Echtzeit-Void-Spot-Assay

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine neue Methode zur Untersuchung des Maus-Voiding-Verhaltens durch die Integration von Videoüberwachung in den konventionellen Void-Spot-Assay. Dieser Ansatz liefert zeitliche, räumliche und volumetrische Informationen über die Entleerungsereignisse und Details des Mausverhaltens während der hellen und dunklen Tagesphasen.

Abstract

Ein normales Entleerungsverhalten ist das Ergebnis der koordinierten Funktion der Blase, der Harnröhre und der Harnröhrenschließmuskeln unter der richtigen Kontrolle des Nervensystems. Um das freiwillige Entleerungsverhalten in Mausmodellen zu untersuchen, haben Forscher den Void Spot Assay (VSA) entwickelt, eine Methode, die die Anzahl und Fläche der Urinflecken misst, die sich auf einem Filterpapier ablagern, das den Boden des Käfigs eines Tieres auskleidet. Obwohl dieser Test technisch einfach und kostengünstig ist, weist er bei der Verwendung als Endpunkt-Assay Einschränkungen auf, einschließlich einer mangelnden zeitlichen Auflösung von Entleerungsereignissen und Schwierigkeiten bei der Quantifizierung überlappender Urinflecken. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine videoüberwachte VSA entwickelt, die wir Real-Time VSA (RT-VSA) nennen und die es uns ermöglicht, die Voiding-Frequenz zu bestimmen, das Void-Volumen und die Voiding-Muster zu beurteilen und Messungen über 6-Stunden-Zeitfenster sowohl während der dunklen als auch der hellen Tagesphase durchzuführen. Die in diesem Bericht beschriebene Methode kann auf eine Vielzahl von Studien an Mäusen angewendet werden, die die physiologischen und neurobehavioralen Aspekte der freiwilligen Miktion in Gesundheits- und Krankheitszuständen untersuchen.

Introduction

Die Urinspeicherung und die Miktion werden von einem zentralen Schaltkreis (Zentralnervensystem) koordiniert, der über die Becken- und Hypogastricusnerven Informationen über den Blasenfüllstatus erhält. Das Urothel, das Epithel, das die Harnwege vom Nierenbecken bis zur proximalen Harnröhre auskleidet, bildet eine dichte Barriere gegen die im Urin vorhandenen Stoffwechselendprodukte und Krankheitserreger. Es ist ein integraler Bestandteil eines sensorischen Netzes, das den Füllzustand der Blase erkennt und an das darunter liegende Gewebe und die afferenten Nerven weitergibt ^1,2. Eine Störung der Urothelbarrier....

Protocol

Urotheliale Piezo1/2 Double-Knockout-Mäuse (Pz1/2-KO , Genotyp: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) und Kontrollen (Pz1/2-C, Genotyp: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) wurden intern aus Elternstämmen aus den Jax-Labors (Piezo1 fl^/fl Stamm # 029213; Piezo2 fl^/fl Stamm # 027720; Upk2^CRE+/- Dehnung # 029281). In den Experimenten wurden sowohl weibliche (1,5–3 Monate alt und 17–20 g schwer) als auch männliche (2–4 Monate alt und 23–29 g schwer) Mäuse verwendet. Für Cyclophosphamid-induzierte Zystitis-Experimente....

Results

Entleerungsverhalten von urothelialen Piezo1/2 Knockout-Mäusen

Es wird angenommen, dass das Urothel während der Speicherphase des Miktionszyklus die Spannung des in der Blase angesammelten Urins wahrnimmt und diesen mechanischen Reiz in zelluläre Reaktionen wie die serosale ATP-Freisetzung umwandelt ^1,3. Wir konnten bereits zeigen, dass mechanisch aktivierte PIEZO1- und PIEZO2-Kanäle im Mausurothel exprimiert .......

Discussion

Die Integration von Videoüberwachung ist eine kostengünstige Modifikation, die mehrere Vorteile gegenüber dem klassischen VSA bietet. Beim klassischen VSA, der typischerweise als Endpunkt-Assay verwendet wird, ist es schwierig, überlappende Void-Spots zu unterscheiden. Dies ist kein triviales Problem, da Mäuse dazu neigen, mehrmals in denselben Bereich zu urinieren, wenn der Test über mehrere Stunden verlängert wird, typischerweise in den Ecken ihres Käfigs. Der erste Vorteil von RT-VSA besteht also darin, dass der Unter.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,00" X 1,00" T-Nut-Profil - Vier offene T-Nuten –   Schnitt auf 10 Zoll	80/20	1010	Menge: 20
1.00" X 1,00" T-Nut-Profil - Vier offene T-Nuten –   geschnitten auf 12 Zoll	80/20	1010	Menge: 6
1.00" X 1,00" T-Nut-Profil - Vier offene T-Nuten –   geschnitten auf 40 Zoll	80/20	1010	Menge: 4
1.00" X 1,00" T-Nut-Profil - Vier offene T-Nuten – Schnitt auf 14,75 Zoll	80/20	1010	Menge: 12
1,00" X 1,00" T-Nut-Profil - Vier offene T-Nuten – geschnitten auf 32 Zoll	80/20	1010	Menge: 5
1/4-20 Doppeleinschub Economy T-Nut	80/20	3280	Menge: 16
1/4-20 Dreifach einschiebende Economy T-Nut	80/20	3287	Menge: 18
10 & 25 Serie 2 Loch - 18mm geschlitzte Inneneckhalterung mit Doppelstütze	80/20	14061	Menge: 6
10 Serie 3 Loch - Gerade flache Platte	80/20	4118	Menge: 8
10 Serie 5 Loch - "L" Flache Platte	80/20	4081	Menge: 8
10 Serie 5 Loch - "T" Flache Platte	80/20	4080	Menge: 8
10 Serie 5 Loch - T-Stück Flache Platte	80/20	4140	Menge: 2
10 Serie Standard Lift-Off Scharnier - Rechtsmontage	80/20	2064	Menge: 2
10 bis 15 Serie 2 Loch - Lite Übergang Inneneckhalterung	80/20	4509	Menge: 6
24"-lange UV-Röhrenleuchten	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Menge: 2 20W Glühbirne – 24" Wellenlänge: 365nm
Acryl Mirror Sheet	Plastics		Menge: 1 82,5 cm x 26,5 cm
Acryl Mirror Sheet	Professional Plastics		Menge: 2 26,5 cm x 30,5 cm
Acryl Mirror Sheet	Plastics		Menge: 2 82,5 cm x 30,5 cm
AR Polycarbonat (UV-Beständigkeit)80	/20	65-2641	Menge: 2 4,5 mm dick, klar, 38,5 cm x 26,5 cm
AR Polycarbonat (UV-Beständigkeit)	80/20	65-2641	Menge: 4 4,5 mm dick, klar, 38,5 cm x 21,5 cm
AR Polycarbonat (UV-Beständigkeit)	80/20	65-2641	Menge: 4 4,5 mm dick, klar, 26,5 cm x 21,5 cm
AR Polycarbonat (UV-Beständigkeit)	80/20	65-2641	Menge: 4 4,5 mm dick, klar 37,5 cm x 23,9 cm
AR Polycarbonat (UV-Beständigkeit)	80/20	65-2641	Menge: 4 4,5 mm dick, klar , 24,4 cm x 23,9 cm
Chromatographiepapier (dünnes Papier)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos Löschpapier (dickes Papier)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad	Software	Version 9.4.0	Grafik- und Statistiksoftware
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparente Folie
Quick Time Player 10.5 Software	Apple		Multimedia Player
Sicherheitsspion	Ben Software		Videoüberwachung Softwaresystem
Standard Endbefestigung, 1/4-20	80/20	3381	Menge: 80
UV durchlässiges Acryl	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Menge: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Wasser-Gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Menge: 4