Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Reconstitution de la cytoarchitecture et de la fonction des tissus épithéliaux humains sur une puce organique à sommet ouvert

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64633
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,3
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Le présent protocole décrit les capacités et les modalités de culture essentielles de l’Open-Top Organ-Chip pour l’établissement et la maturation réussis de cultures d’organes sur puce de pleine épaisseur de tissus primaires (peau, alvéole, voies respiratoires et intestin), offrant la possibilité d’étudier différents aspects fonctionnels de l’interface épithéliale/mésenchymateuse et vasculaire humaine in vitro.

Abstract

Presque tous les organes humains sont tapissés de tissus épithéliaux, comprenant une ou plusieurs couches de cellules étroitement connectées organisées en structures tridimensionnelles (3D). L’une des principales fonctions de l’épithélium est la formation de barrières qui protègent les tissus sous-jacents contre les agressions physiques et chimiques et les agents infectieux. En outre, l’épithélium intervient dans le transport des nutriments, des hormones et d’autres molécules de signalisation, créant souvent des gradients biochimiques qui guident le positionnement et la compartimentation des cellules dans l’organe. En raison de leur rôle central dans la détermination de la structure et de la fonction des organes, les épithéliums sont des cibles thérapeutiques importantes pour de nombreuses maladies humaines qui ne sont pas toujours capturées par les modèles animaux. Outre les différences évidentes d’une espèce à l’autre, la réalisation d’études de recherche sur la fonction barrière et les propriétés de transport de l’épithélium chez les animaux est encore aggravée par la difficulté d’accéder à ces tissus dans un système vivant. Bien que les cultures de cellules humaines bidimensionnelles (2D) soient utiles pour répondre à des questions scientifiques fondamentales, elles donnent souvent de mauvaises prédictions in vivo . Pour surmonter ces limitations, au cours de la dernière décennie, une pléthore de plates-formes biomimétiques micro-modifiées, connues sous le nom d’organes sur puce, ont émergé comme une alternative prometteuse aux tests in vitro et animaux traditionnels. Ici, nous décrivons une puce d’organe à sommet ouvert (ou puce à toit ouvert), une plate-forme conçue pour modéliser les tissus épithéliaux spécifiques aux organes, y compris la peau, les poumons et les intestins. Cette puce offre de nouvelles possibilités de reconstituer l’architecture multicellulaire et la fonction des tissus épithéliaux, y compris la capacité de recréer un composant stromal 3D en incorporant des fibroblastes et des cellules endothéliales spécifiques aux tissus dans un système mécaniquement actif. Cette puce Open-Top fournit un outil sans précédent pour étudier les interactions épithéliales/mésenchymateuses et vasculaires à plusieurs échelles de résolution, des cellules individuelles aux constructions tissulaires multicouches, permettant ainsi la dissection moléculaire de la diaphonie intercellulaire des organes épithélialisés dans la santé et la maladie.

Introduction

Historiquement, les scientifiques se sont appuyés sur des tests précliniques sur des animaux pour la découverte de médicaments, mais un nombre croissant de ces méthodes ont été remises en question en raison d’une faible corrélation avec les résultats humains1. La mise en œuvre des principes des « 3R » pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale incite les scientifiques à trouver de nouvelles méthodes alternatives in vitro pour soutenir l’évaluation préclinique des risques toxicologiques et chimiques2. Cependant, de nombreux modèles in vitro développés à ce jour n’ont pas l’architecture biologique, la complexité cellulaire et l’environnement mécanique nécessaires pour récapituler la nature dynamique des organes vivants humains 3,4.

Les systèmes précliniques in vitro conventionnels utilisent généralement des monocultures 2D de cellules humaines cultivées sur une surface en plastique rigide. Ces méthodes fournissent un outil pour mener des études mécanistiques simples et permettent un dépistage rapide des candidats médicaments. En raison de leur coût relativement faible et de leur grande robustesse, les modèles 2D sont souvent associés à des systèmes automatiques à haut débit et utilisés pour l’identification rapide de candidats médicaments potentiels au début du processus de développement de médicaments 5,6. Cependant, de tels modèles 2D ne fournissent pas d’approche translationnelle pour modéliser les réponses tissulaires, organiques ou systémiques aux candidats thérapeutiques, ce qui est nécessaire pour prédire avec précision l’innocuité et l’efficacité des médicaments au cours de la phase préclinique de leur développement. Les cultures de cellules plates ne récapitulent pas le microenvironnement tissulaire natif, y compris l’interaction multicellulaire complexe, les propriétés biomécaniques et l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus humains7. Les cellules qui se développent sur une surface plane n’acquièrent souvent pas de phénotype mature et, par conséquent, ne peuvent pas répondre aux stimuli pharmacologiques comme elles le feraient dans le tissu natif. Par exemple, les cellules épithéliales alvéolaires humaines primaires cultivées in vitro présentent un phénotype épidermoïde et perdent des marqueurs phénotypiques clés, y compris les protéines surfactantes C et B (SP-C et SP-B)8. En plus d’une différenciation insuffisante, les cellules primaires deviennent souvent insensibles aux facteurs de stress biologiques in vitro, car certaines voies biochimiques associées à l’inflammation tissulaire deviennent non fonctionnelles9. Une telle perte de fonction cellulaire semble être principalement associée à l’utilisation de substrats rigides ainsi qu’à l’absence de facteurs solubles naturellement libérés par les cellules stromales spécifiques aux tissus telles que les fibroblastes pulmonaires et les cellules musculaires lisses10,11.

Comprendre que l’absence de complexité chimio-physique et biologique limite le comportement physiologique des cellules in vitro a favorisé le développement de modèles multicellulaires plus sophistiqués, qui se sont avérés mieux saisir la complexité des tissus humains à l’extérieur du corps12,13. Depuis la création des premiers modèles de co-culture au début des années1970 14, l’introduction d’hydrogels synthétiques et naturels a considérablement amélioré la capacité d’imiter les microenvironnements tissulaires natifs et est devenue un outil inestimable pour stimuler la différenciation cellulaire, guider l’auto-organisation des cellules dans des structures tissulaires et restaurer les fonctions tissulaires natives15,16. Par exemple, lorsqu’elles sont cultivées dans l’échafaudage 3D approprié, les cellules humaines peuvent s’auto-organiser en structures fonctionnelles telles que des sphéroïdes ou des organoïdes, exprimant des marqueurs de cellules souches, et sont capables de s’auto-renouveler17. En revanche, les cellules humaines (y compris les cellules souches), lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats 2D traditionnels, vieillissent rapidement et subissent une sénescence après quelques passages18. En outre, les hydrogels peuvent être « adaptés » pour correspondre à des propriétés tissulaires spécifiques telles que la porosité, la taille des pores, l’épaisseur des fibres, la viscoélasticité, la topographie et la rigidité, ou modifiés avec des composants cellulaires dérivés de tissus et/ou des molécules bioactives permettant l’émulation des conditions physiologiques ou pathologiques19,20. Malgré leur énorme potentiel pour les tests de médicaments, les modèles 3D à base d’hydrogel utilisés dans la recherche pharmaceutique ne récapitulent pas complètement la cytoarchitecture complexe des tissus in vivo et manquent de stimuli hémodynamiques et mécaniques importants normalement présents dans le corps humain, y compris la pression hydrostatique, l’étirement cyclique et le cisaillement des fluides21.

Les systèmes microphysiologiques (MPS) tels que les organes sur puce (OOC) sont récemment apparus comme des outils capables de capturer des réponses physiologiques complexes in vitro22,23. Ces modèles utilisent souvent l’utilisation de plates-formes microfluidiques, qui permettent de modéliser le microenvironnement dynamique des organes vivants.

Nous avons combiné les principes de la bio-ingénierie tissulaire 3D et de la mécanobiologie pour créer un modèle de puce à toit ouvert de tissu épithélial humain complexe. Cela nous a permis de récapituler de près le microenvironnement multicellulaire et dynamique des tissus épithéliaux. Cela inclut les indices biochimiques et biomécaniques spécifiques aux tissus naturellement présents dans les organes vivants, mais souvent négligés par les modèles in vitro traditionnels24. L’Open-Top Chip comprend deux compartiments : un compartiment vasculaire (Figure 1A) et un compartiment stromal (Figure 1B) séparés par une membrane poreuse, permettant la diffusion des nutriments entre les deux chambres (Figure 1C). Le compartiment vasculaire est exposé à un écoulement continu de fluide pour récapituler le stress physiologique de cisaillement, tandis que la conception extensible de la chambre stromale permet de modéliser la contrainte mécanique associée aux mouvements respiratoires ou au péristaltisme intestinal. Le compartiment stromal abrite l’échafaudage d’hydrogel 3D accordable conçu pour soutenir la croissance physiologique des fibroblastes spécifiques aux tissus. Il possède un couvercle amovible qui facilite l’établissement d’une interface air-liquide, une condition qui permet une plus grande émulation de la physiologie humaine des tissus muqueux ainsi qu’un accès direct au tissu pour administrer des médicaments directement sur la couche épithéliale. La figure supplémentaire 1 présente certains des éléments clés de la conception de la puce à toit ouvert, y compris les dimensions et les compartiments biologiques (figure supplémentaire 1A-D), ainsi que les principales étapes techniques décrites dans le présent protocole (figure supplémentaire 1E).

La perfusion de la puce Open-Top est réalisée à l’aide d’une pompe péristaltique programmable (Figure 1D). La configuration de la pompe péristaltique permet de perfuser simultanément 12 puces à toit ouvert. La plupart des incubateurs peuvent héberger deux configurations permettant la culture de jusqu’à 24 puces par incubateur. L’étirement mécanique est réalisé à l’aide d’un régulateur de pression à vide programmable sur mesure (Figure 1E). Il se compose d’un régulateur de vide électropneumatique contrôlé électroniquement par un convertisseur numérique-analogique. En d’autres termes, le régulateur de vide électropneumatique génère un profil de vide sinusoïdal avec une amplitude et une fréquence déterminées par l’utilisateur. Une déformation cyclique allant de 0% à 15% est générée en appliquant une pression négative au canal de vide de la puce Open-Top à une amplitude allant de 0 à -90 kPa et une fréquence de 0,2 Hz. Il s’agit d’un système sur mesure équivalent à l’unité de contrainte Flexcell disponible dans le commerce précédemment adoptée et décrite dans d’autres documents25. Pour imiter la déformation mécanique des tissus associée, par exemple, au mouvement respiratoire du poumon ou au péristaltisme de l’intestin, l’actionneur pneumatique applique des ondes sinusoïdales de vide/déformation dont l’amplitude et l’amplitude peuvent être ajustées pour correspondre au niveau physiologique de déformation et à la fréquence que les cellules humaines subissent dans leur tissu natif.

Ici, nous décrivons une méthode efficace et reproductible pour l’ingénierie et la culture d’équivalents d’épithélium organotypiques sur un prototype de plate-forme Open-Top Chip. Il permet la génération de modèles d’organes complexes tels que la peau, l’alvéole, les voies respiratoires et le côlon tout en intégrant un écoulement de fluide vasculaire et des étirements mécaniques. Nous décrirons les aspects techniques clés qui doivent être pris en compte lors de la mise en œuvre des principes de l’ingénierie tissulaire pour générer des modèles épithéliaux complexes. Nous discuterons des avantages et des limites possibles de la conception actuelle.

Un aperçu des principales étapes utilisées pour atteindre la maturation des tissus et des organes, y compris les paramètres d’écoulement et d’étirement, est présenté dans : Figure 2 pour la peau, Figure 3 pour l’alvéole, Figure 4 pour les voies respiratoires et Figure 5 pour l’intestin. Des informations supplémentaires concernant la composition des milieux et les réactifs utilisés pour la culture des différents modèles d’organes sont incluses dans les tableaux supplémentaires (tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 3 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les colonoïdes humains ont été obtenus à partir de résections intestinales conformément aux directives du Comité institutionnel de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Activation de Surface

  1. Préparation du tampon d’activation
    1. Placer les réactifs tampons de réticulation et de solvant sous l’enceinte de biosécurité (ESB) et les laisser s’équilibrer à température ambiante (RT) pendant 10 minutes avant utilisation.
    2. Reconstituer 5 mg de réticulant dans 5 mL du tampon solvant à l’aide d’un contenant stérile imperméable à la lumière ou d’un tube conique transparent de 15 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium pour protéger la solution de réticulation de l’exposition directe à la lumière.
    3. Vortex la solution pendant 1 min pour éliminer tous les touffes, puis pipeter 50 μL de la solution de réticulation directement dans le canal inférieur de la puce et 150 μL dans la chambre ouverte.
    4. Retirez tout excès de solution de réticulation de la surface de la puce à l’aide d’un aspirateur. Ensuite, pipeter 50 μL supplémentaires de la solution de réticulation directement dans le canal inférieur de la puce et 150 μL dans la chambre à dessus ouvert pour éliminer toute bulle d’air restante.
  2. Activation avec machine de réticulation UV
    1. Retirez délicatement le couvercle de la puce sous l’ESB et conservez-le dans un récipient stérile.
    2. Transférer les copeaux contenant la solution de réticulation dans une boîte de Pétri, fermer la boîte de Petri pour éviter toute contamination et placer la boîte avec les copeaux sous la réticulation UV.
      REMARQUE: Retirez le couvercle de la boîte de Petri pour maximiser l’exposition aux UV.
    3. Réglez la machine de réticulation UV avec une longueur d’onde maximale de 365 nm à une intensité de 100 μJ/cm2 et allumez la lumière UV pendant 20 min.
      REMARQUE: Après 20 min de traitement UV, la solution de réticulation aura l’air plus foncée (brune).
    4. Ramener les copeaux sous l’ESB et aspirer la solution de réticulation oxydée. Ensuite, rincez tous les copeaux trois fois avec le tampon solvant et laissez sécher les copeaux sous l’ESB pendant 5 à 10 minutes pour terminer la fonctionnalisation chimique de la surface du polydiméthylsiloxane (PDMS).

2. Préparation de l’équivalent stroma

  1. Préparation du tampon de reconstruction 10x (100 mL)
    1. Dissoudre 2,2 g de bicarbonate de sodium dans 75 mL de NaOH 0,067 M dans de l’eau bidistillée.
    2. Ajouter 4,76 g d’HEPES et porter le volume à 100 mL en utilisant de l’eau bidistillée.
    3. Filtrer stérile la solution sous l’ESB à l’aide d’un filtre stérile jetable à dessus de bouteille avec une membrane de 0,22 μm.
      REMARQUE: La solution est stable pendant environ 6 mois lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
  2. Estimation du volume de la solution de prégel
    1. Multipliez le nombre de copeaux nécessaires à l’expérience par 150 μL (volume intérieur de la chambre centrale ouverte) pour estimer la quantité de solution de prégel requise pour l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 150) μL
    2. Préparer la solution de prégel de collagène sur glace en mélangeant : 1 volume de 10x EMEM contenant les cellules au choix, 1 volume de tampon de reconstruction 10x (voir étape 2.1), 8 volumes de solution de collagène I (10 mg/mL) et 1 μL de solution 1 N NaOH pour chaque mg de collagène I.
      NOTE: Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de +15% pour tenir compte des erreurs expérimentales; L’exemple décrit à la section 2.2 fournit une procédure détaillée étape par étape pour préparer suffisamment de solution de prégel pour 12 copeaux et un volume supplémentaire de 15%.
  3. Préparation de la solution de pré-gel pour l’équivalent stroma (pour 12 copeaux)
    1. Apportez les solutions suivantes sous le BSC sur la glace : 10x EMEM; 10x Tampon de reconstruction (voir étape 2.1); Solution de collagène I (10 mg/mL); et solution stérile de NaOH 1 N.
    2. Cultivez des cellules mésenchymateuses spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à ce que 80% à 90% confluentes, puis dissociez les cellules à l’aide de trypsine ou d’autres méthodes recommandées par le fournisseur de cellules. Recueillir les cellules dans une pastille par centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 24 °C.
    3. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 225 μL d’EMEM 10x glacé et ajoutez 225 μL de tampon de reconstruction 10x glacé (voir étape 2.1). Mélanger la solution en pipetant doucement de haut en bas, puis ajouter 1 800 μL de solution de collagène I glacée.
    4. Pipeter de haut en bas 5-6 fois, en évitant les bulles pour mélanger la solution de prégel sur la glace.
  4. Incorporation de l’équivalent stroma sur puce (pour 12 puces)
    1. Neutraliser la solution de prégel avec 18 μL de NaOH 1 N. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas 5-6 fois, puis pipeter 150 μL d’hydrogel chargé de cellules dans la chambre centrale de la puce Open-Top en évitant les bulles.
      REMARQUE : Si un micropatronage est nécessaire, veuillez passer à l’étape suivante (section 3).
    2. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes, y compris un bouchon de tube de centrifugation rempli de 2 ml de ddH 2 O stérile dans chaque boîte de Pétri, et incuber la ou les boîtes de Petri dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO2.
      REMARQUE: Après 90 min, l’hydrogel chargé de cellules sera complètement polymérisé.

3. Micropatterning de surface (facultatif)

  1. Effectuer un micromodelage de surface de l’hydrogel stromal après avoir pipeté l’hydrogel de collagène neutralisé (encore à l’état liquide) à l’aide de tampons imprimés en 3D.
    REMARQUE: Les timbres imprimés en 3D peuvent être obtenus dans divers modèles personnalisables, comme décrit précédemment ailleurs24.
  2. Pipeter 20 μL de la solution de pré-gel de collagène I neutralisée sur la surface à motifs d’un tampon stérile imprimé en 3D et insérer le tampon à l’intérieur (sur le dessus) de la chambre ouverte pendant que l’hydrogel stromal est encore sous forme liquide.
  3. Enlevez tout résidu d’hydrogel qui pourrait se répandre du haut de la chambre ouverte à l’aide d’un aspirateur (ou d’une pipette). Regroupez toutes les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes et incluez un bouchon de tube conique centrifuge de 15 ml rempli de 2 ml de ddH2O stérile dans chaque boîte de Poutri.
  4. Incuber toutes les boîtes de Petri à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 90 min, puis ramener les copeaux sous l’ESB et retirer délicatement les tampons à l’aide d’une pince à épiler de précision pour réduire le risque d’endommager l’hydrogel.

4. Recouvrir la surface épithéliale et vasculaire de protéines ECM spécifiques aux tissus

  1. Recouvrir la chambre microfluidique vasculaire de protéines de matrice extracellulaire
    1. Multipliez le nombre de puces nécessaires à l’expérience par 20 μL (volume du canal vasculaire) pour estimer le volume de solution de revêtement ECM vasculaire requis pour l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 20) μL
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de 15 % pour tenir compte des erreurs expérimentales.
    2. Préparez la solution de revêtement ECM vasculaire pour toutes les puces (par exemple, 300 μL pour 12 puces) en utilisant du PBS ou du HBSS glacé.
      NOTA : Reportez-vous au tableau spécifique du protocole d’organe dans la section des matériaux supplémentaires (Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin) pour identifier les réactifs spécifiques et la composition ECM recommandée.
    3. Pipeter 20 μL de solution de revêtement ECM vasculaire dans le canal vasculaire de chaque puce.
  2. Recouvrir la surface apicale de l’équivalent stromal de protéines de matrice extracellulaire
    1. Multipliez le nombre de puces nécessaires à l’expérience par 50 μL (volume du canal vasculaire) pour estimer le volume de solution de revêtement ECM épithéliale nécessaire à l’expérience :
      Volume nécessaire = (Nombre de puces x 50) μL
      REMARQUE: il est recommandé de préparer un volume supplémentaire de 15% pour tenir compte des erreurs expérimentales.
    2. Préparez suffisamment de solution de revêtement ECM pour toutes les puces (par exemple, 750 μL par 12 puces) dans du PBS ou du HBSS glacé et transférez 50 μL de solution de revêtement ECM épithéliale directement sur la surface de l’hydrogel.
      NOTA : Reportez-vous au tableau spécifique du protocole d’organe dans la section des matériaux supplémentaires (Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin) pour identifier les réactifs spécifiques et la composition ECM recommandée.
    3. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes, y compris un capuchon de tube conique centrifuge de 15 ml rempli de 2 ml de ddH 2 O stérile dans chaque boîte de Pétri, et incuber la ou les boîtes de Petri dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO 2 pendant2h avant de procéder à l’ensemencement des cellules épithéliales.

5. Ensemencement des cellules épithéliales sur l’équivalent stromal

  1. Culture de cellules épithéliales
    1. Culture de cellules épithéliales spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à 80% à 90% confluents.
    2. Dissocier les cellules en utilisant des procédures enzymatiques protéolytiques recommandées par le fournisseur de cellules.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, récoltez les cellules épithéliales à faible passage (P1-P2) pendant la phase de croissance active lorsqu’elles atteignent entre 70% et 90% de confluence.
    3. Une fois dissociées, centrifuger les cellules et les recueillir sous forme de pastille.
    4. Remettez les cellules épithéliales en suspension à la densité de cellules/fragments appropriée indiquée dans le tableau du protocole spécifique des organes.
      REMARQUE : Dans cette étude, une solution cellulaire a été utilisée à une densité de 3 x 10 6 cellules/mL pour la peau, 1 x 10 6 cellules/mL pour l’alvéole, 6 x 10 6 cellules/mL pour les voies respiratoires et 8 x 10 6 fragments/mL pour l’intestin.
  2. Ensemencement des cellules épithéliales
    1. Transférer les puces de l’incubateur dans l’ESB. Aspirer la solution d’enrobage du canal vasculaire et rincer le canal microfluidique vasculaire trois fois avec 50 μL de milieu de culture de cellules endothéliales fraîches.
    2. Aspirer la solution d’enrobage de la surface de l’hydrogel et rincer la surface stromale trois fois avec 100 μL de milieu de culture cellulaire épithéliale frais pour éliminer tout excès de solution de revêtement.
    3. Aspirer le milieu ascendant et ensemencer la surface de l’hydrogel avec 50 μL de la suspension de cellules épithéliales en utilisant la densité cellulaire appropriée, comme indiqué dans les tableaux supplémentaires, puis transférer les copeaux dans l’incubateur pendant 2 h (ou toute la nuit pour les colonoïdes).
    4. Rincez doucement la surface de l’hydrogel avec le milieu de culture cellulaire deux fois pour éliminer les débris cellulaires. Enfin, rafraîchissez le milieu en l’autoclavant dans des récipients autoclavables scellés et connectez les copeaux à la pompe péristaltique.

6. Connexion des puces au flux

  1. Préparation des pièces fluidiques
    1. Couper 2 pouces de tube de transfert en élastomère thermoplastique (TPE) à base de polypropylène biocompatible (Table des matériaux) pour préparer le tube microfluidique court nécessaire pour connecter les copeaux aux réservoirs de support.
    2. Coupez 7,5 pouces de tube de transfert TPE biocompatible pour produire le long tube microfluidique.
    3. Préparez suffisamment de connecteurs métalliques 18 G et 19 G (Tableau des matériaux).
      NOTE: Il est recommandé de préparer et de stériliser les tubes et les connecteurs décrits aux étapes 6.1.1 et 6.1.2 au moins 1 jour avant de connecter les copeaux à toit ouvert aux pompes péristaltiques.
    4. Percez le couvercle de chaque réservoir moyen avec une aiguille hypodermique de 4 pouces (Tableau des matériaux).
  2. Dégazage moyen
    1. Laisser le milieu de culture cellulaire s’équilibrer à température ambiante (RT).
    2. Transférer le volume de milieu nécessaire dans un tube filtrant conique.
    3. Appliquer une pression de vide négative de -20 PSI pour dégazer le fluide (filtration sous vide).
      REMARQUE: Si un vide n’est pas disponible, le milieu de culture cellulaire peut être laissé à équilibrer dans l’incubateur pendant la nuit pour obtenir des résultats similaires.
  3. Préparez la puce à toit ouvert pour l’écoulement du fluide
    1. Amener les copeaux et les pièces fluidiques stériles sous l’ESB et aligner le couvercle (partie supérieure) de la puce à toit ouvert pour sceller le prototype de puce à toit ouvert avant de commencer l’écoulement du fluide.
    2. Pipeter 200 μL du milieu de culture cellulaire dégazé (voir les tableaux spécifiques aux organes) dans l’orifice d’entrée des canaux supérieur et inférieur de la puce tout en veillant à éviter les bulles.
    3. Pipeter 300 μL du milieu de culture dans le tube microfluidique court pour amorcer la surface interne des tubes et connecter le tube court aux entrées des canaux supérieur et inférieur de la puce.
  4. Connecter et amorcer les surfaces microfluidiques
    1. Placez les réservoirs de milieu dans le rack de la ferme, connectez l’aiguille hypodermique à l’entrée inférieure des copeaux et, enfin, accueillez tous les copeaux dans le ou les supports de logement à l’intérieur de l’incubateur.
    2. Connectez les puces à la pompe péristaltique, puis inspectez tous les connecteurs pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’il n’y a pas de fuite visible du milieu de culture cellulaire.
    3. Utilisez le bouton Purger de la pompe et maintenez-la enfoncée pendant environ 15 s ou jusqu’à ce que les gouttelettes du milieu de culture cellulaire apparaissent à l’extrémité du tube de sortie.
    4. Utilisez le système de commande de la pompe pour régler le débit approprié des puces d’organe (Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Figure 5).

7. Maintenance des puces

  1. Maintenance des puces d’organes
    1. Préparer le milieu de culture de cellules fraîches pour l’épithélium et/ou l’endothélium et effectuer les étapes de dégazage (comme décrit précédemment à l’étape 6.2).
    2. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférer les copeaux de l’incubateur à l’ESB et retirer le volume de fluide restant dans les réservoirs.
    3. Remplacez le milieu de culture cellulaire dans les réservoirs d’entrée supérieur et inférieur par 5 mL de milieu de culture cellulaire frais et replacez le ou les supports de boîtier de copeaux dans l’incubateur. Connectez les copeaux à la pompe péristaltique et redémarrez le flux.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
    4. Répétez les étapes 7.1.1 à 7.1.3 tous les deux jours, conformément à la figure 2, à la figure 3, à la figure 4 et à la figure 5.
  2. Mise en place d’une interface air-liquide (ALI)
    1. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférez les copeaux de l’incubateur à l’armoire de biosécurité et retirez le volume de milieu restant dans le réservoir supérieur.
    2. Aspirez doucement tout le fluide du canal microfluidique supérieur et serrez le tube microfluidique court connecté aux entrées supérieures à l’aide de clips liants pour réduire l’évaporation du média et le maintien de l’ALI.
    3. Replacez la puce à toit ouvert sur le(s) support(s) de boîtier dans l’incubateur et reconnectez les puces à la pompe péristaltique.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
    4. Reprenez l’écoulement en démarrant la pompe péristaltique.
  3. Étirement (facultatif)
    1. Mettez la pompe péristaltique en pause et connectez les orifices de vide des puces au module de vide à l’aide de deux longs tubes microfluidiques par puce.
    2. Utilisez le module de vide pour ajuster le réglage d’étirement à l’état recommandé pour chaque organe tel que spécifié dans les tableaux du protocole d’organes: Tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 2 pour les voies respiratoires; et le tableau supplémentaire 4 pour l’intestin.
    3. Inspectez visuellement les raccords du tube pour vous assurer que tous les copeaux sont correctement connectés et qu’il n’y a pas de gouttelettes visibles de fluide qui coule.
    4. Reprenez l’écoulement en démarrant la pompe péristaltique.

8. Ensemencement des cellules endothéliales dans le compartiment vasculaire

  1. Préparer les cellules et les puces pour l’ensemencement des cellules vasculaires
    1. Culture des cellules endothéliales spécifiques aux tissus selon les directives des fournisseurs jusqu’à ce que 80% à 90% confluent. Dissocier les cellules à l’aide d’une procédure enzymatique protéolytique (recommandée par le fournisseur) et, enfin, remettre les cellules endothéliales en suspension dans une solution de 3 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, récoltez les cellules endothéliales à faible passage (P2-P4) pendant la phase de croissance active lorsqu’elles atteignent entre 70% et 90% de confluence.
    2. Mettez la pompe péristaltique en pause. Transférez les copeaux de l’incubateur à l’ESB, débranchez-les des réservoirs de média et de tout tube connecté, puis regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri distinctes.
    3. Rafraîchir le milieu de culture cellulaire du compartiment épithélial avec un milieu de culture de cellules épithéliales fraîches. Rincer le canal vasculaire avec un milieu de culture de cellules d’endothélium frais deux fois, puis aspirer le milieu du compartiment vasculaire.
  2. Ensemencement des cellules endothéliales
    1. Ensemencer le canal inférieur (vasculaire) avec 25 μL de suspension de cellules endothéliales (3 x 106 cellules/mL), retourner les copeaux à l’envers pour permettre aux cellules endothéliales de se fixer à la surface supérieure de la chambre microfluidique.
      REMARQUE : Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire par puce (600 μL par 12 puces).
    2. Regroupez les chips dans des boîtes de Pétri. Remettez-les dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO2, et laissez les cellules endothéliales se fixer pendant 1 h.
    3. Après 1 h, transférer les copeaux de l’incubateur à l’ESB. Rincer le canal vasculaire avec le milieu de culture de cellules endothéliales deux fois pour éliminer les débris cellulaires.
    4. Répétez les étapes 8.2.1-8.2.2 pour ensemencer à nouveau le canal vasculaire avec des cellules endothéliales et poser les copeaux à plat pour faciliter l’adhésion des cellules endothéliales à la surface inférieure du canal vasculaire.
  3. Reconnectez la puce à l’écoulement
    1. Remplir le réservoir du milieu vasculaire avec le milieu de culture cellulaire vasculaire dégazé sous l’ESB.
    2. Replacez les copeaux à l’intérieur du ou des supports de boîtier de puces et reconnectez les copeaux aux réservoirs de milieu à une extrémité à la pompe péristaltique à l’autre extrémité.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la fonction Purge pour rafraîchir rapidement le milieu dans le compartiment vasculaire et réduire le risque de bulles d’air.
    3. Inspectez visuellement les connexions microfluidiques pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’il n’y a pas de gouttelettes visibles de goutte moyenne. Ensuite, reprenez l’écoulement du fluide en démarrant la pompe péristaltique.

9. Tests d’évaluation communs

  1. Déconnecter les puces pour les tests des points de terminaison
    1. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le(s) support(s) du boîtier de copeaux. Transférez le(s) support(s) de boîtier de puces de l’incubateur à l’ESB et libérez les copeaux.
    2. Lavez doucement la chambre centrale de la puce Open-Top avec le milieu de culture de cellules épithéliales et le canal vasculaire avec le milieu de culture endothélium deux fois pour éliminer tout débris cellulaire.
    3. Retirez le couvercle de la puce Open-Top pour accéder au compartiment apical de la puce à l’aide d’une pince à épiler.
  2. Immunomarquage pour la microscopie à fluorescence
    1. Procéder à la fixation, à la perméabilisation et au blocage conventionnels des échantillons.
      NOTE: Dans cette étude, les échantillons ont été fixés dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant 1 h, suivis d’un rinçage au PBS, d’une perméabilisation dans du Triton X-100 à 0,1% pendant 40 min et d’un blocage dans 1% d’albumine sérique bovine pendant 1 h.
    2. Incuber les puces avec des anticorps primaires (Table of Materials) à 4 °C pendant une nuit. puis laver deux fois les compartiments épithéliaux et endothéliaux des puces avec 200 μL de PBS. Ensuite, continuez avec les anticorps secondaires appropriés pendant 2 h.
      REMARQUE: Diluer les anticorps primaires et les anticorps secondaires dans PBS + 1% BSA à une dilution de 1:100 (anticorps primaire) et 1:200 (anticorps secondaire).
  3. Immunohistochimie
    1. Extraire les équivalents stromaux de la chambre principale de la puce Open-Top à l’aide d’une pince à épiler, les recueillir dans un tube de 1,5 ml rempli de formol tamponné neutre à 10% et incuber pendant au moins 24 heures.
    2. Transférez l’équivalent stromal fixe au processeur de tissu et suivez les étapes ci-dessous pour obtenir une déshydratation optimale de l’échantillon.
      1. Immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 70% pendant 90 min.
      2. Retirer l’éthanol à 70% et immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 80% pendant 90 min.
      3. Retirer l’éthanol à 80% et plonger l’hydrogel dans de l’éthanol à 95% pendant 90 min.
      4. Retirer l’éthanol à 95% et immerger l’hydrogel dans de l’éthanol à 100% pendant 90 min deux fois.
      5. Retirer l’éthanol à 100% et immerger l’hydrogel dans une solution de xylène pendant 120 min deux fois.
      6. Retirer la solution de xylène et infiltrer deux fois les équivalents stromaux traités dans de la cire de paraffine pendant 120 min (~2 h).
    3. Intégrez les équivalents stromaux infiltrés dans les blocs de paraffine sectionnants.
    4. À ce stade, les équivalents stromaux peuvent être sectionnés en blocs de paraffine à l’aide d’un microtome et traités selon les techniques histologiques conventionnelles26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microstructuration de surface
La microstructure de la matrice extracellulaire (ECM) peut être utilisée pour reproduire la configuration spatiale de l’interface de la crypte intestinale. La configuration de la puce Open-Top peut être modifiée pour intégrer des timbres à micromotifs spécialement conçus pour imiter la topographie naturelle de l’interface épithélium-stroma colique (Figure 6A,B) et des cryptes intestinales à l’échelle micrométrique (Figure 6C-E). Veuillez noter que nous avons utilisé une surface plane (non à motifs) pour les modèles de peau, de voies respiratoires et d’alvéole. Le timbre a été utilisé dans ce cas pour obtenir une surface d’hydrogel uniforme pour ensemencer les cellules épithéliales. Nous avons opté pour un design qui pourrait imiter l’architecture naturelle de la muqueuse intestinale humaine, consistant en l’alternance de dômes positifs et négatifs imitant les cryptes intestinales.

Modèles d’organes
Nous avons cultivé et différencié quatre épithéliums différents (peau, alvéole, voies respiratoires et intestin) en utilisant le prototype Open-Top Chip pour prouver la polyvalence de cette plateforme biomimétique. Des coupes histologiques des puces d’organes confirment la présence de cellules épithéliales phénotypiquement distinctes et représentatives de : un épithélium stratifié dans le cas de la peau (Figure 7), un épithélium cylindrique pseudo-stratifié dans le cas des voies respiratoires (Figure 8 et Vidéo complémentaire 1), épithélium pavimenteux simple dans le cas de l’alvéole (Figure 9), et l’épithélium cylindrique simple dans le cas de l’intestin (Figure 10). La peau, les voies respiratoires et les cellules alvéolaires ont toutes été obtenues auprès de fournisseurs disponibles dans le commerce (comme indiqué dans le tableau des matériaux).

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la puce Open-Top et de la configuration microfluidique utilisée dans cette étude. (A-C) Vue de dessus, projection couche par couche et rendu 3D montrant la conception prototype de puce à toit ouvert comprenant le couvercle supérieur amovible avec canal microfluidique encastré (bleu), les deux canaux semi-lunaires à vide le long de la chambre de culture (gris) et les canaux microfluidiques endothéliaux spiralés inférieurs (magenta). (D) Porte-puce sur mesure (également appelé « système agricole »), y compris le support de boîtier de puce (flèche rouge), la pompe péristaltique et les réservoirs (flèche jaune) disposés dans une configuration qui s’intègre dans un incubateur de culture cellulaire commun. € Actionneur pneumatique, l’instrument qui contrôle la pression négative appliquée au canal de vide des puces, qui est utilisé pour générer la force mécanique cyclique que les cellules subissent pendant la respiration ou le mouvement du péristaltisme (étirement). Cette figure a été adaptée avec la permission de Varone et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Vue d’ensemble technique du protocole de puce cutanée à toit ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’actions pour la préparation de la puce cutanée à toit ouvert et (B) fournissant l’étape biologique clé de la culture de puce cutanée à toit ouvert. Dans la phase initiale de la préparation de la puce, des cellules mésenchymateuses (fibroblastes) sont incorporées dans le gel et chargées dans la puce Open-Top pour former la couche stromale, qui est recouverte pendant 2-4 h et ensemencée de cellules épithéliales. Une fois que les cellules épithéliales ont formé une monocouche compacte, elles sont exposées à l’air (ALI). Le système biologique est maintenu sous régime ALI jusqu’à ce qu’il soit sacrifié pour analyse le jour 14. L’étirement mécanique peut être appliqué lorsque le système est sous flux et à ALI. L’étirement est conservé jusqu’à ce que les tissus soient sacrifiés pour analyse. Des renseignements supplémentaires sur la composition des milieux, les réactifs spécifiques et les types de cellules se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Vue d’ensemble technique du protocole à puce alvéole à toit ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’actions pour la préparation de la puce alvéole à toit ouvert et (B) fournissant l’étape biologique clé de la culture alvéole-puce à toit ouvert. Dans la phase initiale de la préparation de la puce, des cellules mésenchymateuses (fibroblastes) sont incorporées dans le gel et chargées dans la puce Open-Top pour former la couche stromale, qui est recouverte pendant 2 à 4 heures et ensemencée de cellules épithéliales des voies respiratoires dans un milieu supplémenté en KIAD (voir tableau supplémentaire 2). Le milieu supplémenté en EGF est maintenu pendant ~4 jours pour soutenir la croissance des cellules épithéliales. L’épithélium est ensuite exposé à l’air (ALI) pendant ~10 jours pour obtenir une maturation tissulaire complète. Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires sont ensemencées au jour 14, et le système biologique est maintenu sous ALI et régime d’écoulement jusqu’à ce qu’il soit sacrifié pour analyse le jour 21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Aperçu technique du protocole de puce à toit ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’actions pour la préparation de la puce des voies respiratoires à toit ouvert et (B) fournissant l’étape biologique clé de la culture des puces des voies respiratoires à toit ouvert. Dans la phase initiale de la préparation de la puce, des cellules mésenchymateuses (fibroblastes et/ou cellules musculaires lisses) sont incorporées dans le gel et chargées dans la puce Open-Top pour former la couche stromale, qui est recouverte pendant 2 à 4 heures et ensemencée de cellules épithéliales dans un milieu supplémenté en EGF (voir tableau supplémentaire 3). Le milieu supplémenté en EGF est maintenu pendant ~4 jours pour soutenir la croissance des cellules épithéliales. L’épithélium est ensuite exposé à l’air (ALI) pendant ~10 jours pour obtenir une maturation tissulaire complète. Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires sont ensemencées au jour 14, et le système biologique est maintenu sous ALI et régime d’écoulement jusqu’à ce qu’il soit sacrifié pour analyse le jour 21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Aperçu technique du protocole de puce intestinale ouverte. (A) Schéma montrant la séquence d’actions pour la préparation de la puce intestinale à dessus ouvert et (B) fournissant l’étape biologique clé de la culture de puces intestinales ouvertes. Dans la phase initiale de la préparation de la puce, des cellules mésenchymateuses (fibroblastes du côlon) sont intégrées dans le gel et chargées dans la puce Open-Top pour former la couche stromale, qui est recouverte pendant 2 à 4 heures et ensemencée de fragments de colonoïdes épithéliaux obtenus à partir de résections cliniques. Un milieu de culture cellulaire, y compris des suppléments (ROCK et CHIR, voir le tableau supplémentaire 4) est nécessaire pendant l’étape d’ensemencement pour maintenir la viabilité des cellules coloïdes et la morphologie physiologique. Différents milieux sont ensuite utilisés pour piloter l’expansion (jours 1 à 6) et la maturation (jours 6 à 9) de l’épithélium colique. Les cellules endothéliales microvasculaires du côlon sont ensemencées au jour 6 à l’aide d’un milieu de culture de cellules endothéliales (EGM2 MV), puis cultivées sous flux avec un milieu d’expansion épithéliale pendant 10 jours supplémentaires. L’épithélium est exposé à l’ALI à partir du jour 10 pour favoriser davantage la maturation des cellules épithéliales. L’étirement mécanique peut être appliqué au système à partir du jour 13 et maintenu jusqu’au jour 16, lorsque le modèle d’organe est sacrifié pour l’analyse des points finaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Marquage à micromotifs. (A) La vue latérale et supérieure de l’estampille montrant la texture à l’échelle microscopique (500 μm de hauteur et 250 μm de largeur-piliers) est utilisée pour recréer l’interface du tissu cryptique colique et la vue supérieure et latérale de l’ensemble tampon-puce, montrant l’ajustement des deux éléments lorsqu’ils sont utilisés pour couler la surface du gel. (B) Vue latérale inclinée montrant l’interfaçage du timbre et de la puce. (C-E) Images de la surface du gel micromodelé avec et sans cellules. Barres d’échelle : 200 μm. Cette figure a été adaptée avec la permission de Varone et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Données représentatives obtenues avec la puce cutanée à toit ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’action pour la préparation de la puce cutanée à dessus ouvert et fournissant les étapes biologiques clés de la culture de puce cutanée à dessus ouvert. (B) Coloration par fluorescence de la cytokératine 14, de la cytokératine 10, de l’involucrine et de la fillagrine et H & E montrant un épiderme stratifié multicouche mature différencié sur puce. Barres d’échelle: 100 μm. (C) Image de dessus de la puce de peau (barres d’échelle: 5 mm) et de la coupe transversale H & E (barres d’échelle: 100 μm) montrant la présence des fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique. (D) Coloration par fluorescence PECAM-1, VE-Cadhérine et Von Willebrand montrant la différenciation des cellules endothéliales microvasculaires humaines co-cultivées dans la puce cutanée à dessus ouvert. Barres d’échelle: 20 μm. (E) Rendu conceptuel 3D Cartoon de la puce de peau à toit ouvert. Cette figure a été adaptée avec la permission de Varone et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Données représentatives obtenues avec la puce des voies respiratoires à toit ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’action pour la préparation des puces des voies respiratoires à toit ouvert et fournissant l’étape biologique clé de la culture des puces des voies respiratoires à toit ouvert. (B) MUC5AC (gobelet), α et β-tubuline (cellules ciliées), protéine cellulaire de Clara 16 (cellules club), p63 (cellules basales/progénitrices) et coloration par fluorescence ZO-1 montrant un épithélium des voies respiratoires mature. Barres d’échelle: 20 μm. (C) Vidéo / image à contraste de phase montrant la présence de cils battants. Barres d’échelle : 50 μm. (D) Coloration H & E (barres d’échelle : 20 μm) et image TEM (barres d’échelle : 5 μm) montrant un épithélium pseudo-stratifié mature différencié sur puce. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Données représentatives obtenues avec la puce alvéole à sommet ouvert. (A) Schéma montrant la séquence d’action pour la préparation de la puce alvéole à toit ouvert et fournissant l’étape biologique clé de la culture de puces alvéoles à ciel ouvert. (B) Type I (HTI-56, AT1-α), Type II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, tensioactif (C) et coloration par fluorescence E-cadhérine montrant la présence de pneumocytes matures sur puce. Barres d’échelle : 20 μm. (C) Image MEB et TEM montrant la présence de microvillosités et de vésicules lysosomales preuve d’un phénotype alvéolaire mature. Barres d’échelle : 5 μm. (D) section efficace H & E (barres d’échelle : 5 μm) confirmant la présence de cellules plates et malpighiennes compatibles avec le phénotype I et de cellules cuboïdes ressemblant à des pavés cohérentes avec le phénotype II, et (E) montrant la présence de fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique (barres d’échelle : 10 μm). (F) Rendu conceptuel de dessin animé 3D de la puce alvéole à toit ouvert. Cette figure a été adaptée avec la permission de Varone et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Données représentatives obtenues avec la puce intestinale ouverte. (A) Schéma montrant la séquence d’action pour la préparation de l’intestin à puce ouverte et fournissant l’étape biologique clé de la culture de l’intestin à puce ouverte. (B) Vue latérale inclinée montrant l’assemblage Stamp and Chip pendant la phase de coulée sur gel, le concept de dessin animé du gel micromodelé et les images de contraste de phase d’une structure en forme de crypte micromodelée sur la surface du gel et ensemencée de colonoïdes à deux hauteurs différentes. Barres d’écailles : 200 μm. (C) Coloration par fluorescence de la mucine 2 et de la E-cadhérine montrant la présence d’entérocytes et de cellules caliciformes matures sur puce. Barres d’échelle : 200 μm. (D) Coupe transversale H&E d’une structure en forme de crypte montrant la présence des fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique et confirmant la présence d’un épithélium cylindrique simple. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo en contraste de phase montrant des cils battants. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Assemblage de puces à toit ouvert. (A) Schéma montrant le rendu tridimensionnel de l’assemblage Open-Top Chip et le rendu cartoon de la puce cutanée à toit ouvert avec les différents compartiments biologiques mis en évidence et comprenant épithélial (bleu), dermique (jaune) et vasculaire (rouge). (B) La plate-forme microfluidique assemblée a un format de 35 mm x 17 mm, une zone de culture tissulaire de 0,32 cm2, un canal microfluidique en spirale inférieure et un couvercle de chambre avec un canal microfluidique. (C) La plate-forme comprend une chambre avec une paroi inclinée de 5 degrés, qui a un diamètre de 6 mm au niveau de la membrane et de 5,7 mm au sommet de la paroi de la chambre PDMS et une hauteur de 4 mm et une largeur. La membrane poreuse a une épaisseur de 50 μm et les pores ont un diamètre de 7 μm. (D) Le canal microfluidique inférieur en forme de spirale a des dimensions de section transversale de 400 μm (hauteur) x 600 μm (largeur). (E) Un aperçu du calendrier de l’expérience et des étapes nécessaires à la préparation de la puce d’organe à toit ouvert. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Peau. Le tableau fournit un résumé des principales étapes quotidiennes et des paramètres d’étirement et d’écoulement utilisés au cours des trois phases de la culture Open-Top Skin-Chip (croissance, prolifération et différenciation). Le tableau fournit également la liste des matériaux, les formulations des milieux et les instructions sur la façon de préparer les milieux nécessaires à ce protocole. La composition des trois milieux est optimisée pour les différentes phases du protocole. Plus précisément, le milieu I est optimisé pour la phase d’ensemencement et de culture précoce des kératinocytes. Le milieu II est optimisé pour la prolifération et la différenciation précoce (formation d’un épithélium stratifié). Le milieu ALI est optimisé pour maintenir les kératinocytes à une interface air-liquide jusqu’à ce qu’un épiderme complètement différencié soit produit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Alvéole. Le tableau fournit un résumé des principales étapes quotidiennes et des paramètres d’étirement et d’écoulement utilisés au cours des trois phases de la culture alvéole-puce à ciel ouvert (croissance, prolifération et différenciation). Le tableau fournit également la liste des matériaux, les formulations des milieux et les instructions sur la façon de préparer les milieux nécessaires à ce protocole. La composition des deux supports est optimisée pour les différentes phases du protocole. Veuillez noter que l’ajout de suppléments (KIAD) au milieu de culture cellulaire est essentiel pour obtenir une différenciation optimale des pneumocytes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Voies respiratoires. Le tableau fournit un résumé des principales étapes quotidiennes et des paramètres d’étirement et de débit utilisés au cours des trois phases de la culture des puces à toit ouvert (croissance, prolifération et différenciation). Le tableau fournit également la liste des matériaux, la formulation du milieu et les instructions sur la façon de préparer le milieu nécessaire pour ce protocole. La composition du milieu est optimisée pour maintenir les cellules des voies respiratoires à l’interface air-liquide, ce qui, à son tour, induit une différenciation terminale et stimule la production de mucus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 4 : Intestin. Le tableau fournit un résumé des principales étapes quotidiennes et des paramètres d’étirement et d’écoulement utilisés au cours des trois phases de la culture à dessus ouvert de la puce intestinale (croissance, prolifération et différenciation). Le tableau fournit également la liste des matériaux, les formulations des milieux et les instructions sur la façon de préparer les milieux nécessaires à ce protocole. Les compositions des deux supports sont optimisées pour les différentes phases du protocole. Plus précisément, le milieu d’expansion complété par les inhibiteurs CHIR et ROCK est optimisé pour l’ensemencement et la phase précoce de la culture, car il favorise la survie et la croissance du fragment organoïde du côlon en tant que monocouche. Le milieu d’expansion est optimisé pour la prolifération et la différenciation précoce de la monocouche de l’épithélium. Le milieu de différenciation est optimisé pour la différenciation terminale de la monocouche de l’épithélium avant exposition à l’interface air-liquide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La puce Open-Top représente une plate-forme habilitante pour étudier l’interaction cellulaire complexe qui se produit entre l’endothélium, le stroma et l’épithélium dans un microenvironnement contrôlé, en temps réel. Cette technologie offre des avantages essentiels par rapport aux cultures organotypiques et organoïdes conventionnelles, tels que l’intégration de signaux physiques et biochimiques pertinents pour reconstituer le microenvironnement tissulaire humain, y compris le cisaillement fluidique (écoulement), l’étirement cyclique et la reconstruction de la topographie de surface épithéliale obtenue par micropatterning. Les cellules humaines qui se développent au sein de cette plateforme agissent en synergie pour récapituler les fonctions tissulaires spécifiques qui peuvent être analysées par des techniques conventionnelles, y compris l’histochimie immunitaire et les tests biochimiques utilisant les fluides d’écoulement (ou effluents) des compartiments supérieur et / ou inférieur. La conception actuelle permet un accès facile à la couche épithéliale, où les cellules se développent en contact direct avec des fibroblastes spécifiques aux tissus et d’autres cellules stromales, imitant l’architecture multicellulaire des tissus épithéliaux. Notamment, le prototype de puce à toit ouvert offre une solution viable aux défis communs associés à l’utilisation d’autres plates-formes d’organes sur puce. Bien qu’il permette l’incorporation de plusieurs types de cellules différentes dans un compartiment stromal conduisant à la création de tissus 3D très complexes, il permet également d’extraire facilement les constructions tissulaires établies du dispositif de puce pour l’analyse en aval, y compris la coloration H&E conventionnelle.

La conception actuelle présente quelques limites. Par exemple, la membrane élastique interposée entre le microcanal vasculaire et le compartiment stromal (hydrogel) du prototype Open-Top Chip est considérablement plus épaisse (≈ 50 μm contre ≈ 1 μm) que l’espace interstitiel séparant les tissus endothéliaux du stroma dans les organes humains natifs. Bien que la membrane élastique ne représente pas une barrière physique à la diffusion de grosses molécules, telles que les hormones et d’autres facteurs paracrines qui interviennent dans la diaphonie intercellulaire entre les tissus, elle peut limiter les interactions directes cellule-cellule et la migration des cellules du compartiment vasculaire vers le compartiment stromal. Enfin, le prototype Open-Top Chip est fait de PDMS, qui est connu pour absorber un grand nombre de composés hydrophobes. Cette limitation est partagée par de nombreuses plateformes basées sur PDMS qui peuvent constituer un obstacle sérieux dans les applications destinées à tester la pharmacodynamique et la pharmacocinétique de petits composés thérapeutiques27.

L’un des principaux défis de l’intégration d’hydrogels 3D dans un dispositif microfluidique tel que la puce Open-Top est que le PDMS ne fournit pas un substrat optimal pour la liaison de protéines ou de cellules humaines. La fonctionnalisation chimique de la surface PDMS est donc une étape critique de ce protocole qui est nécessaire pour assurer un revêtement ECM approprié et une adhérence d’hydrogel à la chambre de gel du modèle Open-Top Chip. Pour obtenir des résultats optimaux, l’agent de réticulation de la solution ER1 doit toujours être protégé de l’exposition directe à la lumière. Un indicateur important de l’état réactif de la réticulation est sa couleur. L’agent de réticulation de l’ER1, en fait, subit une transition de couleur de l’orange brillant au brun foncé lorsqu’il s’oxyde. La transition de couleur peut être utilisée comme indicateur après l’étape d’activation UV pour vérifier si la solution a réagi efficacement avec la surface PDMS. Pendant la préparation de la solution de réticulation, la transition de couleur doit être surveillée pour s’assurer qu’une exposition accidentelle à la lumière directe ne photo-blanchit pas le composé chimique dans la solution. Pour protéger la solution de réticulation et éviter tout photoblanchiment indésirable, nous suggérons d’envelopper une feuille d’aluminium, d’environ 15 cm x 15 cm, autour d’un tube conique de 15 ml ou à l’aide d’un tube ambré disponible sur le marché. L’utilisation de l’ER1 permet une méthode simple et efficace pour obtenir une fonctionnalisation rapide des surfaces PDMS; cependant, il existe d’autres molécules qui peuvent être utilisées à la place de ER1. Par exemple, les agents de réticulation chimique 3-aminopropyl-triméthoxysilane (APTMES) ne sont pas aussi photosensibles que l’ER1 et ils peuvent être utilisés pour obtenir des résultats similaires avec quelques étapes supplémentaires comme nous l’avons décrit précédemment ailleurs28,29. Indépendamment de la molécule choisie, l’une des principales contraintes dans le travail avec un agent de réticulation chimique est la présence de résidus résiduels, qui peuvent induire une cytotoxicité. Après la réaction d’activation, il est important de rincer les surfaces microfluidiques avec des volumes abondants de solution de lavage.

Étant donné que les bulles d’air ont tendance à se former et à se développer dans les interfaces hydrophobes des copeaux, des tubes et des connecteurs, il est important d’évaluer si le chemin microfluidique est exempt de bulles d’air avant de commencer l’écoulement du fluide. Les bulles peuvent en effet perturber le flux et même tuer les cellules lorsque des puces sont connectées au flux. L’amorçage des composants microfluidiques avant le début de l’écoulement du fluide réduira le risque de générer des bulles d’air et aidera à obtenir des résultats optimaux et reproductibles. Si le cycle d’amorçage décrit dans ce protocole n’était pas suffisant, le rinçage des tubes microfluidiques à l’éthanol (5 min), puis au HBSS (20 min) atténuera davantage le risque de générer des bulles d’air à l’intérieur des connecteurs fluidiques.

Malgré ses limites, PDMS possède une combinaison rare de propriétés chimiques qui a permis la fabrication de dispositifs microfluidiques hautement biocompatibles, transparents et élastiques. Toutes ces propriétés ont fait du PDMS le matériau le plus largement appliqué pour la construction des modèles d’organes sur puce au cours de la dernière décennie. Les progrès récents dans les domaines de la science des matériaux et du génie chimique30,31 suggèrent que le composant PDMS de cette plate-forme pourrait être remplacé dans un proche avenir par de nouveaux polymères synthétiques ou biomatériaux. S’il est atteint avec succès, il pourrait permettre la récapitulation des propriétés spécifiques aux tissus, y compris la porosité, la composition ECM de l’espace interstitiel fournissant un mimétisme plus proche des tissus natifs humains, et des modèles plus avancés pour les études pharmacologiques. Nous prévoyons que l’évolution future de la conception de la puce à toit ouvert permettra la modélisation des tissus et organes humains avec un niveau de détail sans précédent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent les intérêts financiers / relations personnelles suivants, qui peuvent être considérés comme des intérêts concurrents potentiels: Varone Antonio est un ancien employé d’Emulate Inc. et peut détenir une participation dans Emulate.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x EMEM  Lonza 12-684F Medium; Stroma
18 Gauge needle MicroGroup 316H18RW Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needle MicroGroup 316H19RW Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT  Cole-Palmer  EW-95723-12 Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes   -   -  For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) Sigma B7880 Medium supplement 
A-83-01  Tocris  2939
Adenine Sigma A9795
Advanced DMEM/F12  Thermo 12634010
Airway Epithelial Cells Lifeline Cell Technology FC-0016
Aluminum foil   -   -   -
Alveolar cells Cell Biologics H6621
Anti-ABCA3   ABCAM  ab24751  Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647  ABCAM  ab215225   Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5  ABCAM  ab92320  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin   ABCAM  ab11315  Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1)  ABCAM  ab9498  Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5   ABCAM  ab75869  Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10   ThermoFisher  MA5-13705  Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14   ABCAM  ab7800  Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin   ABCAM  ab1416   Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher  PA5-79267  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56  Terrace Biotech  TB-29AHT1-56   Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280  Terrace Biotech  TB-27AHT2-280  Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin   ThermoFisher  MA5-11803  Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ   Biolengend  618902  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67   ABCAM  ab8191  Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM  ab111090  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B  Seven Hill  WRAB-48604  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher  PA5-34612  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2  SantaCruz Biotechnology sc-7314 Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63   Dako  GA662  Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher  PA5-32541  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)   ABCAM  ab128994  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B  ABCAM  ab40876  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C    Seven Hill   WRAB-9337   Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1  Hycult Biotech  HM2178  Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin   ABCAM  ab33168  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1   ThermoFisher  33-9100  Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acid Sigma A4544
Aspirating pipettes  Corning / Falcon  357558  2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips   -   -  Sterile (autoclaved) 
B27 Thermo 17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution   ThermoFisher  37525  Blocker agent 
Calcium Chloride Sigma C7902
CHIR 99021 Tocris 4423
Collagen I Advanced Biomatrix 5133 10 mg/mL (Stroma)
Collagen I  Advanced BioMatrix 5005 3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV Sigma  C5533
Collagen-IV Sigma  C5533-5MG  Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts  Cell Biologics  H6231
Colonic microvascular endothelial cells  Cell Biologics H6203 
Conical tubes    -   -  15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1)  Emulate  10461 5 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)   ThermoFisher  D3571  DNA probe 
Dermal fibroblasts ATCC PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells ATCC CRL-3243
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM ThermoFisher 11054020
DMEM/F-12  GIBCO  11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO  10565-018  Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM  ab150105  Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175472  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150107  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175470  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150075  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)  Corning  21-031-CV  1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli PromoCell C-60170 Medium supplement 
F-12 Ham’s Invitrogen  21700-108 For vascular ECM
FibriCol  Advanced BioMatrix  5133-20ML  Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin Corning 356008
Fibronectin, Human, Natural,   Corning  47743-654  human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers  Aven 18056USA  Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax Invitrogen  21700-108
Glutamax  Invitrogen  35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)   ABCAM  ab150080  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150115  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)   ABCAM  ab6785  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher  A-21124  Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher  A-21042  Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator  Corning  4930   - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)  GE Healthcare Life Sciences SH30066.03
Hemocytometer   -   -  - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149
HEPES Thermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin  Sigma G9145
Human colonoids Obtained from clinical resections Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein  Thermo PHG0311L
human epithelial growth factor  Thermo  PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)   GE Healthcare  SH30066.02HI   Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma H4881
Hydrocortisone  PromoCell   C-64420  Medium supplement  
Ice bucket   -   -   - 
Ismatec IPC-N  Cole-Palmer EW-78000-41 Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES BioWhittaker 17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK PromoCell C-63821
Keratinocytes ATCC PCS-200-010
Laminin  Biolamina CT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521)  Biolamina   CT521-0501  human recombinant laminin 521    
Lung Fibroblast Cell Biologics H6013
Lung Fibroblast Lifeline Cell Technology FC-0049
Lung microvascular endothelial cells Lonza CC-2527
Lung smooth muscle cells Lifeline Cell Technology FC-0046
Manual counter   -   -   -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing  Cole-Palmer FV-96880-02 PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red Thermo  11043023
Microcentrifuge tube   -    -   1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)   -   -  For bright-field imaging 
N2 Sigma 17502001
N-acetyl cysteine Sigma A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium) Sigma N17001
Normal Goat Serum   ThermoFisher  50062Z  Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine  Sigma P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)   EMS  15710  Fixing agent 
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140122
Penicillin-streptomycin  Sigma  P4333  10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips    -   -  P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette  Gilson   F167380  P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) AMSBIO (or Thermo) N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides   Sigma  P0425  Glass slides 
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Progesterone Sigma P8783
ProLong Gold   ThermoFisher  P36931  Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid  Sigma R2625
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium) Sigma SCC111
SAGM SingleQuots supplements  Lonza CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM  Lonza  CC-4124  Medium supplements 
SB2001190  Tocris  1264/10
Serological pipettes   -   -  2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) Lonza  CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2)  Emulate  10462 25 mL bottle 
Steriflip-HV  Millipore SE1M003M00 Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes Thermo 103 Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks   -   -   -
T75 flasks   -   -   - 
Tri-iodothyronine Sigma T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)   Sigma  T8787  Permeabilization agent 
Trypan blue  Sigma  93595  0.4% solution 
TrypEE solution  Sigma  12604013  Cell detaching solution 
TWEEN-20  Sigma  P2287  Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) VWR 21474-598 UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up   -   -  Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli PromoCell C-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420  Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC   ABCAM  ab8822  Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)   -   -  Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) ATCC CRL-2647

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).

Tags

Ce mois-ci dans JoVE numéro 192
Reconstitution de la cytoarchitecture et de la fonction des tissus épithéliaux humains sur une puce organique à sommet ouvert
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra,… More

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra, M., Riccardo, B. Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip. J. Vis. Exp. (192), e64633, doi:10.3791/64633 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter