Summary
El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.
Abstract
Casi todos los órganos humanos están revestidos con tejidos epiteliales, que comprenden una o varias capas de células estrechamente conectadas organizadas en estructuras tridimensionales (3D). Una de las principales funciones del epitelio es la formación de barreras que protegen los tejidos subyacentes contra insultos físicos y químicos y agentes infecciosos. Además, los epitelios median el transporte de nutrientes, hormonas y otras moléculas de señalización, a menudo creando gradientes bioquímicos que guían el posicionamiento celular y la compartimentación dentro del órgano. Debido a su papel central en la determinación de la estructura y función de los órganos, los epitelios son objetivos terapéuticos importantes para muchas enfermedades humanas que no siempre son capturadas por modelos animales. Además de las obvias diferencias de especie a especie, la realización de estudios de investigación sobre la función de barrera y las propiedades de transporte de los epitelios en animales se ve agravada por la dificultad de acceder a estos tejidos en un sistema vivo. Si bien los cultivos de células humanas bidimensionales (2D) son útiles para responder preguntas científicas básicas, a menudo producen predicciones in vivo deficientes. Para superar estas limitaciones, en la última década, una gran cantidad de plataformas biomiméticas de microingeniería, conocidas como órganos en un chip, han surgido como una alternativa prometedora a las pruebas tradicionales in vitro y en animales. Aquí, describimos un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una plataforma diseñada para modelar tejidos epiteliales específicos de órganos, incluyendo piel, pulmones e intestinos. Este chip ofrece nuevas oportunidades para reconstituir la arquitectura multicelular y la función de los tejidos epiteliales, incluida la capacidad de recrear un componente estromal 3D mediante la incorporación de fibroblastos específicos de tejido y células endoteliales dentro de un sistema mecánicamente activo. Este chip abierto proporciona una herramienta sin precedentes para estudiar las interacciones epiteliales / mesenquimales y vasculares a múltiples escalas de resolución, desde células individuales hasta construcciones de tejido multicapa, lo que permite la disección molecular de la diafonía intercelular de los órganos epitelializados en la salud y la enfermedad.
Introduction
Históricamente, los científicos han confiado en las pruebas preclínicas en animales para el descubrimiento de fármacos, pero un número creciente de estos métodos han sido cuestionados debido a la mala correlación con el resultado humano1. La implementación de los principios de las "3R" para reemplazar, reducir y refinar la experimentación animal insta a los científicos a encontrar nuevos métodos alternativos in vitro para apoyar la evaluación preclínica de riesgos de toxicología química y de medicamentos2. Sin embargo, muchos modelos in vitro desarrollados hasta la fecha carecen de la arquitectura biológica, la complejidad celular y el entorno mecánico necesarios para recapitular la naturaleza dinámica de los órganos vivos humanos 3,4.
Los sistemas preclínicos in vitro convencionales suelen emplear monocultivos 2D de células humanas cultivadas sobre una superficie plástica rígida. Estos métodos proporcionan una herramienta para realizar estudios mecanicistas simples y permiten una rápida selección de candidatos a fármacos. Debido a su costo relativamente bajo y alta robustez, los modelos 2D a menudo se combinan con sistemas automáticos de alto rendimiento y se utilizan para la identificación rápida de posibles candidatos a fármacos durante la etapa inicial del proceso de desarrollo de fármacos 5,6. Sin embargo, tales modelos 2D no proporcionan un enfoque traslacional para modelar respuestas a nivel de tejido, órgano o sistémicas a candidatos terapéuticos, lo cual es necesario para predicciones precisas de la seguridad y eficacia de los medicamentos durante la etapa preclínica de su desarrollo. Los cultivos de células planas no recapitulan el microambiente tisular nativo, incluida la compleja interacción multicelular, las propiedades biomecánicas y la arquitectura tridimensional (3D) de los tejidos humanos7. Las células que crecen en una superficie plana a menudo no adquieren un fenotipo maduro y, por lo tanto, no pueden responder a los estímulos farmacológicos como lo harían en el tejido nativo. Por ejemplo, las células epiteliales alveolares humanas primarias cultivadas in vitro exhiben un fenotipo escamoso y pierden marcadores fenotípicos clave, incluidas las proteínas surfactantes C y B (SP-C y SP-B)8. Además de la diferenciación insuficiente, las células primarias con frecuencia se vuelven insensibles a los factores estresantes biológicos in vitro, ya que ciertas vías bioquímicas asociadas con la inflamación del tejido se vuelven no funcionales9. Tal pérdida de función celular parece estar asociada principalmente con el uso de sustratos rígidos, así como con la falta de factores solubles liberados naturalmente por las células estromales específicas del tejido, como los fibroblastos pulmonares y las células del músculo liso10,11.
La comprensión de que la falta de complejidad quimiofísica y biológica limita el comportamiento fisiológico de las células in vitro ha fomentado el desarrollo de modelos multicelulares más sofisticados, que han demostrado captar mejor la complejidad de los tejidos humanos fuera del cuerpo12,13. Desde la creación de los primeros modelos de cocultivo a principios de la década de 197014, la introducción de hidrogeles sintéticos y naturales ha mejorado significativamente la capacidad de imitar microambientes de tejidos nativos y se ha convertido en una herramienta invaluable para impulsar la diferenciación celular, guiar la autoorganización de las células en estructuras similares a los tejidos y la restauración de las funciones de los tejidos nativos15,16. Por ejemplo, cuando se cultivan en el andamio 3D apropiado, las células humanas pueden autoorganizarse en estructuras funcionales como esferoides u organoides, expresando marcadores de células madre, y son capaces de autorrenovarse17. En contraste, las células humanas (incluidas las células madre), cuando se cultivan en sustratos 2D tradicionales, envejecen rápidamente y sufren senescencia después de unos pocos pasajes18. Además, los hidrogeles pueden ser "adaptados" para que coincidan con propiedades específicas del tejido, como porosidad, tamaño de poro, grosor de fibra, viscoelasticidad, topografía y rigidez, o diseñados con componentes celulares derivados de tejidos y / o moléculas bioactivas que permiten la emulación de las condiciones fisiológicas o patológicas19,20. A pesar de su enorme potencial para las pruebas farmacológicas, los modelos 3D basados en hidrogel utilizados en la investigación farmacéutica no recapitulan completamente la compleja citoarquitectura de los tejidos in vivo y carecen de importantes estímulos hemodinámicos y mecánicos normalmente presentes en el cuerpo humano, incluyendo la presión hidrostática, el estiramiento cíclico y el cizallamiento del fluido21.
Los sistemas microfisiológicos (MPS) como los Organs-on-chips (OOCs) han surgido recientemente como herramientas capaces de capturar respuestas fisiológicas complejas in vitro22,23. Estos modelos a menudo emplean el uso de plataformas microfluídicas, que permiten el modelado del microambiente dinámico de los órganos vivos.
Hemos combinado los principios de la bioingeniería de tejidos 3D y la mecanobiología para crear un modelo de chip abierto de tejido epitelial humano complejo. Esto nos permitió recapitular de cerca el microambiente multicelular y dinámico de los tejidos epiteliales. Esto incluye señales bioquímicas y biomecánicas específicas del tejido naturalmente presentes en los órganos vivos, pero a menudo descuidadas por los modelos tradicionales in vitro 24. El chip Open-Top incorpora dos compartimentos: un compartimento vascular (Figura 1A) y un compartimento estromal (Figura 1B) separados por una membrana porosa, lo que permite la difusión de nutrientes entre las dos cámaras (Figura 1C). El compartimiento vascular está expuesto a un flujo continuo de fluido para recapitular el esfuerzo cortante fisiológico, mientras que el diseño estirable de la cámara estromal permite el modelado de la tensión mecánica asociada con los movimientos respiratorios o la peristalsis intestinal. El compartimento estromal alberga el andamio de hidrogel 3D sintonizable diseñado para apoyar el crecimiento fisiológico de fibroblastos específicos de tejido. Posee una tapa extraíble que facilita el establecimiento de una interfaz aire-líquido, una condición que permite una mayor emulación de la fisiología humana de los tejidos de la mucosa, así como el acceso directo al tejido para administrar medicamentos directamente sobre la capa epitelial. La Figura Suplementaria 1 captura algunos de los componentes clave del diseño del chip Open-Top, incluidas las dimensiones y los compartimentos biológicos (Figura Suplementaria 1A-D), así como los principales pasos técnicos descritos en este protocolo (Figura Suplementaria 1E).
La perfusión del chip Open-Top se logra con una bomba peristáltica programable (Figura 1D). La configuración de la bomba peristáltica permite que 12 chips descapotables se perfundan simultáneamente. La mayoría de las incubadoras pueden albergar dos configuraciones que permiten el cultivo de hasta 24 chips por incubadora. El estiramiento mecánico se logra utilizando un regulador de presión de vacío programable hecho a medida (Figura 1E). Consiste en un regulador de vacío electroneumático controlado electrónicamente por un convertidor de digital a analógico. En otras palabras, el regulador de vacío electroneumático genera un perfil de vacío sinusoidal con una amplitud y frecuencia que es determinada por el usuario. La deformación cíclica que oscila entre el 0% y el 15% se genera aplicando presión negativa al canal de vacío del chip abierto a una amplitud que varía de 0 a -90 kPa y una frecuencia de 0,2 Hz. Es un sistema hecho a medida equivalente a la unidad de deformación Flexcell disponible comercialmente previamente adoptada y descrita en otros documentos25. Para imitar la deformación mecánica del tejido asociada, por ejemplo, con el movimiento respiratorio del pulmón o el peristaltismo del intestino, el actuador neumático aplica ondas sinusoidales de vacío / deformación cuya magnitud y amplitud se pueden ajustar para que coincidan con el nivel fisiológico de tensión y frecuencia que experimentan las células humanas en su tejido nativo.
Aquí, describimos un método eficiente y reproducible para diseñar y cultivar equivalentes de epitelio organotípico en una plataforma prototipo de chip Open-Top. Permite la generación de modelos de órganos complejos como piel, alvéolos, vías respiratorias y colon al tiempo que integra un flujo de fluido vascular y estiramiento mecánico. Describiremos los aspectos técnicos clave que deben considerarse al implementar los principios de la ingeniería de tejidos para generar modelos epiteliales complejos. Discutiremos las ventajas y posibles limitaciones del diseño actual.
Una visión general de los principales pasos utilizados para lograr la maduración de tejidos y órganos, incluidos los parámetros de flujo y estiramiento, se informa en: Figura 2 para la piel, Figura 3 para el alvéolo, Figura 4 para las vías respiratorias y Figura 5 para el intestino. En las tablas suplementarias se incluye información adicional sobre la composición de los medios y los reactivos utilizados para el cultivo de los diferentes modelos de órganos (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 3 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino).
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Protocol
Los colonoides humanos se obtuvieron de resecciones intestinales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad del Hospital de Niños de Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Activación de superficie
- Preparación del búfer de activación
- Coloque el reticulante y los reactivos tampón del disolvente debajo del gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelos equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos antes de su uso.
- Reconstituya 5 mg de reticulante en 5 ml del tampón disolvente utilizando un recipiente estéril impermeable a la luz o un tubo cónico transparente de 15 ml envuelto en papel de aluminio para proteger la solución de reticulación de la exposición directa a la luz.
- Realice un vórtice de la solución durante 1 minuto para eliminar todos los grumos y, a continuación, pipete 50 μL de la solución reticulante directamente en el canal inferior del chip y 150 μL en la cámara abierta.
- Retire cualquier exceso de solución de reticulación de la superficie del chip con un aspirador. A continuación, pipetear 50 μL adicionales de la solución de reticulación directamente en el canal inferior del chip y 150 μL en la cámara superior abierta para eliminar cualquier burbuja de aire restante.
- Activación con máquina de reticulación UV
- Retire suavemente la tapa del chip debajo del BSC y guárdela en un recipiente estéril.
- Transfiera las virutas que contienen la solución de reticulación a una placa de Petri, cierre la placa de Petri para evitar la contaminación y coloque la placa con las virutas debajo de la máquina de reticulación UV.
NOTA: Retire la tapa de la placa de Petri para maximizar la exposición a los rayos UV. - Ajuste la máquina de reticulación UV con una longitud de onda máxima de 365 nm a una intensidad de 100 μJ/cm2, y encienda la luz UV durante 20 min.
NOTA: Después de 20 minutos de tratamiento UV, la solución de reticulación se verá más oscura (marrón). - Vuelva a colocar las virutas bajo el BSC y aspire la solución reticulante oxidada. Luego, enjuague todas las virutas tres veces con el tampón del solvente y deje que las virutas se sequen debajo del BSC durante 5-10 minutos para completar la funcionalización química de la superficie del polidimetilsiloxano (PDMS).
2. Preparación del equivalente del estroma
- Preparación de tampón de reconstrucción 10x (100 mL)
- Disolver 2,2 g de bicarbonato de sodio en 75 mL de NaOH 0,067 M en agua de doble destilación.
- Añadir 4,76 g de HEPES y llevar el volumen a 100 mL con agua destilada doble.
- Filtrar estéril la solución bajo el BSC utilizando un filtro estéril desechable con tapa de botella con una membrana de 0,22 μm.
NOTA: La solución es estable durante unos 6 meses cuando se almacena a 4 °C.
- Estimación del volumen de la solución pre-gel
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 150 μL (volumen interno de la cámara central abierta) para estimar la cantidad de solución de pregel requerida para el experimento:
Volumen necesario = (Número de fichas x 150) μL - Preparar la solución de colágeno pre-gel en hielo mezclando: 1 volumen de 10x EMEM que contenga las células de elección, 1 volumen de tampón de reconstrucción 10x (ver paso 2.1), 8 volúmenes de solución de colágeno I (10 mg/ml) y 1 μL de solución de NaOH de 1 N por cada mg de colágeno I.
NOTA: Se recomienda preparar un volumen adicional de +15% para tener en cuenta los errores experimentales; El ejemplo descrito en la sección 2.2 proporciona un procedimiento detallado paso a paso para preparar suficiente solución de pre-gel para 12 chips y un volumen adicional del 15%.
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 150 μL (volumen interno de la cámara central abierta) para estimar la cantidad de solución de pregel requerida para el experimento:
- Preparación de solución pre-gel para el equivalente de estroma (para 12 chips)
- Llevar las siguientes soluciones bajo el BSC sobre hielo: 10x EMEM; 10x Búfer de reconstrucción (consulte el paso 2.1); Solución de colágeno I (10 mg/ml); y solución estéril de NaOH 1 N.
- Cultive células mesenquimales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta un 80% -90% de confluentidad, y luego disocie las células usando tripsina u otros métodos recomendados por el proveedor de células. Recoger las células en un pellet por centrifugación a 250 x g durante 5 min a 24 °C.
- Resuspender el pellet celular en 225 μL de EMEM 10x helado y añadir 225 μL de tampón de reconstrucción 10x helado (ver paso 2.1). Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego agregue 1,800 μL de solución de colágeno I helada.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces, evitando burbujas para mezclar la solución de pre-gel mientras está en hielo.
- Incorporación del equivalente de estroma en chip (para 12 chips)
- Neutralizar la solución pre-gel con 18 μL de NaOH 1 N. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces, y luego pipetear 150 μL de hidrogel cargado de células en la cámara central del chip abierto evitando burbujas.
NOTA: Si se requiere micropatrones, pase al siguiente paso (sección 3). - Agrupe las virutas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo de centrífuga llena con 2 ml de ddH2O estéril en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2.
NOTA: Después de 90 min, el hidrogel cargado de células se polimerizará por completo.
- Neutralizar la solución pre-gel con 18 μL de NaOH 1 N. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces, y luego pipetear 150 μL de hidrogel cargado de células en la cámara central del chip abierto evitando burbujas.
3. Micropatrón de superficie (opcional)
- Realice el micropatrón superficial del hidrogel estromal después de pipetear el hidrogel de colágeno neutralizado (aún en su estado líquido) utilizando sellos impresos en 3D.
NOTA: Los sellos impresos en 3D se pueden obtener en varios diseños personalizables, como se describió anteriormente en otra parte24. - Pipetear 20 μL de la solución de pregel de colágeno I neutralizado en la superficie estampada de un sello estéril impreso en 3D e insertar el sello dentro (en la parte superior) de la cámara abierta mientras el hidrogel estromal todavía está en forma líquida.
- Retire cualquier residuo del hidrogel que pueda derramarse de la parte superior de la cámara superior abierta con un aspirador (o una pipeta). Agrupe todas las fichas en placas de Petri separadas e incluya una tapa de tubo cónico de 15 ml de centrífuga llena con 2 ml de ddH2O estéril en cada placa de Petri.
- Incubar todas las placas de Petri a 37 °C, 5% deCO2 durante 90 min, y luego volver a colocar las virutas debajo del BSC y retirar suavemente los sellos con pinzas de precisión para reducir el riesgo de dañar el hidrogel.
4. Recubrimiento de la superficie epitelial y vascular con proteínas ECM específicas del tejido
- Revestir la cámara microfluídica vascular con proteínas de la matriz extracelular
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 20 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento de ECM vascular requerida para el experimento:
Volumen necesario = (Número de fichas x 20) μL
NOTA: Se recomienda preparar un volumen adicional del 15% para tener en cuenta los errores experimentales. - Prepare la solución de recubrimiento ECM vascular para todos los chips (por ejemplo, 300 μL por 12 chips) utilizando PBS o HBSS helados.
NOTA: Consulte la tabla específica de protocolo de órganos en la sección de materiales suplementarios (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino) para identificar los reactivos específicos y la composición recomendada de la MEC. - Pipetear 20 μL de solución de recubrimiento de ECM vascular en el canal vascular de cada chip.
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 20 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento de ECM vascular requerida para el experimento:
- Recubriendo la superficie apical del equivalente estromal con proteínas de la matriz extracelular
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 50 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento ECM epitelial requerida para el experimento:
Volumen necesario = (Número de fichas x 50) μL
NOTA: se recomienda preparar un volumen adicional del 15% para tener en cuenta los errores experimentales. - Prepare suficiente solución de recubrimiento ECM para todos los chips (por ejemplo, 750 μL por 12 chips) en PBS o HBSS helados y transfiera 50 μL de solución de recubrimiento ECM epitelial directamente sobre la superficie del hidrogel.
NOTA: Consulte la tabla específica de protocolo de órganos en la sección de materiales suplementarios (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino) para identificar los reactivos específicos y la composición recomendada de la MEC. - Agrupe las astillas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo cónico de 15 ml de centrífuga llena con 2 ml de ddH 2 O estéril en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 durante2h antes de proceder con la siembra de células epiteliales.
- Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 50 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento ECM epitelial requerida para el experimento:
5. Siembra de células epiteliales en el equivalente estromal
- Cultivo de células epiteliales
- Cultivar células epiteliales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta un 80% -90% de confluente.
- Disociar las células utilizando procedimientos enzimáticos proteolíticos según lo recomendado por el proveedor de células.
NOTA: Para obtener los mejores resultados, recolecte células epiteliales de paso bajo (P1-P2) durante la fase de crecimiento activo cuando alcancen entre 70% -90% de confluencia. - Una vez disociadas, centrifugar las células y recogerlas en forma de pellet.
- Resuspender las células epiteliales a la densidad de célula/fragmento apropiada como se indica en la tabla de protocolo de órgano específico.
NOTA: En este estudio, la solución celular se utilizó a una densidad de 3 x 10 6 células/ml para la piel, 1 x 10 6 células/ml para el alvéolo, 6 x 10 6 células/ml para la vía aérea y 8 x 10 6 fragmentos/ml para el intestino.
- Siembra de células epiteliales
- Transfiera los chips de la incubadora al BSC. Aspirar la solución de recubrimiento del canal vascular y enjuagar el canal microfluídico vascular tres veces con 50 μL de medio de cultivo de células endoteliales frescas.
- Aspirar la solución de recubrimiento de la superficie del hidrogel y enjuagar la superficie estromal tres veces con 100 μL de medio de cultivo de células epiteliales frescas para eliminar cualquier exceso de solución de recubrimiento.
- Aspirar el medio ascendente y sembrar la superficie del hidrogel con 50 μL de la suspensión de células epiteliales utilizando la densidad celular adecuada, como se indica en las tablas suplementarias, y luego transferir las virutas de nuevo a la incubadora durante 2 h (o durante la noche para los colonoides).
- Enjuague suavemente la superficie del hidrogel con el medio de cultivo celular dos veces para eliminar los restos celulares. Finalmente, refresque el medio en autoclave en recipientes sellados en autoclave y conecte los chips a la bomba peristáltica.
6. Conectar chips al flujo
- Preparación de las partes fluídicas
- Corte 2 pulgadas de tubo de transferencia de elastómero termoplástico (TPE) a base de polipropileno biocompatible (Tabla de materiales) para preparar el tubo microfluídico corto que se requiere para conectar los chips a los depósitos de medios.
- Corte 7.5 pulgadas de tubo de transferencia de TPE biocompatible para producir el tubo microfluídico largo.
- Prepare suficientes conectores metálicos de 18 G y 19 G (Tabla de materiales).
NOTA: Se recomienda preparar y esterilizar los tubos y conectores descritos en los pasos 6.1.1 y 6.1.2 al menos 1 día antes de conectar los chips descapotables a las bombas peristálticas. - Perfore la tapa de cada reservorio mediano con una aguja hipodérmica de 4 pulgadas (Tabla de materiales).
- Desgasificación media
- Permita que el medio de cultivo celular se equilibre a temperatura ambiente (RT).
- Transfiera el volumen de medio necesario a un tubo filtrante cónico.
- Aplique una presión de vacío negativa de -20 PSI para desgasificar el medio (filtración accionada por vacío).
NOTA: Si no se dispone de un vacío, el medio de cultivo celular se puede dejar equilibrar en la incubadora durante la noche para lograr resultados similares.
- Prepare el chip abierto para el flujo de fluido
- Coloque las virutas y las partes fluidas estériles debajo del BSC y alinee la tapa (parte superior) del chip abierto para sellar el prototipo de chip abierto antes de comenzar el flujo de fluido.
- Pipetear 200 μL del medio de cultivo celular desgasificado (ver tablas específicas de órganos) en el puerto de entrada de los canales superior e inferior del chip mientras se presta atención para evitar burbujas.
- Pipetear 300 μL del medio de cultivo en el tubo microfluídico corto para cebar la superficie interna de los tubos y conectar el tubo corto a las entradas de los canales superior e inferior del chip.
- Conectar y cebar las superficies microfluídicas
- Coloque los depósitos medianos en el estante de la granja, conecte la aguja hipodérmica a la entrada inferior de las virutas y, finalmente, coloque todas las virutas en el soporte de la carcasa dentro de la incubadora.
- Conecte los chips a la bomba peristáltica y luego inspeccione todos los conectores para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya fugas visibles de medios de cultivo celular.
- Use el botón de purga de la bomba y manténgalo presionado durante unos 15 s o hasta que aparezcan las gotas del medio de cultivo celular al final del tubo de salida.
- Utilice el sistema de control de la bomba para ajustar el caudal de chip de órgano adecuado (Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5).
7. Mantenimiento de chips
- Mantenimiento de chips de órganos
- Preparar el medio de cultivo celular fresco para el epitelio y/o endotelio y realizar los pasos de desgasificación (como se describió anteriormente en el paso 6.2).
- Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera los chips de la incubadora al BSC y retire el volumen de medios que quedan en los depósitos.
- Reemplace los medios de cultivo celular en los depósitos de entrada superior e inferior con 5 ml de medios de cultivo celular frescos y vuelva a colocar los portadores de la carcasa del chip en la incubadora. Conecte los chips a la bomba peristáltica y reinicie el flujo.
NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire. - Repita los pasos 7.1.1-7.1.3 cada dos días, como se indica en la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5.
- Establecimiento de la interfaz aire-líquido (ALI)
- Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y retire el volumen de medio que queda en el depósito superior.
- Aspire suavemente todo el medio desde el canal microfluídico superior y sujete el tubo microfluídico corto conectado a las entradas superiores utilizando clips aglutinantes para reducir la evaporación del medio y el mantenimiento de ALI.
- Coloque el chip abierto en el(los) soporte(s) de carcasa de nuevo en la incubadora y vuelva a conectar los chips a la bomba peristáltica.
NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire. - Reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.
- Estiramiento (opcional)
- Haga una pausa en la bomba peristáltica y conecte los puertos de vacío de los chips al módulo de vacío utilizando dos tubos microfluídicos largos por chip.
- Utilice el módulo de vacío para ajustar el ajuste de estiramiento a la condición recomendada para cada órgano como se especifica dentro de las tablas de protocolo de órganos: Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea; y Tabla suplementaria 4 para el intestino.
- Inspeccione visualmente las conexiones de los tubos para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio.
- Reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.
8. Siembra de células endoteliales en el compartimento vascular
- Preparar células y chips para la siembra de células vasculares
- Cultive las células endoteliales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta el 80% -90% confluente. Disociar las células mediante un procedimiento enzimático proteolítico (según lo recomendado por el proveedor) y, finalmente, resuspender las células endoteliales en una solución de 3 x 106 células/ml.
NOTA: Para obtener los mejores resultados, cosechar las células endoteliales a paso bajo (P2-P4) durante la fase de crecimiento activo cuando alcanzan entre 70% -90% de confluencia. - Pausa la bomba peristáltica. Transfiera los chips de la incubadora al BSC, desconecte los chips de los depósitos de medios y cualquier tubo conectado, y luego agrupe los chips en placas de Petri separadas.
- Refrescar el medio de cultivo celular del compartimento epitelial con un nuevo medio de cultivo de células epiteliales. Enjuague el canal vascular con un medio de cultivo de células endoteliales frescas dos veces y luego aspire el medio del compartimiento vascular.
- Cultive las células endoteliales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta el 80% -90% confluente. Disociar las células mediante un procedimiento enzimático proteolítico (según lo recomendado por el proveedor) y, finalmente, resuspender las células endoteliales en una solución de 3 x 106 células/ml.
- Siembra de células endoteliales
- Sembrar el canal inferior (vascular) con 25 μL de suspensión de células endoteliales (3 x 106 células/ml), voltear los chips boca abajo para permitir que las células endoteliales se adhieran a la superficie superior de la cámara microfluídica.
NOTA: Añadir 50 μL de la suspensión celular por chip (600 μL por 12 chips). - Agrupe las fichas en placas de Petri. Colóquelos de nuevo en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2, y deje que las células endoteliales se adhieran durante 1 h.
- Después de 1 h, transfiera los chips de la incubadora al BSC. Enjuague el canal vascular con medio de cultivo de células endoteliales dos veces para eliminar los desechos celulares.
- Repita los pasos 8.2.1-8.2.2 para sembrar el canal vascular una vez más con células endoteliales y coloque las astillas planas para facilitar la adhesión de las células endoteliales a la superficie inferior del canal vascular.
- Sembrar el canal inferior (vascular) con 25 μL de suspensión de células endoteliales (3 x 106 células/ml), voltear los chips boca abajo para permitir que las células endoteliales se adhieran a la superficie superior de la cámara microfluídica.
- Vuelva a conectar el chip para que fluya
- Llenar el reservorio del medio vascular con el medio de cultivo celular vascular desgasificado bajo el BSC.
- Vuelva a colocar los chips dentro de la(s) portadora(s) de la carcasa del chip y vuelva a conectar los chips a los depósitos medianos en un extremo a la bomba peristáltica en el otro extremo.
NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire. - Inspeccione visualmente las conexiones microfluídicas para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio. Luego, reanude el flujo de fluido iniciando la bomba peristáltica.
9. Ensayos comunes de punto final
- Desconectar chips para ensayos de punto final
- Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera los portadores de la carcasa del chip de la incubadora al BSC y libere los chips.
- Lave suavemente la cámara central del chip abierto con el medio de cultivo de células epiteliales y el canal vascular con el medio de cultivo de endotelio dos veces para eliminar cualquier residuo celular.
- Retire la tapa del chip abierto para acceder al compartimento apical del chip con pinzas.
- Inmunotinción para microscopía de fluorescencia
- Proceda con la fijación, permeabilización y bloqueo convencional de la muestra.
NOTA: En este estudio, las muestras se fijaron en 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 1 h, seguido de enjuague con PBS, permeabilización en Triton X-100 al 0,1% durante 40 min y bloqueo en albúmina sérica bovina al 1% durante 1 h. - Incubar los chips con anticuerpos primarios (Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche. y luego lavar los compartimentos epitelial y endotelial de los chips con 200 μL de PBS dos veces. Luego, proceda con los anticuerpos secundarios apropiados durante 2 h.
NOTA: Diluir los anticuerpos primarios y secundarios en PBS + 1% BSA a una dilución de 1:100 (anticuerpo primario) y 1:200 (anticuerpo secundario).
- Proceda con la fijación, permeabilización y bloqueo convencional de la muestra.
- Inmunohistoquímica
- Extraiga los equivalentes estromales de la cámara principal del chip Open-Top con pinzas, recójalos en un tubo de 1,5 ml lleno de formalina tamponada neutra al 10% e incube durante al menos 24 h.
- Transfiera el equivalente estromal fijo al procesador de tejido y siga los pasos a continuación para lograr una deshidratación óptima de la muestra.
- Sumergir el hidrogel en etanol al 70% durante 90 min.
- Retire el etanol al 70% y sumerja el hidrogel en etanol al 80% durante 90 min.
- Retire el etanol al 80% y sumerja el hidrogel en etanol al 95% durante 90 min.
- Retire el etanol al 95% y sumerja el hidrogel en etanol al 100% durante 90 minutos dos veces.
- Retire el etanol al 100% y sumerja el hidrogel en una solución de xileno durante 120 minutos dos veces.
- Retire la solución de xileno e infiltre los equivalentes estromales procesados en cera de parafina durante 120 minutos (~ 2 h) dos veces.
- Incruste los equivalentes estromales infiltrados en bloques de parafina seccionados.
- En este punto, los equivalentes estromales pueden ser seccionados como bloques de parafina utilizando un micrótomo y procesados de acuerdo con las técnicas histológicas convencionales26.
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Representative Results
Micropatrones superficiales
El micropatrón de la matriz extracelular (ECM) se puede utilizar para replicar la configuración espacial de la interfaz de la cripta intestinal. La configuración del chip abierto se puede modificar para integrar sellos micropatronados diseñados específicamente para imitar la topografía natural de la interfaz epitelio-estroma colónico (Figura 6A, B) y las criptas intestinales a escala micrométrica (Figura 6C-E). Tenga en cuenta que utilizamos una superficie plana (no modelada) para los modelos de piel, vías respiratorias y alvéolos. El sello se utilizó en este caso para obtener una superficie de hidrogel uniforme para sembrar células epiteliales. Optamos por un diseño que pudiera imitar la arquitectura natural de la mucosa intestinal humana, que consiste en la alternancia de cúpulas positivas y negativas que imitan las criptas intestinales.
Modelos de órganos
Cultivamos y diferenciamos cuatro epitelios diferentes (piel, alvéolo, vía aérea e intestino) utilizando el prototipo Open-Top Chip para demostrar la versatilidad de esta plataforma biomimética. Las secciones histológicas de los chips de órganos confirman la presencia de células epiteliales que son fenotípicamente distintas y representativas de: un epitelio estratificado en el caso de la piel (Figura 7), epitelio columnar pseudoestratificado en el caso de la vía aérea (Figura 8 y Video complementario 1), epitelio escamoso simple en el caso del alvéolo (Figura 9), y epitelio columnar simple en el caso del intestino (Figura 10). Las células de la piel, las vías respiratorias y las alveolares se obtuvieron de proveedores disponibles comercialmente (como se especifica en la Tabla de materiales).
Figura 1: Esquema del chip Open-Top y la configuración microfluídica utilizada en este estudio. (A-C) Vista superior, proyección capa por capa y representación 3D que muestra el prototipo de diseño de chip abierto que comprende la tapa superior extraíble con canal microfluídico encapsulado (azul), los dos canales de vacío semilunares junto a la cámara de cultivo (gris) y los canales microfluídicos endoteliales en espiral inferior (magenta). (D) Soporte de chip hecho a medida (también llamado "sistema de granja") que incluye el portador de la carcasa del chip (flecha roja), la bomba peristáltica y los depósitos (flecha amarilla) dispuestos en una configuración que encaja en una incubadora de cultivo celular común. € Actuador neumático, el instrumento que controla la presión negativa aplicada al canal de vacío de los chips, que se utiliza para generar la fuerza mecánica cíclica que experimentan las células durante la respiración o el movimiento de peristaltismo (estiramiento). Esta figura ha sido adaptada con permiso de Varone et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción técnica del protocolo de skin-chip abierto . (A) Esquema que muestra la secuencia de acciones para la preparación de chips de piel abiertos y (B) proporciona el paso biológico clave del cultivo de chips de piel abiertos. En la fase inicial de la preparación del chip, las células mesenquimales (fibroblastos) se incrustan en el gel y se cargan en el chip abierto para formar la capa estromal, que se recubre durante 2-4 h y se siembra con células epiteliales. Una vez que las células epiteliales han formado una monocapa compacta, se exponen al aire (LPA). El sistema biológico se mantiene bajo régimen ALI hasta que se sacrifica para su análisis el día 14. El estiramiento mecánico se puede aplicar mientras el sistema está bajo flujo y en ALI. El estiramiento se mantiene hasta que los tejidos se sacrifican para su análisis. Se puede encontrar información adicional sobre la composición de los medios, los reactivos específicos y los tipos de células en la Tabla suplementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Descripción técnica del protocolo de chip alvéolo descapotable. (A) Esquema que muestra la secuencia de acciones para la preparación de chips de alvéolos abiertos y (B) proporciona el paso biológico clave del cultivo de chips de alvéolos descapotables. En la fase inicial de la preparación del chip, las células mesenquimales (fibroblastos) se incrustan en el gel y se cargan en el chip abierto para formar la capa estromal , que se recubre durante 2-4 h y se siembra con células epiteliales de las vías respiratorias en un medio suplementado con KIAD (ver Tabla complementaria 2). El medio suplementado con EGF se mantiene durante ~ 4 días para apoyar el crecimiento de las células epiteliales. Luego, el epitelio se expone al aire (ALI) durante ~ 10 días para lograr la maduración completa del tejido. Las células endoteliales microvasculares pulmonares se siembran el día 14, y el sistema biológico se mantiene bajo ALI y régimen de flujo hasta que se sacrifican para su análisis el día 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Descripción técnica del protocolo de chip de vía aérea descapotable. (A) Esquema que muestra la secuencia de acciones para la preparación de chips de vía aérea descapotable y (B) proporciona el paso biológico clave del cultivo de chip de vía aérea descapotable. En la fase inicial de la preparación del chip, las células mesenquimales (fibroblastos y/o células musculares lisas) se incrustan en el gel y se cargan en el chip abierto para formar la capa estromal, que se recubre durante 2-4 h y se siembra con células epiteliales en un medio suplementado con EGF (ver Tabla complementaria 3). El medio suplementado con EGF se mantiene durante ~ 4 días para apoyar el crecimiento de las células epiteliales. Luego, el epitelio se expone al aire (ALI) durante ~ 10 días para lograr la maduración completa del tejido. Las células endoteliales microvasculares pulmonares se siembran el día 14, y el sistema biológico se mantiene bajo ALI y régimen de flujo hasta que se sacrifican para su análisis el día 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Descripción técnica del protocolo de chip de intestino descapotable . (A) Esquema que muestra la secuencia de acciones para la preparación de chips de intestino abierto y (B) proporciona el paso biológico clave del cultivo de chips de intestino abierto. En la fase inicial de la preparación del chip, las células mesenquimales (fibroblastos colónicos) se incrustan en el gel y se cargan en el chip abierto para formar la capa estromal, que se recubre durante 2-4 h y se siembra con fragmentos de colonoides epiteliales obtenidos de resecciones clínicas. Se requiere un medio de cultivo celular, incluidos suplementos (ROCK y CHIR, ver Tabla suplementaria 4) durante la etapa de siembra para mantener la viabilidad de las células colonoides y la morfología fisiológica. Luego se utilizan diferentes medios para impulsar la expansión (día 1 a 6) y la maduración (día 6 a 9) del epitelio colónico. Las células endoteliales microvasculares colónicas se siembran el día 6 utilizando un medio de cultivo de células endoteliales (EGM2 MV), y luego se cultivan bajo flujo con un medio de expansión epitelial durante un máximo de 10 días más. El epitelio se expone a ALI desde el día 10 para promover aún más la maduración de las células epiteliales. El estiramiento mecánico se puede aplicar al sistema desde el día 13 y mantenerse hasta el día 16, cuando el modelo de órgano se sacrifica para el análisis del punto final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estampado de micropatrones. (A) La vista lateral y superior del sello que muestra la textura a microescala (matriz de pilares de 500 μm de altura y 250 μm de ancho) se utiliza para recrear la interfaz de tejido de la cripta colónica y la vista superior y lateral del conjunto de chip de sello, mostrando el ajuste de los dos elementos cuando se usan para fundir la superficie del gel. (B) Vista lateral en ángulo que muestra la interfaz del sello y el chip. (C-E) Imágenes de la superficie de gel microestampada con y sin células. Barras de escala: 200 μm. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Varone et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Datos representativos obtenidos con el skin-chip abierto . (A) Esquema que muestra la secuencia de acción para la preparación de chips de piel abiertos y proporciona los pasos biológicos clave del cultivo de chips de piel abiertos. (B) PCNA Cytokeratin 14, Cytokeratin10, Involucrin y Fillagrin fluorescencia de tinción y H&E que muestra epidermis estratificada multicapa madura diferenciada en Chip. Barras de escala: 100 μm. (C) Imagen de vista superior de la sección transversal Skin-Chip (barras de escala: 5 mm) y H&E (barras de escala: 100 μm) que muestra la presencia de los fibroblastos dentro de la capa dérmica. (D) Tinción de fluorescencia de PECAM-1, VE-Cadherin y Von Willebrand que muestra la diferenciación de células endoteliales microvasculares humanas cocultivadas en el chip de piel abierto. Barras de escala: 20 μm. (E) Representación conceptual de dibujos animados en 3D del chip de piel abierto. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Varone et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Datos representativos obtenidos con el chip de vía aérea descapotable. (A) Esquema que muestra la secuencia de acción para la preparación de chips de vías respiratorias abiertas y proporciona el paso biológico clave del cultivo de chips de vía aérea descapotable. (B) MUC5AC (cáliz), α y β-tubulina (células ciliadas), proteína de células clara 16 (células club), p63 (células basales/progenitoras) y tinción de fluorescencia ZO-1 que muestra epitelio maduro de las vías respiratorias. Barras de escala: 20 μm. (C) Video/imagen de contraste de fase que muestra la presencia de cilios latiendo. Barras de escala: 50 μm. (D) Tinción H&E (Barras de escala: 20 μm) e imagen TEM (barras de escala: 5 μm) que muestra epitelio pseudoestratificado maduro diferenciado en chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Datos representativos obtenidos con el chip alvéolo abierto. (A) Esquema que muestra la secuencia de acción para la preparación de chips de alvéolos abiertos y proporciona el paso biológico clave del cultivo de chips de alvéolos abiertos. (B) Tipo I (HTI-56, AT1-α), Tipo II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, Surfactante (C) y E-Cadherina tinción fluorescente que muestra la presencia de neumocitos maduros en Chip. Barras de escala: 20 μm. (C) Imagen SEM y TEM que muestra la presencia de microvellosidades y vesículas lisosomales evidencia de fenotipo alveolar maduro. Barras de escala: 5 μm. (D) Sección transversal H&E (barras de escala: 5 μm) confirmando la presencia de células planas y escamosas consistentes con el fenotipo Tipo I y células cuboidales, similares a adoquines, coherentes con el fenotipo Tipo II, y (E) mostrando la presencia de los fibroblastos dentro de la capa dérmica (Barras de escala: 10 μm). (F) Representación conceptual de dibujos animados en 3D del alvéolo abierto. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Varone et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Datos representativos obtenidos con el chip de intestino abierto. (A) Esquema que muestra la secuencia de acción para la preparación de chips de intestino abierto y proporciona el paso biológico clave del cultivo de chip de intestino abierto. (B) Vista lateral en ángulo que muestra el ensamblaje de Stamp and Chip durante la fase de fundición de gel, el concepto de dibujos animados del gel micromodelado y las imágenes de contraste de fase de una estructura similar a una cripta micromodelada en la superficie del gel y sembrada con colonoides a dos alturas diferentes. Barras de escala: 200 μm. (C) Tinción de fluorescencia de Mucina 2 y E-Cadherina que muestra la presencia de enterocitos y células caliciformes maduras en Chip. Barras de escala: 200 μm. (D) Sección transversal H&E de una estructura similar a una cripta que muestra la presencia de los fibroblastos dentro de la capa dérmica y confirma la presencia de un epitelio columnar simple. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video complementario 1: Video de contraste de fase que muestra cilios latiendo. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 1: Montaje de chip descapotable. (A) Esquema que muestra la representación tridimensional del conjunto de chips abiertos y la representación de dibujos animados del chip de piel abierto con los diferentes compartimentos biológicos resaltados e incluyendo epitelial (azul), dérmico (amarillo) y vascular (rojo). (B) La plataforma microfluídica ensamblada tiene un formato de 35 mm x 17 mm, un área de cultivo de tejidos de 0,32 cm2, un canal microfluídico en espiral inferior y una tapa de cámara con un canal microfluídico. (C) La plataforma comprende una cámara con una pared angulada de 5 grados, que tiene un diámetro de 6 mm al nivel de la membrana y 5,7 mm en la parte superior de la pared de la cámara PDMS y una altura de 4 mm y ancho. La membrana porosa tiene un espesor de 50 μm y los poros tienen un diámetro de 7 μm. (D) El canal microfluídico inferior en forma de espiral tiene dimensiones de sección transversal de 400 μm (altura) x 600 μm (ancho). (E) Una visión general de la línea de tiempo del experimento y los pasos necesarios para preparar el Open-Top Organ-Chip. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro complementario 1: Piel. La tabla proporciona un resumen de los pasos diarios clave y los parámetros de estiramiento y flujo utilizados durante las tres fases del cultivo Open-Top Skin-Chip (crecimiento, proliferación y diferenciación). La tabla también proporciona la lista de materiales, las formulaciones del medio e instrucciones sobre cómo preparar los medios necesarios para este protocolo. La composición de los tres medios está optimizada para las diferentes fases del protocolo. Específicamente, el Medio I está optimizado para la fase de siembra y cultivo temprano de queratinocitos. El medio II está optimizado para la proliferación y la diferenciación temprana (formación de un epitelio estratificado). El medio ALI está optimizado para mantener los queratinocitos en una interfaz aire-líquido hasta que se produce una epidermis completamente diferenciada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 2: Alvéolo. La tabla proporciona un resumen de los pasos diarios clave y los parámetros de estiramiento y flujo utilizados durante las tres fases del cultivo de chips de alvéolos abiertos (crecimiento, proliferación y diferenciación). La tabla también proporciona la lista de materiales, las formulaciones del medio e instrucciones sobre cómo preparar los medios necesarios para este protocolo. La composición de los dos medios está optimizada para las diferentes fases del protocolo. Tenga en cuenta que la adición de suplementos (KIAD) al medio de cultivo celular es fundamental para lograr una diferenciación óptima de los neumocitos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro complementario 3: Vía aérea. La tabla proporciona un resumen de los pasos diarios clave y los parámetros de estiramiento y flujo utilizados durante las tres fases del cultivo de chips de vías respiratorias abiertas (crecimiento, proliferación y diferenciación). La tabla también proporciona la lista de materiales, la formulación del medio e instrucciones sobre cómo preparar el medio necesario para este protocolo. La composición del medio está optimizada para mantener las células de las vías respiratorias en la interfaz aire-líquido, lo que, a su vez, induce la diferenciación terminal y estimula la producción de moco. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 4: Intestino. La tabla proporciona un resumen de los pasos diarios clave y los parámetros de estiramiento y flujo utilizados durante las tres fases del cultivo de chips de intestino abierto (crecimiento, proliferación y diferenciación). La tabla también proporciona la lista de materiales, las formulaciones del medio e instrucciones sobre cómo preparar los medios necesarios para este protocolo. Las composiciones de ambos medios están optimizadas para las diferentes fases del protocolo. Específicamente, el medio de expansión suplementado con los inhibidores CHIR y ROCK está optimizado para la siembra y la fase temprana del cultivo porque promueve la supervivencia y el crecimiento del fragmento organoide colónico como una monocapa. El medio de expansión está optimizado para la proliferación y diferenciación temprana de la monocapa de epitelio. El medio de diferenciación está optimizado para la diferenciación terminal de la monocapa de epitelio antes de la exposición a la interfaz aire-líquido. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El chip Open-Top representa una plataforma habilitadora para investigar la compleja interacción celular que ocurre entre el endotelio, el estroma y el epitelio en un microambiente controlado, en tiempo real. Esta tecnología ofrece ventajas críticas sobre los cultivos organotípicos y organoides convencionales, como la integración de señales físicas y bioquímicas que son relevantes para reconstituir el microambiente del tejido humano, incluido el cizallamiento fluídico (flujo), el estiramiento cíclico y la reconstrucción de la topografía de la superficie epitelial lograda a través de micropatrones. Las células humanas que crecen dentro de esta plataforma actúan en sinergia para recapitular funciones específicas de tejido que pueden analizarse a través de técnicas convencionales, incluida la histoquímica inmune y los ensayos bioquímicos utilizando los fluidos de salida (o efluentes) de los compartimentos superior y / o inferior. El diseño actual permite un fácil acceso a la capa epitelial, donde las células crecen en contacto directo con fibroblastos específicos de tejido y otras células del estroma, imitando la arquitectura multicelular de los tejidos epiteliales. En particular, el prototipo Open-Top Chip ofrece una solución viable a los desafíos comunes asociados con el uso de otras plataformas de órgano en chip. Si bien permite la incorporación de varios tipos de células diferentes dentro de un compartimento estromal que conduce a la creación de tejidos 3D muy complejos, también permite una fácil extracción de las construcciones de tejido establecidas del dispositivo de chip para el análisis posterior, incluida la tinción convencional de H&E.
El diseño actual presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, la membrana elástica interpuesta entre el microcanal vascular y el compartimiento estromal (hidrogel) del prototipo de chip abierto es considerablemente más gruesa (≈ 50 μm frente a ≈ 1 μm) que el espacio intersticial que separa los tejidos endoteliales del estroma en los órganos humanos nativos. Aunque la membrana elástica no representa una barrera física para la difusión de moléculas grandes, como las hormonas y otros factores paracrinos que median la diafonía intercelular entre tejidos, puede limitar las interacciones directas célula-célula y la migración de células del compartimiento vascular al estromal. Finalmente, el prototipo de chip Open-Top está hecho de PDMS, que se sabe que absorbe una gran cantidad de compuestos hidrófobos. Esta limitación es compartida por muchas plataformas basadas en PDMS que pueden ser un serio obstáculo en aplicaciones destinadas a probar la farmacodinámica y la farmacocinética de pequeños compuestos terapéuticos27.
Uno de los principales desafíos de integrar hidrogeles 3D en un dispositivo microfluídico como el Open-Top Chip, es que el PDMS no proporciona un sustrato óptimo para la unión de proteínas o células humanas. Por lo tanto, la funcionalización química de la superficie PDMS es un paso crítico en este protocolo que se requiere para garantizar el recubrimiento ECM adecuado y la adhesión de hidrogel a la cámara de gel del modelo Open-Top Chip. Para lograr resultados óptimos, el agente de reticulación en la solución ER1 siempre debe protegerse de la exposición directa a la luz. Un indicador importante del estado reactivo del reticulante es su color. El reticulante en el ER1, de hecho, sufre una transición de color de naranja brillante a marrón oscuro cuando se oxida. La transición de color se puede utilizar como indicador después del paso de activación UV para comprobar si la solución ha reaccionado eficazmente con la superficie PDMS. Durante la preparación de la solución reticulante, se debe controlar la transición de color para garantizar que una exposición accidental a la luz directa no fotoblanquee el compuesto químico en la solución. Para proteger la solución de reticulación y evitar cualquier fotoblanqueo no deseado, sugerimos envolver papel de aluminio, aproximadamente 15 cm x 15 cm, alrededor de un tubo cónico de 15 ml o usar un tubo ámbar disponible en el mercado. El uso del ER1 permite un método simple y eficaz para lograr una rápida funcionalización de las superficies PDMS; sin embargo, hay otras moléculas que se pueden usar en lugar de ER1. Por ejemplo, el reticulante químico 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMES) no es tan fotosensible como el ER1 y puede usarse para lograr resultados similares con algunos pasos adicionales como hemos descrito anteriormente en otra parte28,29. Independientemente de la molécula de elección, una de las principales limitaciones para trabajar con un reticulante químico es la presencia de residuos sobrantes, que pueden inducir citotoxicidad. Después de la reacción de activación, es importante enjuagar las superficies microfluídicas con abundantes volúmenes de solución de lavado.
Debido a que las burbujas de aire tienden a formarse y crecer dentro de las interfaces hidrófobas de los chips, tubos y conectores, es importante evaluar si la trayectoria microfluídica está libre de burbujas de aire antes de comenzar el flujo de fluido. Las burbujas pueden interrumpir el flujo e incluso matar las células cuando los chips están conectados al flujo. El cebado de los componentes microfluídicos antes de iniciar el flujo de fluido reducirá el riesgo de generar burbujas de aire y ayudará a lograr resultados óptimos y reproducibles. Si el ciclo de cebado descrito en este protocolo no fuera suficiente, enjuagar los tubos microfluídicos con etanol (5 min) y luego con HBSS (20 min) mitigará aún más el riesgo de generar burbujas de aire dentro de los conectores fluídicos.
A pesar de sus limitaciones, PDMS posee una rara combinación de propiedades químicas que ha permitido la fabricación de dispositivos microfluídicos altamente biocompatibles, transparentes y elásticos. Todas estas propiedades han hecho de PDMS el material más ampliamente aplicado para la construcción de los modelos Organ-on-Chip en la última década. Los avances recientes en los campos de la ciencia de materiales y la ingeniería química30,31 sugieren que el componente PDMS de esta plataforma podría ser reemplazado en un futuro próximo por nuevos polímeros sintéticos o biomateriales. Si se logra con éxito, podría permitir la recapitulación de las propiedades específicas del tejido, incluida la porosidad, la composición ECM del espacio intersticial que proporciona un mimetismo más cercano a los tejidos nativos humanos y modelos más avanzados para estudios de farmacología. Anticipamos que la evolución futura del diseño del chip Open-Top permitirá el modelado de tejidos y órganos humanos con un nivel de detalle sin precedentes.
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Disclosures
Los autores declaran los siguientes intereses financieros / relaciones personales, que pueden considerarse como posibles intereses en competencia: Varone Antonio es un ex empleado de Emulate Inc. y puede tener una participación accionaria en Emulate.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
A-83-01 | Tocris | 2939 | |
Adenine | Sigma | A9795 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
Aluminum foil | - | - | - |
Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
B27 | Thermo | 17504044 | |
Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
Hemocytometer | - | - | - |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
HEPES | Thermo | 15630080 | |
Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Ice bucket | - | - | - |
Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
Manual counter | - | - | - |
Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
N2 | Sigma | 17502001 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
T25 flasks | - | - | - |
T75 flasks | - | - | - |
Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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