Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היכולות ואת אופני התרבית החיוניים של שבב האיברים הפתוח להקמה והבשלה מוצלחת של תרביות איבר-על-שבב בעובי מלא של רקמות ראשוניות (עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי), ומספק הזדמנות לחקור היבטים תפקודיים שונים של ממשק נישה אפיתל/מזנכימלי וכלי דם אנושי במבחנה.
Abstract
כמעט כל האיברים האנושיים מרופדים ברקמות אפיתל, המורכבות משכבה אחת או יותר של תאים מחוברים היטב המאורגנים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). אחד התפקידים העיקריים של אפיתליה הוא היווצרות של מחסומים המגנים על רקמות קו תחתון מפני עלבונות פיזיים וכימיים וסוכנים זיהומיים. בנוסף, אפיתליה מתווכת את ההובלה של חומרים מזינים, הורמונים ומולקולות איתות אחרות, ולעתים קרובות יוצרת שיפועים ביוכימיים המנחים את מיקום התאים ומידור בתוך האיבר. בשל תפקידם המרכזי בקביעת מבנה האיברים ותפקודם, אפיתליה היא מטרה טיפולית חשובה למחלות אנושיות רבות שלא תמיד נלכדות על ידי מודלים של בעלי חיים. מלבד ההבדלים הברורים בין מינים למינים, ביצוע מחקרים על תפקוד מחסום ותכונות הובלה של אפיתליה בבעלי חיים מחמיר עוד יותר על ידי הקושי לגשת לרקמות אלה במערכת חיה. בעוד תרביות תאים אנושיים דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימושיות למענה על שאלות מדעיות בסיסיות, לעתים קרובות הן מניבות תחזיות גרועות in vivo . כדי להתגבר על מגבלות אלה, בעשור האחרון, שפע של פלטפורמות ביומימטיות מיקרו-מהונדסות, הידועות בשם איברים על שבב, התגלו כחלופה מבטיחה לניסויים מסורתיים במבחנה ובבעלי חיים. במאמר זה אנו מתארים שבב איברים פתוח (או Open-Top Chip), פלטפורמה המיועדת למידול רקמות אפיתל ספציפיות לאיברים, כולל העור, הריאות והמעיים. שבב זה מציע הזדמנויות חדשות לבנייה מחדש של הארכיטקטורה והתפקוד הרב-תאיים של רקמות אפיתל, כולל היכולת ליצור מחדש רכיב סטרומה תלת-ממדי על ידי שילוב פיברובלסטים ספציפיים לרקמות ותאי אנדותל בתוך מערכת פעילה מכנית. שבב פתוח זה מספק כלי חסר תקדים לחקר אינטראקציות אפיתל/מזנכימליות וכלי דם בסקאלות רזולוציה מרובות, מתאים בודדים ועד מבנים רקמתיים רב-שכבתיים, ובכך מאפשר דיסקציה מולקולרית של הדיבור הבין-תאי של איברים אפיתליאליים בבריאות ובחולי.
Introduction
מבחינה היסטורית, מדענים הסתמכו על ניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים לצורך גילוי תרופות, אך מספר גדל והולך של שיטות אלה הוטלו בספק בגלל מתאם גרוע עם תוצאות אנושיות1. יישום עקרונות "3Rs" להחלפה, הפחתה ושכלול של ניסויים בבעלי חיים דוחק במדענים למצוא שיטות חלופיות חדשות במבחנה לתמיכה בהערכת סיכונים פרה-קליניים של תרופות וטוקסיקולוגיה כימית2. עם זאת, מודלים רבים במבחנה שפותחו עד כה חסרים את הארכיטקטורה הביולוגית, המורכבות התאית והסביבה המכנית הנחוצות כדי לשחזר את הטבע הדינמי של איברים חיים אנושיים 3,4.
מערכות פרה-קליניות קונבנציונליות במבחנה משתמשות בדרך כלל במונוקולטורה דו-ממדית של תאים אנושיים הגדלים על משטח פלסטיק קשיח. שיטות אלה מספקות כלי לביצוע מחקרים מכניסטיים פשוטים ומאפשרות סינון מהיר של מועמדים לתרופה. בשל עלותם הנמוכה יחסית וחוסנם הגבוה, מודלים דו-ממדיים משויכים לעתים קרובות למערכות אוטומטיות בעלות תפוקה גבוהה ומשמשים לזיהוי מהיר של מועמדים פוטנציאליים לתרופות בשלב המוקדם של תהליך פיתוח התרופה 5,6. עם זאת, מודלים דו-ממדיים כאלה אינם מספקים גישה תרגומית למידול תגובות ברמת הרקמה, ברמת האיבר או ברמת המערכת למועמדים טיפוליים, הדרושה לחיזוי מדויק של בטיחות ויעילות התרופות בשלב הפרה-קליני של פיתוחן. תרביות תאים שטוחות אינן משחזרות את המיקרו-סביבה הטבעית של הרקמה, כולל יחסי הגומלין הרב-תאיים המורכבים, התכונות הביומכניות והארכיטקטורה התלת-ממדית (תלת-ממדית) של רקמות אנושיות7. תאים הגדלים על משטח שטוח לעתים קרובות אינם רוכשים פנוטיפ בוגר, ולכן אינם יכולים להגיב לגירויים פרמקולוגיים כפי שהיו מגיבים ברקמה הטבעית. לדוגמה, תאי אפיתל מכתשית אנושיים ראשוניים הגדלים במבחנה מציגים פנוטיפ קשקשי ומאבדים סמנים פנוטיפיים מרכזיים, כולל חלבונים פעילי שטח C ו- B (SP-C ו- SP-B)8. בנוסף להתמיינות לא מספקת, תאים ראשוניים הופכים לעתים קרובות לבלתי רגישים לגורמי עקה ביולוגיים במבחנה, כאשר מסלולים ביוכימיים מסוימים הקשורים לדלקת רקמות הופכים ללא פונקציונליים9. נראה כי אובדן כזה של תפקוד התא קשור בעיקר לשימוש במצעים נוקשים, כמו גם להיעדר גורמים מסיסים המשוחררים באופן טבעי על ידי תאי סטרומה ספציפיים לרקמות כגון פיברובלסטים של ריאות ותאי שריר חלק10,11.
ההבנה כי היעדר מורכבות כימו-פיזיקלית וביולוגית מגבילה את ההתנהגות הפיזיולוגית של תאים במבחנה עודדה פיתוח מודלים רב-תאיים מתוחכמים יותר, שהוכחו כלוכדים טוב יותר את המורכבות של רקמות אנושיות מחוץ לגוף12,13. מאז יצירת המודלים הראשונים של תרביות משותפות בתחילת שנות השבעים14, הכנסת הידרוג'לים סינתטיים וטבעיים שיפרה באופן משמעותי את היכולת לחקות מיקרו-סביבות רקמה טבעיות והפכה לכלי רב ערך להנעת התמיינות תאית, הנחיית הארגון העצמי של תאים למבנים דמויי רקמות, ושיקום תפקודי רקמה מקומיים15,16. לדוגמה, כאשר הם גדלים בפיגום התלת-ממדי המתאים, תאים אנושיים יכולים להתארגן בעצמם למבנים פונקציונליים כגון ספרואידים או אורגנואידים, המבטאים סמנים של תאי גזע, והם מסוגלים להתחדשות עצמית17. לעומת זאת, תאים אנושיים (כולל תאי גזע), כאשר הם גדלים על מצעים דו-ממדיים מסורתיים, מזדקנים במהירות ועוברים הזדקנות לאחר כמה מעברים18. בנוסף, ניתן "לתפור" הידרוג'לים כך שיתאימו לתכונות רקמה ספציפיות כגון נקבוביות, גודל נקבוביות, עובי סיבים, צמיגות, טופוגרפיה ונוקשות, או להנדס אותם עם רכיבים תאיים שמקורם ברקמה ו/או מולקולות ביו-אקטיביות המאפשרות חיקוי של מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים19,20. למרות הפוטנציאל העצום שלהם לבדיקות תרופות, מודלים מבוססי הידרוג'ל תלת-ממדיים המשמשים במחקר פרמצבטי אינם משחזרים באופן מלא את הציטוארכיטקטורה המורכבת של רקמות in vivo וחסרים גירויים המודינמיים ומכניים חשובים הקיימים בדרך כלל בגוף האדם, כולל לחץ הידרוסטטי, מתיחה מחזורית וגזירת נוזלים21.
מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) כגון איברים על שבבים (OOCs) התפתחו לאחרונה ככלים המסוגלים ללכוד תגובות פיזיולוגיות מורכבות במבחנה22,23. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בפלטפורמות מיקרופלואידיות, המאפשרות מידול של מיקרו-סביבה דינמית של איברים חיים.
שילבנו את העקרונות של ביו-הנדסה תלת-ממדית של רקמות ומכנוביולוגיה כדי ליצור מודל של שבב פתוח של רקמת אפיתל אנושית מורכבת. זה איפשר לנו לשחזר מקרוב את המיקרו-סביבה הרב-תאית והדינמית של רקמות אפיתל. זה כולל רמזים ביוכימיים וביומכניים ספציפיים לרקמות הקיימים באופן טבעי באיברים חיים, אך לעתים קרובות מוזנחים על ידי מודלים מסורתיים במבחנה 24. השבב הפתוח משלב שני תאים: תא כלי דם (איור 1A) ותא סטרומה (איור 1B) המופרדים על-ידי קרום נקבובי, מה שמאפשר פיזור חומרי מזון בין שני החדרים (איור 1C). תא כלי הדם חשוף לזרימת נוזלים רציפה כדי לשחזר לחץ גזירה פיזיולוגי, בעוד העיצוב הנמתח של תא הסטרומה מאפשר מידול של המתח המכני הקשור לתנועות נשימה או פריסטליס מעיים. תא הסטרומה מכיל את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי הניתן להתאמה שנועד לתמוך בצמיחה פיזיולוגית של פיברובלסטים ספציפיים לרקמות. יש לו מכסה נשלף המאפשר הקמת ממשק אוויר-נוזל, מצב המאפשר חיקוי גדול יותר של הפיזיולוגיה האנושית של רקמות הרירית, כמו גם גישה ישירה לרקמה לניהול תרופות ישירות על שכבת האפיתל. איור משלים 1 לוכד כמה ממרכיבי המפתח של תכנון השבב הפתוח, כולל ממדים ותאים ביולוגיים (איור משלים 1A-D), כמו גם את השלבים הטכניים העיקריים המתוארים בפרוטוקול זה (איור משלים 1E).
זילוח של השבב הפתוח מושג באמצעות משאבה פריסטלטית ניתנת לתכנות (איור 1D). מערך המשאבה הפריסטלטית מאפשר לחורר 12 שבבים פתוחים בו זמנית. רוב החממות יכולות לאכלס שני מערכים המאפשרים תרבות של עד 24 שבבים לכל אינקובטור. מתיחה מכנית מושגת באמצעות וסת לחץ ואקום הניתן לתכנות בהתאמה אישית (איור 1E). הוא מורכב מווסת ואקום אלקטרו-פנאומטי הנשלט אלקטרונית על ידי ממיר דיגיטלי לאנלוגי. במילים אחרות, וסת הוואקום האלקטרו-פנאומטי מייצר פרופיל ואקום סינוסואידלי עם משרעת ותדירות שנקבעת על ידי המשתמש. זן מחזורי הנע בין 0% ל -15% נוצר על ידי הפעלת לחץ שלילי על ערוץ הריק של השבב הפתוח באמפליטודה הנעה בין 0 ל -90 kPa ותדר של 0.2 הרץ. זוהי מערכת מותאמת אישית המקבילה ליחידת המתח Flexcell הזמינה מסחרית שאומצה בעבר ותוארה במאמרים אחרים25. כדי לחקות את עיוות הרקמה המכנית הקשורים, למשל, לתנועת הנשימה של הריאה או לפריסטלטיקה של המעי, המפעיל הפנאומטי מפעיל גלי ואקום/מתח סינוסואידים שניתן להתאים את גודלם ואת המשרעת שלהם לרמה הפיזיולוגית של מאמץ ותדירות שתאים אנושיים חווים ברקמה הטבעית שלהם.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה וניתנת לשחזור להנדסה וטיפוח של אפיתל אורגנוטיפי שווה ערך על פלטפורמת אב טיפוס של שבב פתוח. הוא מאפשר יצירת מודלים מורכבים של איברים כגון עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי גס תוך שילוב זרימת נוזל כלי דם ומתיחה מכנית. נתאר היבטים טכניים מרכזיים שיש לקחת בחשבון תוך יישום עקרונות של הנדסת רקמות ליצירת מודלים אפיתליאליים מורכבים. נדון ביתרונות ובמגבלות האפשריות של העיצוב הנוכחי.
סקירה כללית של השלבים העיקריים המשמשים להשגת הבשלת רקמות ואיברים, כולל פרמטרים של זרימה ומתיחה, מדווחת ב: איור 2 עבור העור, איור 3 עבור הנאדיות, איור 4 עבור דרכי הנשימה ואיור 5 עבור המעי. מידע נוסף על הרכב המדיה וריאגנטים המשמשים לגידול דגמי האיברים השונים כלולים בטבלאות המשלימות (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 3 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
קולונואידים אנושיים התקבלו מכריתות מעיים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של בית החולים לילדים בסינסינטי (IBC 2017-2011).
1. הפעלת פני השטח
- הכנת מאגר הפעלה
- הניחו את הקרוסלינקר ואת ריאגנטי החיץ הממס מתחת לארון הבטיחות הביולוגית (BSC) ותנו להם להתאזן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות לפני השימוש.
- הרכיבו מחדש 5 מ"ג של קרוסלינקר ב-5 מ"ל של חיץ הממס באמצעות מיכל סטרילי אטום לאור או צינור חרוטי שקוף בנפח 15 מ"ל עטוף ברדיד אלומיניום כדי להגן על תמיסת הקרוסלינקר מפני חשיפה ישירה לאור.
- מערבול את התמיסה במשך דקה אחת כדי להסיר את כל הגושים, ולאחר מכן פיפטה 50 μL של פתרון crosslinker ישירות לתוך הערוץ התחתון של השבב ו 150 μL לתוך החדר העליון.
- הסר כל עודף של פתרון crosslinking מפני השטח של השבב באמצעות אספירטור. לאחר מכן פיפטה נוספת 50 μL של תמיסת crosslinking ישירות לתוך הערוץ התחתון של השבב ו 150 μL לתוך התא העליון הפתוח כדי להסיר כל בועת אוויר שנותרה.
- הפעלה עם מכונת crosslinking UV
- הסר בעדינות את המכסה מהשבב מתחת ל- BSC ואחסן אותו במיכל סטרילי.
- מעבירים את הצ'יפס המכיל את תמיסת הקרוסלינקר לצלחת פטרי, סוגרים את צלחת הפטרי כדי למנוע זיהום, ומניחים את הצלחת עם הצ'יפס מתחת למכונת הקרוסלינקינג UV.
הערה: הסירו את מכסה צלחת הפטרי כדי למקסם את החשיפה לקרינת UV. - הגדר את מכונת הקישור UV עם אורך גל שיא של 365 ננומטר בעוצמה של 100 μJ / cm2, והפעל את אור UV למשך 20 דקות.
הערה: לאחר 20 דקות של טיפול UV, פתרון crosslinker ייראה כהה יותר (חום). - החזירו את השבבים מתחת ל-BSC ושאפו את תמיסת הקרוסלינקר המחומצנת. לאחר מכן, שטפו את כל השבבים שלוש פעמים עם מאגר הממס ותנו לשבבים להתייבש מתחת ל-BSC במשך 5-10 דקות כדי להשלים את התפקוד הכימי של משטח הפולידימתילסילוקסאן (PDMS).
2. הכנת המקבילה סטרומה
- הכנת חיץ שחזור 10x (100 מ"ל)
- להמיס 2.2 גרם של סודיום ביקרבונט ב 75 מ"ל של 0.067 M NaOH במים מזוקקים כפול.
- מוסיפים 4.76 גרם HEPES ומביאים את הנפח ל -100 מ"ל באמצעות מים מזוקקים כפולים.
- מסננים סטריליים את התמיסה מתחת ל-BSC באמצעות פילטר חד פעמי סטרילי מבקבוק עם קרום של 0.22 מיקרומטר.
הערה: התמיסה יציבה למשך כ-6 חודשים כאשר היא מאוחסנת ב-4°C.
- הערכת נפח תמיסת הפרה-ג'ל
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 150 μL (נפח פנימי של התא הפתוח המרכזי) כדי להעריך את כמות תמיסת הפרה-ג'ל הדרושה לניסוי:
נפח הדרוש = (מספר שבבים x 150) μL - הכינו את תמיסת קדם-ג'ל הקולגן על קרח על ידי ערבוב: נפח אחד של 10x EMEM המכיל את התאים הנבחרים, נפח אחד של חיץ שחזור 10x (ראה שלב 2.1), 8 כרכים של תמיסת קולגן I (10 מ"ג/מ"ל) ו-1 μL של תמיסת 1 N NaOH עבור כל מ"ג קולגן I.
הערה: מומלץ להכין נפח נוסף +15% כדי לקחת בחשבון שגיאות ניסוי; הדוגמה המתוארת בסעיף 2.2 מספקת הליך מפורט שלב אחר שלב להכנת תמיסת קדם-ג'ל מספקת עבור 12 שבבים ונפח נוסף של 15%.
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 150 μL (נפח פנימי של התא הפתוח המרכזי) כדי להעריך את כמות תמיסת הפרה-ג'ל הדרושה לניסוי:
- הכנת תמיסת פרה-ג'ל למקבילה סטרומה (ל-12 שבבים)
- הבא את הפתרונות הבאים תחת BSC על קרח: 10x EMEM; 10x מאגר שחזור (ראה שלב 2.1); תמיסת קולגן I (10 מ"ג/מ"ל); ותמיסת NaOH סטרילית 1 N.
- תרבית תאים מזנכימליים ספציפיים לרקמה לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%, ולאחר מכן מנתקים את התאים באמצעות טריפסין או שיטות אחרות לפי המלצת ספק התא. לאסוף את התאים בגלולה על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 24 ° C.
- השהה מחדש את גלולת התא ב- 225 μL של EMEM 10x קר כקרח, והוסף 225 μL של חיץ שחזור 10x קר כקרח (ראה שלב 2.1). ערבבו את התמיסה בעדינות מעלה ומטה, ולאחר מכן הוסיפו 1,800 מיקרוליטר של תמיסת קולגן I קרה כקרח.
- פיפטה למעלה ולמטה 5-6 פעמים, הימנעות בועות כדי לערבב את תמיסת טרום ג'ל בזמן על קרח.
- שילוב של שווה ערך סטרומה על שבב (עבור 12 שבבים)
- נטרל את תמיסת הפרה-ג'ל עם 18 μL של 1 N NaOH. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 5-6 פעמים, ולאחר מכן פיפטה 150 μL של הידרוג'ל עמוס תאים לתוך התא המרכזי של השבב הפתוח כדי למנוע בועות.
הערה: אם נדרש מיקרו-דפוס, עבור לשלב הבא (סעיף 3). - קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל מכסה צינור צנטריפוגה מלא ב-2 מ"ל של ddH 2 O סטרילי בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
הערה: לאחר 90 דקות, ההידרוג'ל עמוס התאים יעבור פולימריזציה מלאה.
- נטרל את תמיסת הפרה-ג'ל עם 18 μL של 1 N NaOH. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 5-6 פעמים, ולאחר מכן פיפטה 150 μL של הידרוג'ל עמוס תאים לתוך התא המרכזי של השבב הפתוח כדי למנוע בועות.
3. מיקרו-תבניות משטח (אופציונלי)
- בצע מיקרו-תבניות פני השטח של הידרוג'ל הסטרומה לאחר צנרת הקולגן הידרוג'ל המנוטרל (עדיין במצבו הנוזלי) באמצעות חותמות מודפסות בתלת-ממד.
הערה: ניתן להשיג את הבולים המודפסים בתלת-ממד בעיצובים שונים הניתנים להתאמה אישית, כפי שתואר קודם לכן במקום אחר24. - פיפטה 20 μL של תמיסת טרום ג'ל קולגן I מנוטרל על פני השטח המעוצבים של בול סטרילי המודפס בתלת-ממד ומכניסים את החותמת פנימה (למעלה) של התא הפתוח כאשר הידרוג'ל הסטרומה עדיין בצורה נוזלית.
- יש להסיר שאריות של ההידרוג'ל שעלולות להישפך מראש החדר הפתוח באמצעות שואב (או פיפטה). קבצו את כל הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות וכללו פקק צינור חרוטי צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל מלא ב-2 מ"ל של ddHסטרילי 2O בכל צלחת פטרי.
- יש לדגור על כל צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 90 דקות, ולאחר מכן להחזיר את השבבים מתחת ל-BSC ולהסיר בעדינות את החותמות באמצעות פינצטה מדויקת כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בהידרוג'ל.
4. ציפוי משטח האפיתל וכלי הדם בחלבוני ECM ספציפיים לרקמה
- ציפוי התא המיקרופלואידי של כלי הדם בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 20 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM וסקולרית הנדרשת לניסוי:
נפח נדרש = (מספר שבבים x 20) μL
הערה: מומלץ להכין אמצעי אחסון נוסף של 15% כדי להתחשב בשגיאות ניסוי. - הכן את תמיסת ציפוי ECM וסקולרית עבור כל השבבים (לדוגמה, 300 μL לכל 12 שבבים) באמצעות PBS קר כקרח או HBSS.
הערה: עיין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפית בסעיף החומרים המשלימים (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי) לזיהוי ריאגנטים ספציפיים והרכב ECM מומלץ. - פיפטה 20 μL של תמיסת ציפוי ECM וסקולרית לתוך תעלת כלי הדם של כל שבב.
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 20 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM וסקולרית הנדרשת לניסוי:
- ציפוי פני השטח האפיקליים של המקבילה הסטרומלית בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 50 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM אפיתל הנדרשת לניסוי:
נפח נדרש = (מספר שבבים x 50) μL
הערה: מומלץ להכין נפח נוסף של 15% כדי לקחת בחשבון שגיאות ניסוי. - הכינו מספיק תמיסת ציפוי ECM לכל השבבים (לדוגמה, 750 μL לכל 12 שבבים) ב- PBS או HBSS קרים כקרח והעבירו 50 μL של תמיסת ציפוי ECM אפיתל ישירות על גבי משטח ההידרוג'ל.
הערה: עיין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפית בסעיף החומרים המשלימים (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי) לזיהוי ריאגנטים ספציפיים והרכב ECM מומלץ. - קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל פקק צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"ל מלא ב-2 מ"ל של ddH 2 O סטרילי בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2למשך שעתיים לפני שתמשיכו בזריעת תאי אפיתל.
- הכפל את מספר השבבים הדרושים לניסוי ב- 50 μL (נפח תעלת כלי הדם) כדי להעריך את נפח תמיסת ציפוי ECM אפיתל הנדרשת לניסוי:
5. זריעת תאי אפיתל על המקבילה סטרומה
- תרבית תאי אפיתל
- תאי אפיתל ספציפיים לרקמת תרבית לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%.
- נתק את התאים באמצעות הליכי אנזים מפרקי חלבון בהתאם להמלצת ספק התא.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לקצור תאי אפיתל במעבר נמוך (P1-P2) במהלך שלב הגידול הפעיל, כאשר הם מגיעים למפגש של 70%-90%. - לאחר הניתוק, צנטריפוגו את התאים ואספו אותם כגלולה.
- השהה מחדש את תאי האפיתל לצפיפות התא/שבר המתאימה כפי שמצוין בטבלת פרוטוקול האיברים הספציפיים.
הערה: במחקר זה, תמיסת תאים שימשה בצפיפות של 3 x 10 6 תאים / מ"ל עבור העור, 1 x 10 6 תאים / מ"ל עבור alveolus, 6 x 10 6 תאים / מ"ל עבור דרכי הנשימה ו 8 x 10 6 מקטעים / מ"ל עבור המעי.
- זריעת תאי אפיתל
- להעביר את השבבים מן האינקובטור לתוך BSC. שאפו את תמיסת הציפוי מתעלת כלי הדם, ושטפו את התעלה המיקרופלואידית של כלי הדם שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי אנדותל טריים.
- שאפו את תמיסת הציפוי ממשטח ההידרוג'ל ושטפו את משטח הסטרומה שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי אפיתל טריים כדי להסיר תמיסת ציפוי עודפת.
- שואפים את התווך העולה וזורעים את משטח ההידרוג'ל עם 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי האפיתל באמצעות צפיפות תאים מתאימה, כפי שמצוין בטבלאות המשלימות ולאחר מכן מעבירים את השבבים חזרה לאינקובטור למשך שעתיים (או לילה לקולונואידים).
- שטפו בעדינות את משטח ההידרוג'ל עם מדיום תרבית התא פעמיים כדי להסיר פסולת תאית. לבסוף, רענן את המדיום על ידי autoclaving במיכלים אטומים autoclavable, ולחבר את השבבים למשאבה peristaltic.
6. חיבור שבבים לזרימה
- הכנת החלקים הזורמים
- חתכו 2 אינץ' של צינורות העברה תרמופלסטיים מבוססי פוליפרופילן (TPE) תואמים ביולוגית (טבלה של חומרים) כדי להכין את הצינור המיקרופלואידי הקצר הדרוש לחיבור השבבים למאגרי המדיה.
- חתכו 7.5 אינץ' של צינורות העברה TPE תואמים ביולוגית כדי לייצר את הצינור המיקרופלואידי הארוך.
- הכינו מספיק מחברי מתכת 18 G ו- 19 G (טבלת חומרים).
הערה: מומלץ להכין ולעקר את הצינורות והמחברים המתוארים בשלבים 6.1.1 ו-6.1.2 לפחות יום אחד לפני חיבור השבבים הפתוחים למשאבות הפריסטלטיות. - נקב את המכסה של כל מאגר בינוני עם מחט היפודרמית 4 אינץ '(טבלה של חומרים).
- הפחתת גזים בינונית
- אפשרו למדיום תרבית התאים להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
- מעבירים את נפח התווך הדרוש לצינור סינון חרוט.
- החל לחץ ואקום שלילי של -20 PSI כדי להוריד גז מהתווך (סינון מונע ואקום).
הערה: אם ואקום אינו זמין, ניתן להשאיר את מדיום תרבית התאים לשיווי משקל באינקובטור בן לילה כדי להשיג תוצאות דומות.
- הכינו את השבב הפתוח לזרימת נוזלים
- הבא את השבבים ואת חלקי הנוזל הסטריליים מתחת ל- BSC ויישר את המכסה (החלק העליון) של השבב הפתוח לאיטום אב הטיפוס של שבב Open-Top לפני תחילת זרימת הנוזל.
- פיפטה 200 μL של מדיום תרבית התא degassed (ראה טבלאות ספציפיות לאיבר) לתוך פתח הכניסה של שני הערוצים העליון והתחתון של השבב תוך שימת לב כדי למנוע בועות.
- פיפטה 300 μL של מדיום התרבית לתוך צינורות מיקרופלואידים קצרים כדי להקדים את פני השטח הפנימיים של הצינורות ולחבר את הצינור הקצר לפתחים של הערוצים העליונים והתחתונים של השבב.
- לחבר ולכוון את המשטחים המיקרופלואידים
- מקם את המאגרים הבינוניים במדף החווה, חבר את המחט ההיפודרמית לכניסה התחתונה של השבבים, ולבסוף, להכיל את כל השבבים במוביל הדיור (ים) בתוך האינקובטור.
- חבר את השבבים למשאבה הפריסטלטית ולאחר מכן בדוק את כל המחברים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ושאין דליפה נראית לעין של מדיה של תרבית תאים.
- השתמש בלחצן הטיהור במשאבה והחזק אותו למשך כ -15 שניות או עד שטיפות התווך של תרבית התאים מופיעות בקצה צינורות היציאה.
- השתמשו במערכת הבקרה במשאבה כדי להגדיר את קצב זרימת שבב האיבר המתאים (איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5).
7. תחזוקת שבבים
- תחזוקת שבבי איברים
- הכינו תרבית תאים טרייה עבור האפיתל ו/או האנדותל ובצעו את שלבי פירוק הגזים (כפי שתואר קודם לכן בשלב 6.2).
- השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. מעבירים את השבבים מהאינקובטור ל-BSC ומוציאים את נפח המדיה שנשאר למאגרים.
- החלף את מדיית תרביות התאים למאגרי הכניסה העליונים והתחתונים ב-5 מ"ל של מדיה טרייה של תרביות תאים והחזיר את נשא השבב לאינקובטור. חבר את השבבים למשאבה הפריסטלטית והפעל מחדש את הזרימה.
הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר. - חזור על שלבים 7.1.1-7.1.3 פעם ביומיים, לפי איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5.
- הקמת ממשק אוויר-נוזל (ALI)
- השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. מעבירים את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית, ומוציאים את נפח התווך שנותר למאגר העליון.
- שאפו בעדינות את כל התווך מהתעלה המיקרופלואידית העליונה ומהדקים את הצינור המיקרופלואידי הקצר המחובר לפתחים העליונים באמצעות תפסי קלסרים כדי להפחית את אידוי המדיה ותחזוקת ALI.
- הניחו את השבב הפתוח על מוביל הדיור בחזרה לאינקובטור וחברו מחדש את השבבים למשאבה הפריסטלטית.
הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר. - חדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.
- מתיחות (אופציונלי)
- השהה את המשאבה הפריסטלטית וחבר את יציאות הוואקום של השבבים למודול הוואקום באמצעות שתי שפופרות מיקרופלואידיות ארוכות לכל שבב.
- השתמש במודול הוואקום כדי להתאים את הגדרת המתיחה למצב המומלץ עבור כל איבר כמפורט בטבלאות פרוטוקול האיברים: טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 2 לנתיב האוויר; וטבלה משלימה 4 למעי.
- בדוק חזותית את חיבורי הצינור כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני.
- חדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.
8. זריעת תאי אנדותל בתא כלי הדם
- הכנת תאים ושבבים לזריעת תאי כלי דם
- תרבית את תאי האנדותל הספציפיים לרקמה לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%. נתק את התאים באמצעות הליך אנזים פרוטאוליטי (לפי המלצת הספק) ולבסוף, השהה מחדש את תאי האנדותל בתמיסה של 3 x 106 תאים / מ"ל.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, קצרו את תאי האנדותל במעבר נמוך (P2-P4) במהלך שלב הגידול הפעיל כאשר הם מגיעים למפגש של 70%-90%. - השהה את המשאבה הפריסטלטית. מעבירים את השבבים מהאינקובטור ל-BSC, מנתקים את השבבים ממאגרי המדיה ומכל צינורות מחוברים, ואז מקבצים את השבבים לצלחות פטרי נפרדות.
- רעננו את מדיום תרבית התאים של תא האפיתל עם מדיום תרבית תאי אפיתל טרי. יש לשטוף את תעלת כלי הדם בתרבית תאי אנדותל טריים פעמיים, ולאחר מכן לשאוף את התווך מתא כלי הדם.
- תרבית את תאי האנדותל הספציפיים לרקמה לפי הוראות הספקים עד למפגש של 80%-90%. נתק את התאים באמצעות הליך אנזים פרוטאוליטי (לפי המלצת הספק) ולבסוף, השהה מחדש את תאי האנדותל בתמיסה של 3 x 106 תאים / מ"ל.
- זריעת תאי אנדותל
- זרעו את התעלה התחתונה (כלי הדם) עם 25 μL של תרחיף תאי אנדותל (3 x 106 תאים / מ"ל), הפכו את השבבים כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לפני השטח העליונים של התא המיקרופלואידי.
הערה: הוסף 50 μL של מתלה התא לכל שבב (600 μL לכל 12 שבבים). - קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי. החזירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2, ותנו לתאי האנדותל להתחבר למשך שעה אחת.
- לאחר 1 שעה, להעביר את השבבים מן האינקובטור ל BSC. יש לשטוף את תעלת כלי הדם בתרבית תאי אנדותל פעמיים כדי להסיר פסולת תאית.
- חזור על שלבים 8.2.1-8.2.2 כדי לזרוע שוב את תעלת כלי הדם עם תאי אנדותל ולהניח את השבבים שטוחים כדי להקל על הידבקות תאי האנדותל לפני השטח התחתונים של תעלת כלי הדם.
- זרעו את התעלה התחתונה (כלי הדם) עם 25 μL של תרחיף תאי אנדותל (3 x 106 תאים / מ"ל), הפכו את השבבים כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לפני השטח העליונים של התא המיקרופלואידי.
- חבר מחדש את השבב לזרימה
- מלאו את מאגר מדיום כלי הדם בתווך תרבית תאי כלי הדם תחת BSC.
- החזירו את השבבים למנשא(ים) של בית השבבים וחברו מחדש את השבבים למאגרים הבינוניים בקצה אחד למשאבה הפריסטלטית בקצה השני.
הערה: מומלץ להשתמש בפונקציית הטיהור כדי לרענן במהירות את המדיום לתא כלי הדם ולהפחית את הסיכון לבועות אוויר. - בדוק חזותית את החיבורים המיקרופלואידים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני. לאחר מכן, חדש את זרימת הנוזלים על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.
9. בדיקות נפוצות של נקודות קצה
- נתק שבבים עבור בדיקות של נקודות קצה
- השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את נשא בית השבב. העבר את נושא בית השבב מהאינקובטור ל- BSC ושחרר את השבבים.
- שטפו בעדינות את החדר המרכזי של השבב הפתוח עם מדיום תרבית תאי האפיתל ואת תעלת כלי הדם עם מדיום תרבית האנדותל פעמיים כדי להסיר פסולת תאית.
- הסר את מכסה השבב הפתוח כדי לגשת לתא האפי של השבב באמצעות פינצטה.
- Immunostaining עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- המשך בקיבוע דגימה קונבנציונאלי, חדירה וחסימה.
הערה: במחקר זה, הדגימות תוקנו ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך שעה אחת ולאחר מכן שטיפה עם PBS, חדירה ב-0.1% Triton X-100 למשך 40 דקות וחסימה באלבומין בסרום בקר 1% למשך שעה אחת. - לדגור את השבבים עם נוגדנים ראשוניים (טבלה של חומרים) ב 4 ° C במשך הלילה. ולאחר מכן לשטוף את שני תאי אפיתל אנדותל של שבבים עם 200 μL של PBS פעמיים. לאחר מכן, המשך עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך 2 שעות.
הערה: לדלל את הנוגדנים הראשוניים והנוגדנים המשניים ב- PBS + 1% BSA בדילול של 1:100 (נוגדן ראשוני) ו- 1:200 (נוגדן משני).
- המשך בקיבוע דגימה קונבנציונאלי, חדירה וחסימה.
- אימונוהיסטוכימיה
- חלצו את המקבילות סטרומה מהחדר הראשי של השבב הפתוח באמצעות פינצטה, אספו אותן לתוך צינור 1.5 מ"ל מלא בפורמלין חוצץ נייטרלי 10% ודגרו במשך 24 שעות לפחות.
- העבר את הסטרומה הקבועה המקבילה למעבד הרקמה ובצע את השלבים הבאים כדי להשיג התייבשות דגימה אופטימלית.
- טבלו את ההידרוג'ל באתנול 70% למשך 90 דקות.
- מוציאים את האתנול 70% וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 80% למשך 90 דקות.
- מוציאים את 80% האתנול וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 95% למשך 90 דקות.
- מוציאים את האתנול 95% וטובלים את ההידרוג'ל באתנול 100% למשך 90 דקות פעמיים.
- מוציאים את האתנול 100% וטובלים את ההידרוג'ל בתמיסה של קסילן למשך 120 דקות פעמיים.
- הסר את תמיסת הקסילן והסתנן למקבילות הסטרומה המעובדות בשעוות פרפין למשך 120 דקות (~ 2 שעות) פעמיים.
- הטמע את המקבילות הסטרומה שהוחדרו לתוך בלוקי פרפין חתכים.
- בשלב זה, ניתן לחלק את המקבילות סטרומה כבלוקים פרפין באמצעות מיקרוטום ולעבד על פי טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרו-תבניות משטח
ניתן להשתמש במיקרו-תבניות של המטריצה החוץ תאית (ECM) כדי לשכפל את התצורה המרחבית של ממשק הקריפטה של המעי. ניתן לשנות את תצורת השבב הפתוח כדי לשלב חותמות מיקרו-תבניות שתוכננו במיוחד כדי לחקות את הטופוגרפיה הטבעית של ממשק אפיתל-סטרומה של המעי הגס (איור 6A,B) ואת קריפטות המעי בקנה מידה מיקרומטרי (איור 6C-E). שימו לב שהשתמשנו במשטח שטוח (לא מעוצב) עבור דגמי העור, דרכי הנשימה ונאדיות. החותמת שימשה במקרה זה לקבלת משטח הידרוג'ל אחיד לזרע תאי אפיתל. בחרנו בעיצוב שיכול לחקות את הארכיטקטורה הטבעית של רירית המעי האנושית, המורכבת לסירוגין של כיפות חיוביות ושליליות המחקות את קריפטות המעי.
מודלים של איברים
תרבינו והבחנו בין ארבעה אפיתלים שונים (עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי) באמצעות אב הטיפוס של השבב הפתוח כדי להוכיח את הרבגוניות של פלטפורמה ביומימטית זו. מקטעים היסטולוגיים של שבבי האיברים מאשרים את נוכחותם של תאי אפיתל שהם נבדלים פנוטיפית ומייצגים של: אפיתל מרובד במקרה של העור (איור 7), אפיתל עמודים מרובד מדומה במקרה של נתיב האוויר (איור 8 ווידאו משלים 1), אפיתל קשקשי פשוט במקרה של הנאדיות (איור 9), ואפיתל טורי פשוט במקרה של המעי (איור 10). תאי עור, דרכי נשימה ומכתשית התקבלו כולם מספקים זמינים מסחרית (כמפורט בטבלת החומרים).
איור 1: סכמה של השבב הפתוח והמבנה המיקרופלואידי שבו נעשה שימוש במחקר זה. (A-C) תצוגה עליונה, הקרנה שכבה אחר שכבה ועיבוד תלת-ממדי המציגים את עיצוב אב הטיפוס של שבב Open-Top הכולל את המכסה העליון הנשלף עם ערוץ מיקרו-פלואיד עטוף (כחול), שתי תעלות הריק החצי-ירחיות לצד תא התרבית (אפור), והתעלות המיקרו-פלואידיות האנדותל הספירליות התחתונות (מגנטה). (D) מחזיק שבבים בהתאמה אישית (המכונה גם "מערכת חווה") הכולל את מוביל בית השבב (חץ אדום), המשאבה הפריסטלטית ומאגרים (חץ צהוב) המסודרים בתצורה המתאימה לחממה משותפת לתרביות תאים. € מפעיל פנאומטי, המכשיר השולט על הלחץ השלילי המופעל על תעלת הריק של השבבים, המשמש ליצירת הכוח המכני המחזורי שתאים חווים במהלך נשימה או תנועה פריסטלטית (מתיחה). נתון זה הותאם באישור Varone et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקירה טכנית של פרוטוקול שבב העור הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולות להכנת שבב העור הפתוח ו-(B) מספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבית שבבי העור הפתוחים. בשלב הראשוני של הכנת השבב, תאים מזנכימליים (פיברובלסטים) מוטמעים בג'ל ומועמסים בשבב הפתוח ליצירת שכבת הסטרומה, המצופה במשך 2-4 שעות ונזרעת בתאי אפיתל. ברגע שתאי האפיתל יצרו חד-שכבה קומפקטית, הם נחשפים לאוויר (ALI). המערכת הביולוגית נשמרת תחת משטר ALI עד שהיא מוקרבת לניתוח ביום ה-14. ניתן ליישם מתיחה מכנית בזמן שהמערכת נמצאת תחת זרימה וב- ALI. המתיחה נשמרת עד שהרקמות מוקרבות לניתוח. מידע נוסף על הרכב מדיה, ריאגנטים ספציפיים וסוגי תאים ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סקירה טכנית של פרוטוקול שבב הנאדיות הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולות להכנת שבב הנאדיות הפתוח ו-(B) מספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבית שבב הנאדיות הפתוח. בשלב הראשוני של הכנת השבב, תאים מזנכימליים (פיברובלסטים) מוטמעים בג'ל ומועמסים בשבב הפתוח כדי ליצור את שכבת הסטרומה, המצופה במשך 2-4 שעות ונזרעת בתאי אפיתל של דרכי הנשימה בתווך בתוספת KIAD (ראה טבלה משלימה 2). מדיום בתוספת EGF נשמר במשך ~4 ימים לתמיכה בצמיחת תאי אפיתל. לאחר מכן האפיתל נחשף לאוויר (ALI) במשך ~10 ימים כדי להשיג הבשלה מלאה של הרקמות. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים נזרעים ביום ה-14, והמערכת הביולוגית נשמרת תחת משטר ALI וזרימה עד שהם מוקרבים לניתוח ביום ה-21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סקירה טכנית של פרוטוקול שבב נתיב האוויר הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולות להכנת שבב נתיב האוויר הפתוח ו-(B) מספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבות שבבי נתיבי האוויר הפתוחים. בשלב הראשוני של הכנת השבב, תאים מזנכימליים (פיברובלסטים ו/או תאי שריר חלק) מוטמעים בתוך הג'ל ומועמסים בשבב הפתוח ליצירת שכבת הסטרומה, המצופה במשך 2-4 שעות ונזרעת בתאי אפיתל בתווך בתוספת EGF (ראה טבלה משלימה 3). מדיום בתוספת EGF נשמר במשך ~4 ימים לתמיכה בצמיחת תאי אפיתל. לאחר מכן האפיתל נחשף לאוויר (ALI) במשך ~10 ימים כדי להשיג הבשלה מלאה של הרקמות. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים נזרעים ביום ה-14, והמערכת הביולוגית נשמרת תחת משטר ALI וזרימה עד שהם מוקרבים לניתוח ביום ה-21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סקירה טכנית של פרוטוקול שבב המעי הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולות להכנת שבב המעי הפתוח ו-(B) מספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבית שבב המעי הפתוח. בשלב הראשוני של הכנת השבב, תאים מזנכימליים (פיברובלסטים של המעי הגס) מוטבעים בג'ל ומועמסים בשבב הפתוח ליצירת שכבת הסטרומה, המצופה במשך 2-4 שעות ונזרעת בשברי קולונואידים אפיתליאליים המתקבלים מכריתות קליניות. מדיום תרבית תאים, כולל תוספי מזון (ROCK ו- CHIR, ראה טבלה משלימה 4) נדרש במהלך שלב הזריעה כדי לשמור על כדאיות תאי המעי הגס ומורפולוגיה פיזיולוגית. לאחר מכן משתמשים במדיות שונות כדי להניע את ההתרחבות (יום 1 עד 6) ואת ההתבגרות (יום 6 עד 9) של אפיתל המעי הגס. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המעי הגס נזרעים ביום 6 באמצעות מדיום תרבית תאי אנדותל (EGM2 MV), ולאחר מכן מתורבתים בתרבית עם מדיום הרחבת אפיתל למשך עד 10 ימים נוספים. האפיתל נחשף ל-ALI מהיום ה-10 כדי לקדם עוד יותר את הבשלת תאי האפיתל. מתיחה מכנית יכולה להיות מיושמת על המערכת מהיום ה-13 ונשמרת עד היום ה-16, כאשר מודל האיבר מוקרב לניתוח נקודות קצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הטבעה של מיקרו-דפוס. (A) התצוגה הצידית והעליונה של הבול המציגה מרקם בקנה מידה מיקרו (גובה 500 מיקרומטר ומערך עמודים ברוחב 250 מיקרומטר) משמשת לשחזור ממשק רקמת הקריפטה של המעי הגס ותצוגה עליונה וצידית של מכלול שבב הבול, המראה את התאמת שני האלמנטים כאשר נעשה בהם שימוש ליציקת משטח הג'ל. (B) תצוגה צדדית זוויתית המציגה את החותמת והשבב המשולבים. (ג-ה) תמונות של משטח הג'ל micropatterned עם ובלי תאים. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. נתון זה הותאם באישור Varone et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נתונים מייצגים שהתקבלו עם שבב העור הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולה להכנת שבב העור הפתוח ומספק את השלבים הביולוגיים העיקריים של תרבית שבבי העור הפתוחים. (B) PCNA Cytokeratin 14, Cytokeratin10, Involucrin ו-Fillagrin fluorescence staining ו-H&E המראים אפידרמיס מרובד רב-שכבתי בוגר ממוין על שבב. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) תמונת מבט עליונה של Skin-Chip (פסי קנה מידה: 5 מ"מ) וחתך H&E (פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר) המראה את נוכחות הפיברובלסטים בתוך שכבת העור. (D) PECAM-1, VE-Cadherin ו-Von Willebrand כתמים פלואורסצנטיים המראים התמיינות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים שעברו תרבית משותפת בשבב העור הפתוח. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (E) עיבוד קונספט תלת-ממדי מצויר של שבב העור הפתוח. נתון זה הותאם באישור Varone et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: נתונים מייצגים שהתקבלו באמצעות שבב נתיב האוויר הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולה להכנת שבב נתיב האוויר הפתוח ומספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבות שבב נתיבי האוויר הפתוחים. (B) MUC5AC (גביע), α ו-β-טובולין (תאים ריסניים), חלבון תאי קלרה 16 (תאי מועדון), p63 (תאי בסיס/אב) וכתמים פלואורסצנטיים ZO-1 המראים אפיתל בוגר של דרכי הנשימה. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C) וידאו/תמונה של ניגודיות פאזה המציגה נוכחות של ריסונים פועמים. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D) צביעת H&E (פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר) ותמונת TEM (פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר) המציגים אפיתל בוגר מרובד פסאודו-מרובד מובחן על שבב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: נתונים מייצגים שהתקבלו עם שבב הנאדיות הפתוח. (A) סכמטי המציג את רצף הפעולה להכנת שבב הנאדיות הפתוח ומספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבית שבב הנאדיות הפתוח. (B) סוג I (HTI-56, AT1-α), סוג II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, חומרים פעילי שטח (C) וצביעת פלואורסצנטיות E-Cadherin המראים נוכחות של פנאומוציטים בוגרים על שבב. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C) תמונת SEM ו-TEM המראה נוכחות של שלפוחיות מיקרוווילי וליזוזומליות עדות לפנוטיפ מכתשי בוגר. פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר. (D) חתך H&E (פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר) המאשר את נוכחותם של תאים שטוחים וקשקשיים התואמים לפנוטיפ מסוג I ולתאים קובואידים דמויי אבן מרוצפת הקוהרנטית עם פנוטיפ מסוג II, ו-(E) מראה את נוכחות הפיברובלסטים בתוך שכבת העור (פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר). (F) עיבוד קונספט מצויר תלת-ממדי של שבב הנאדיות הפתוח. נתון זה הותאם באישור Varone et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: נתונים מייצגים שהתקבלו עם שבב המעי הפתוח. (A) סכמטי המראה את רצף הפעולה להכנת שבב המעי הפתוח ומספק את השלב הביולוגי העיקרי של תרבית שבב המעי הפתוח. (B) מבט רוחבי זוויתי המציג את מכלול הבול והשבב בשלב יציקת הג'ל, הרעיון המצויר של ג'ל מיקרו-דפוס ותמונות ניגודיות פאזה של מבנה דמוי קריפטה המיוצר במיקרו-תבנית על משטח הג'ל ונזרע עם קולונואידים בשני גבהים שונים. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) Mucin 2 ו- E-Cadherin צביעה פלואורסצנטית המראה נוכחות של enterocytes ותאי גביע בוגרים על שבב. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. (D) חתך H&E של מבנה דמוי קריפטה המראה את נוכחות הפיברובלסטים בתוך שכבת העור ומאשר את נוכחותו של אפיתל עמודתי פשוט. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון משלים 1: סרטון ניגודיות שלב המציג מכות ריסונים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 1: הרכבת שבבים עם גג פתוח. (A) סכמטי המציג את העיבוד התלת-ממדי של מכלול השבב הפתוח ואת העיבוד המצויר של שבב העור הפתוח עם התאים הביולוגיים השונים מודגשים וכוללים אפיתל (כחול), עורי (צהוב) וכלי דם (אדום). (B) המצע המיקרופלואידי המורכב הוא בפורמט 35 מ"מ x 17 מ"מ, שטח תרבית רקמה של 0.32 ס"מ2, תעלה מיקרופלואידית ספירלית תחתונה ומכסה תא עם תעלה מיקרופלואידית. (C) הפלטפורמה מורכבת מתא בעל דופן זוויתית של 5 מעלות, בקוטר של 6 מ"מ בגובה הממברנה ו-5.7 מ"מ בראש דופן תא PDMS וגובה ורוחב של 4 מ"מ. עובי הקרום הנקבובי 50 מיקרומטר והנקבוביות בקוטר 7 מיקרומטר. (D) לתעלה המיקרופלואידית התחתונה בצורת ספירלה יש מידות חתך של 400 מיקרומטר (גובה) x 600 מיקרומטר (רוחב). (E) סקירה כללית של ציר הזמן של הניסוי והשלבים הדרושים להכנת שבב האיברים הפתוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: עור. הטבלה מספקת סיכום של השלבים היומיים העיקריים ופרמטרי המתיחה והזרימה המשמשים במהלך שלושת השלבים של תרבות שבב העור הפתוח (צמיחה, שגשוג ובידול). הטבלה מספקת גם את רשימת החומרים, הניסוחים המדיום והוראות כיצד להכין את המדיה הדרושה לפרוטוקול זה. הרכב שלושת המדיות מותאם לשלבים השונים של הפרוטוקול. באופן ספציפי, Medium I מותאם לשלב הזריעה ותרבית הקרטינוציטים המוקדמת. מדיום II מותאם להתרבות והתמיינות מוקדמת (היווצרות אפיתל מרובד). מדיום ALI מותאם לשמירה על קרטינוציטים בממשק אוויר-נוזל עד ליצירת אפידרמיס ממוין במלואו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 2: Alveolus. הטבלה מספקת סיכום של השלבים היומיים העיקריים ופרמטרי המתיחה והזרימה המשמשים במהלך שלושת השלבים של תרבית שבב הנאדיות הפתוח (צמיחה, התפשטות ובידול). הטבלה מספקת גם את רשימת החומרים, הניסוחים המדיום והוראות כיצד להכין את המדיה הדרושה לפרוטוקול זה. הרכב שני המדיות מותאם לשלבים השונים של הפרוטוקול. שים לב כי תוספת של תוספי (KIAD) למדיום תרבית התאים הוא קריטי כדי להשיג התמיינות אופטימלית של pneumocytes. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 3: נתיב אוויר. הטבלה מספקת סיכום של השלבים היומיים העיקריים ופרמטרי המתיחה והזרימה המשמשים במהלך שלושת השלבים של תרבות שבבי נתיבי האוויר הפתוחים (צמיחה, התפשטות ובידול). הטבלה מספקת גם את רשימת החומרים, ניסוח המדיום והוראות כיצד להכין את המדיום הדרוש לפרוטוקול זה. הרכב המדיום מותאם לשמירה על תאי דרכי הנשימה בממשק האוויר-נוזל, אשר, בתורו, גורם התמיינות מסוף ומגרה את הייצור של ריר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 4: מעי. הטבלה מספקת סיכום של השלבים היומיים העיקריים ופרמטרי המתיחה והזרימה המשמשים במהלך שלושת השלבים של תרבית שבבי המעי הפתוחים (גדילה, שגשוג והתמיינות). הטבלה מספקת גם את רשימת החומרים, הניסוחים המדיום והוראות כיצד להכין את המדיה הדרושה לפרוטוקול זה. הרכבי שתי המדיות מותאמים לשלבים השונים של הפרוטוקול. באופן ספציפי, מדיום ההתפשטות בתוספת מעכבי CHIR ו- ROCK מותאם לזריעה ולשלב המוקדם של התרבית מכיוון שהוא מקדם את ההישרדות והצמיחה של מקטע אורגנואיד המעי הגס כשכבה חד-שכבתית. מדיום ההתפשטות מותאם לשגשוג והתמיינות מוקדמת של אפיתל חד-שכבתי. מדיום ההתמיינות מותאם להתמיינות טרמינלית של חד-שכבת אפיתל לפני חשיפה לממשק אוויר-נוזל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השבב הפתוח מהווה פלטפורמה המאפשרת לחקור את יחסי הגומלין התאיים המורכבים המתרחשים בין אנדותל, סטרומה ואפיתל במיקרו-סביבה מבוקרת, בזמן אמת. טכנולוגיה זו מציעה יתרונות קריטיים על פני תרביות אורגנוטיפיות ואורגנואידים קונבנציונליות, כגון שילוב של רמזים פיזיקליים וביוכימיים הרלוונטיים לשחזור המיקרו-סביבה של הרקמה האנושית, כולל גזירה נוזלית (זרימה), מתיחה מחזורית ושחזור טופוגרפיית פני השטח האפיתל המושגת באמצעות מיקרו-דפוסים. תאים אנושיים הגדלים בתוך פלטפורמה זו פועלים בסינרגיה כדי לשחזר תפקודים ספציפיים לרקמות שניתן לנתח באמצעות טכניקות קונבנציונליות, כולל היסטוכימיה חיסונית ובדיקות ביוכימיות באמצעות נוזלי הזרימה (או הקולחים) מהתאים העליונים ו / או התחתונים. העיצוב הנוכחי מאפשר גישה קלה לשכבת האפיתל, שבה תאים גדלים במגע ישיר עם פיברובלסטים ספציפיים לרקמות ותאי סטרומה אחרים, המחקים את הארכיטקטורה הרב-תאית של רקמות אפיתל. יש לציין כי אב הטיפוס של השבב הפתוח מציע פתרון בר-קיימא לאתגרים נפוצים הקשורים לשימוש בפלטפורמות איבר-על-שבב אחרות. בעוד שהוא מאפשר שילוב של מספר סוגי תאים שונים בתוך תא סטרומה המוביל ליצירת רקמות תלת-ממדיות מורכבות מאוד, הוא גם מאפשר חילוץ קל של מבני הרקמה המבוססים ממכשיר השבב לצורך ניתוח במורד הזרם, כולל צביעת H&E קונבנציונלית.
העיצוב הנוכחי מציג כמה מגבלות. לדוגמה, הקרום האלסטי המשולב בין המיקרו-ערוץ של כלי הדם לבין תא הסטרומה (הידרוג'ל) של אב הטיפוס של שבב Open-Top עבה במידה ניכרת (≈ 50 מיקרומטר לעומת ≈ 1 מיקרומטר) מאשר החלל הבין-תאי המפריד בין רקמות אנדותל לסטרומה באיברים האנושיים המקומיים. למרות שהקרום האלסטי אינו מהווה מחסום פיזי לדיפוזיה של מולקולות גדולות, כגון הורמונים וגורמים פרקריניים אחרים המתווכים את האינטראקציה הבין-תאית בין הרקמות, הוא עשוי להגביל את האינטראקציות הישירות, בין התא לתאים ואת נדידת התאים מכלי הדם לתא הסטרומה. לבסוף, אב הטיפוס של שבב Open-Top עשוי PDMS, אשר ידוע לספוג מספר עצום של תרכובות הידרופוביות. מגבלה זו משותפת לפלטפורמות רבות מבוססות PDMS שיכולות להוות מכשול רציני ביישומים המיועדים לבדיקת הפרמקודינמיקה והפרמקוקינטיקה של תרכובות טיפוליות קטנות27.
אחד האתגרים העיקריים בשילוב הידרוג'לים תלת-ממדיים במכשיר מיקרופלואידי כגון השבב הפתוח, הוא שה-PDMS אינו מספק מצע אופטימלי לקשירת חלבונים או תאים אנושיים. לפיכך, פונקציונליות כימית של משטח PDMS היא שלב קריטי אחד בפרוטוקול זה הנדרש כדי להבטיח ציפוי ECM תקין והדבקת הידרוג'ל לתא הג'ל של דגם השבב הפתוח. כדי להשיג תוצאות מיטביות, סוכן הקרוסלינקינג בתמיסת ER1 חייב תמיד להיות מוגן מפני חשיפה ישירה לאור. אינדיקטור חשוב למצב תגובתי של crosslinker הוא הצבע שלה. למעשה, הקרוסלינקר ב-ER1 עובר שינוי צבע מכתום מבריק לחום כהה כאשר הוא מתחמצן. מעבר הצבע יכול לשמש כאינדיקטור לאחר שלב הפעלת UV כדי לבדוק אם הפתרון הגיב ביעילות עם משטח PDMS. במהלך הכנת תמיסת הקרוסלינקר יש לעקוב אחר מעבר הצבע כדי לוודא שחשיפה מקרית לאור ישיר אינה מלבינה את התרכובת הכימית בתמיסה. כדי להגן על תמיסת הקרוסלינקר ולהימנע מהלבנה לא רצויה, אנו ממליצים לעטוף רדיד אלומיניום, בגודל של כ-15X15 ס"מ, סביב צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל או להשתמש בצינור ענבר הזמין בשוק. השימוש ב- ER1 מאפשר שיטה פשוטה ויעילה להשגת תפקוד מהיר של משטחי PDMS; עם זאת, ישנן מולקולות אחרות שניתן להשתמש בהן במקום ER1. לדוגמה, הקרוסלינקרים הכימיים 3-aminopropyl-trimethoxysilane (APTMES) אינם רגישים לאור כמו ER1 וניתן להשתמש בהם כדי להשיג תוצאות דומות בכמה צעדים נוספים כפי שתיארנו בעבר במקום אחר28,29. ללא תלות במולקולה הנבחרת, אחד האילוצים העיקריים בעבודה עם קרוסלינקר כימי הוא נוכחות של שאריות שאריות, אשר יכול לגרום ציטוטוקסיות. לאחר תגובת ההפעלה, חשוב לשטוף את המשטחים המיקרופלואידים בכמויות גדולות של תמיסת כביסה.
מכיוון שבועות אוויר נוטות להיווצר ולגדול בתוך הממשקים ההידרופוביים של השבבים, הצינורות והמחברים, חשוב להעריך אם הנתיב המיקרופלואידי נקי מבועות אוויר לפני תחילת זרימת הנוזל. בועות אכן יכולות לשבש את הזרימה ואפילו להרוג את התאים כאשר שבבים מחוברים לזרימה. הכנה של הרכיבים המיקרופלואידים לפני תחילת זרימת הנוזלים תפחית את הסיכון ליצירת בועות אוויר ותסייע להשיג תוצאות אופטימליות וניתנות לשחזור. אם מחזור הפריימינג המתואר בפרוטוקול זה לא היה מספיק, שטיפת הצינורות המיקרופלואידים באתנול (5 דקות), ולאחר מכן ב- HBSS (20 דקות) תפחית עוד יותר את הסיכון ליצירת בועות אוויר בתוך המחברים הזורמים.
למרות מגבלותיו, PDMS הוא בעל שילוב נדיר של תכונות כימיות שאיפשר ייצור של התקנים מיקרופלואידים תואמים ביולוגית, שקופים ואלסטיים ביותר. כל התכונות הללו הפכו את PDMS לחומר המיושם הרחב ביותר לבניית דגמי Organ-on-Chip בעשור האחרון. ההתקדמות האחרונה בתחומי מדעי החומרים וההנדסה הכימית30,31 מציעה כי רכיב PDMS של פלטפורמה זו עשוי להיות מוחלף בעתיד הקרוב עם פולימרים סינתטיים חדשים או ביו-חומרים. אם יושג בהצלחה, הוא יוכל לאפשר שחזור של תכונות ספציפיות לרקמות, כולל נקבוביות, הרכב ECM של החלל הבין-תאי המספק חיקוי קרוב יותר לרקמות טבעיות אנושיות, ומודלים מתקדמים יותר למחקרי פרמקולוגיה. אנו צופים כי האבולוציה העתידית של עיצוב השבב הפתוח תאפשר מידול של רקמות ואיברים אנושיים ברמת פירוט חסרת תקדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים/יחסים האישיים הבאים, אשר עשויים להיחשב כאינטרסים מתחרים פוטנציאליים: Varone Antonio הוא עובד לשעבר של Emulate Inc. ועשוי להחזיק במניות ב-Emulate.
Acknowledgments
ללא
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
