेद होंगे। दूसरा, एसीएचआई को क्रैनियोटॉमी के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, जो महत्वपूर्ण है क्योंकि वे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का कारण बनते हैं जो लक्षणविज्ञान और न्यूरोपैथोलॉजी67 को बढ़ा सकते हैं। तीसरा, एसीएचआई को संज्ञाहरण के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। यह भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि संज्ञाहरण में न्यूरोप्रोटेक्टिव गुण हो सकते हैं और सीखने और स्मृति प्रदर्शन 48,49,50,51,68 के अलावा सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को खराब कर सकते हैं। अंत में, एसीएचआई न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन में सूक्ष्म क्षणिक परिवर्तन पैदा कर सकता है जिसे चोट के तुरंत बाद मूल्यांकन किया जा सकता है।

चूंकि एसीएचआई आम तौर पर चेतना या एपनिया के नुकसान को प्रेरित नहीं करता है, इसलिए यह मॉडल नैदानिक आबादी 69,70,71 के एक महत्वपूर्ण अनुपात में एमटीबीआई की नकल करता है। इसके बावजूद, एसीएचआई मॉडल ने एनएपी स्कोर में उल्लेखनीय कमी का उत्पादन किया। यह कमी एसीएचआई प्रक्रिया के बार-बार प्रशासन के साथ बनी रही, लेकिन आर-एमटीबीआई समूह के भीतर सेंसरिमोटर हानि को नहीं बढ़ाया। यह इंगित करता है कि एसीएचआई मॉडल नैदानिक आबादी72,73 में शंकुधारी या उप-शंकुधारी सिर के प्रभावों के बाद देखी गई हल्की चोट को प्रेरित करता है। एनएपी का एक प्राथमिक लाभ आर-एमटीबीआई के बाद तीव्र समय सीमा में देखे गए सूक्ष्म व्यवहार घाटे का पता लगाना है। यह त्वरित परीक्षा शोधकर्ताओं को उनके व्यवहार प्रतिक्रियाओं के आधार पर चूहों को वर्गीकृत करने की अनुमति दे सकती है। हालांकि, मोटर, संज्ञानात्मक और भावात्मक लक्षण विज्ञान74,75,76 का पता लगाने के लिए सबस्यूट और क्रोनिक टाइम पॉइंट्स पर अधिक मजबूत व्यवहार परीक्षणों का उपयोग आवश्यक हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जबकि आठ चोटों पर एनएपी स्कोर में कोई अंतर नहीं था, कृंतक व्यवहार पर्यावरण में परिवर्तन और प्रयोगकर्ता77,78 के साथ परिचितता से प्रभावित हो सकता है। चूहों को आर-एमटीबीआई या शाम की चोटों को प्रशासित करने से पहले प्रक्रिया कक्ष में जाने की अनुमति दी जानी चाहिए। इसके अलावा, स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए प्रभावों को प्रशासित करने के लिए एक व्यक्ति का जिम्मेदार होना महत्वपूर्ण है।

एसीएचआई मॉडल के पहले उल्लिखित लाभों के बावजूद, यह सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले, प्रतिमान को एक ही सत्र में प्रभावों के अनुकरण की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और वसूली अवधि के बाद दोहराए जाने वाली चोटों की नकल नहीं की गई थी। चोट के बाद, मस्तिष्क मस्तिष्क भेद्यता की एक खिड़की में रहता है जो कृन्तकों में चोट के बाद 1 से 5 दिनों तक फैलता है। एक ही दिन में आठ चोटें लगने से तीव्र और सबस्यूट चोट कैस्केड विकसित नहीं हो पाती है। इसलिए, रुचि के शोध प्रश्न के आधार पर, चोट प्रतिमान को भेद्यता की खिड़की के भीतर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। दूसरा, जबकि एनेस्थेटिक के उपयोग को सीमित करना फायदेमंद है, एसीएचआई मॉडल का एक अनपेक्षित परिणाम चूहों को संयम तनाव के अधीन कर रहा है। यह दिखाया गया है कि तीव्र और पुरानी तनावों के संपर्क में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू हो सकती है, विभिन्न प्रकार के व्यवहारों को प्रभावित कर सकती है, और हिप्पोकैम्पस81,82,83 में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को बदल सकती है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एसीएचआई मॉडल के साथ आर-एमटीबीआई-प्रशासित जानवरों से उच्च गुणवत्ता वाले अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पल स्लाइस का उत्पादन करने के लिए एक स्पष्ट विधि प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल स्थिर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है और दिखाता है कि हिप्पोकैम्पस अभी भी आर-एमटीबीआई के बाद सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन करने में सक्षम है, हालांकि क्षणिक व्यवधान हो सकते हैं। किसी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ, उपयुक्त एफईपीएसपी रिकॉर्ड करने की क्षमता के लिए स्लाइस स्वास्थ्य सर्वोपरि है। मस्तिष्क के ऊतकों को संरक्षित करने के लिए, टुकड़े करने से पहले, यह जरूरी है कि मस्तिष्क कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ में बर्फ-ठंडा रहे। मस्तिष्क को हटाने और टुकड़े करने को जल्दी से किया जाना चाहिए, लेकिन अगर यह देखभाल की कीमत पर नहीं आता है। किशोर जानवरों पर यह प्रोटोकॉल एसीएसएफ को काटने के समाधान के रूप में उपयोग करता है, लेकिन जानवर की उम्र के आधार पर, सुरक्षात्मक काटने के समाधान (जैसे कोलीन-, सुक्रोज-, एनएमडीजी-, या ग्लिसरॉल-आधारित समाधान) की आवश्यकता 84,85,86 हो सकती है।

फील्ड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग शोधकर्ताओं को हिप्पोकैम्पल सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को मापने की अनुमति देती है। हालांकि, तकनीक की कई सीमाएं हैं। मस्तिष्क को टुकड़े करने की प्रक्रिया ने रीढ़ की संख्या87 में परिवर्तन का कारण दिखाया है, जो सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रभावित कर सकता है। विवो रिकॉर्डिंग में उपयोग मार्गों को संरक्षित करेगा और एनेस्थेटाइज्ड याजीवित जानवरों में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के माप की अनुमति देगा। इसके अतिरिक्त, फील्ड रिकॉर्डिंग का उपयोग न्यूरॉन्स के समूहों के गुणों की जांच करता है लेकिन व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में परिवर्तन के बारे में सूचित नहीं करता है। पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग औषधीय या ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़ के जवाब में न्यूरोनल गुणों के बारे में अस्थायी रूप से विस्तृत जानकारी देसकता है। इसके अतिरिक्त, पूरक तकनीकों के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का संयोजन, जैसे कैल्शियम इमेजिंग, वेस्टर्न ब्लोटिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, शोधकर्ताओं को कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति देगा।

संज्ञानात्मक घाटे आमतौर पर आर-एमटीबीआई के बाद रिपोर्ट किए जाते हैं, और वर्तमान प्रोटोकॉल इन घाटे से जुड़ी कुछ अंतर्निहित शारीरिक प्रक्रियाओं की जांच करने में मदद कर सकता है। विशेष रूप से, एसीएचआई प्रक्रिया की हल्की प्रकृति उन जानवरों के जीवनकाल में सिनैप्टिक फिजियोलॉजी में परिवर्तन की जांच करने की संभावना खोलती है जिन्होंने आर-एमटीबीआई का सामना किया है। एसीएचआई मॉडल एमटीबीआई का पारिस्थितिक रूप से मान्य मॉडल प्रतीत होता है जिसका उपयोग आर-एमटीबीआई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एसीएचआई मॉडल का उपयोग करने वाले प्रारंभिक अध्ययनों ने संरचनात्मक क्षति के बिना तीव्र न्यूरोलॉजिकल हानि दिखाई है, जो एक, चार और आठ बार-बार चोट के प्रतिमान61,90 को प्रशासित करती है। भविष्य के अध्ययन जांच करेंगे कि कैसे आर-एमटीबीआई विकास अवधि के दौरान और उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रभावित कर सकता है। सिनैप्टिक फ़ंक्शन के लिए एमटीबीआई और आर-एमटीबीआई के पैथोफिज़ियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझकर, उम्मीद संज्ञानात्मक कार्य को कम करने में मदद करने के लिए संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों को बेहतर ढंग से निर्देशित करना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के विकास में उनके योगदान के लिए विक्टोरिया विश्वविद्यालय में क्रिस्टी प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, अतीत और वर्तमान को धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना को कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर: एफआरएन 175042) और एनएसईआरसी (आरजीपीआईएन-06104-2019) से धन के साथ समर्थित किया गया था। चित्रा 1 खोपड़ी ग्राफिक बायोरेंडर के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 191
हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के एक जागृत बंद-सिर चोट मॉडल का उपयोग करके सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में परिवर्तन का आकलन करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter