Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

עיבוד תאי גזע מזנכימליים אנושיים ליישומים קליניים באמצעות זרימת עבודה סגורה חצי אוטומטית

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64707
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 1
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקצירת תאים דבקים מצלוחיות רב-שכבתיות באופן סגור חצי אוטומטי באמצעות מערכת צנטריפוגות נגד הזרמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור קצירת תאים דבקים ותרחיפים מפלטפורמות הרחבת תאים אחרות עם שינויים מעטים בשלבים הקיימים.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) נחקרים כיום כשיטת טיפול מבטיחה מבוססת תאים למחלות שונות, עם אישורי שוק נוספים לשימוש קליני צפויים בשנים הקרובות. כדי להקל על מעבר זה, טיפול בצווארי בקבוק של קנה מידה, יכולת שחזור מלוט למגרש, עלות, תאימות לתקנות ובקרת איכות הוא קריטי. ניתן להתמודד עם אתגרים אלה על ידי סגירת התהליך ואימוץ פלטפורמות ייצור אוטומטיות. במחקר זה פיתחנו תהליך סגור ואוטומטי למחצה להעברה ולקציר של hMSCs שמקורם בג'לי של וורטון (WJ-hMSCs) מצלוחיות רב-שכבתיות באמצעות צנטריפוגות נגד הזרם. ה-WJ-hMSCs הורחבו באמצעות תווך תואם רגולציה ללא קסנו-נטול קסנו (SFM XF), והם הראו התפשטות תאים דומה (הכפלת אוכלוסייה) ומורפולוגיה ל-WJ-hMSCs שהורחבו במדיה קלאסית המכילה סרום. פרוטוקול הקציר הסגור והחצי-אוטומטי שלנו הוכיח התאוששות תאים גבוהה (~98%) וכדאיות (~99%). התאים שנשטפו ורוכזו באמצעות צנטריפוגה נגד זרימה שמרו על ביטוי סמן פני השטח WJ-hMSC, יחידות יוצרות מושבה (CFU-F), פוטנציאל התמיינות טרי-שושלת ופרופילי הפרשת ציטוקינים. פרוטוקול קצירת התאים החצי-אוטומטי שפותח במחקר יכול להיות מיושם בקלות לעיבוד בקנה מידה קטן עד בינוני של תאים דבקים ותרחיפים שונים על ידי חיבור ישיר לפלטפורמות הרחבת תאים שונות כדי לבצע הפחתת נפח, שטיפה וקציר עם נפח פלט נמוך.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) הם מועמדים מצוינים ליישומים קליניים, הן בהנדסת רקמות והן בטיפולים תאיים, בהתחשב בפוטנציאל הטיפולי שלהם ובפוטנציאל ההתחדשות העצמית הגבוה שלהם לגדול במבחנה, שהם קריטיים ליצירת מינונים רלוונטיים קלינית של תאים 1,2,3. על פי ClinicalTrials.gov, ישנם מעל 1,000 ניסויים קליניים הנמצאים כעת תחת חקירה עבור מצבי מחלה שונים4. על רקע העניין הגובר בשימוש ב-hMSCs, ניסויים קליניים נוספים ואישורי שוק צפויים בעתיד הקרוב 5,6. עם זאת, לייצור hMSCs יש אתגרים מובנים רבים במונחים של השתנות אצווה לאצווה, שימוש בחומרי גלם בסיכון גבוה, חששות לגבי זיהום עקב תהליכים פתוחים וידניים רבים, שכן הייצור כרוך בפעולות מרובות יחידות, עלויות עבודה גבוהות יותר, עלות הרחבה או הרחבה, ומכשולים רגולטוריים 6,7,8,9,10, 11,12. נושאים אלה נותרו חסם משמעותי לגישה לשוק הנוכחי והעתידי.

פיתוח פתרונות ייצור סגורים, מודולריים ואוטומטיים ושימוש בריאגנטים נלווים בסיכון נמוך יתמודדו עם אתגרים אלה. זה גם יבטיח איכות מוצר עקבית, יפחית את הסבירות לכשלי אצווה עקב טעויות אנוש, יפחית את עלויות העבודה וישפר את סטנדרטיזציה של תהליכים ותאימות לתקנות, כגון במונחים של שמירת רשומות אצווה דיגיטלית 8,12,13,14. כדי להיות מסוגל להשיג מינון רלוונטי מבחינה קלינית של תאים, בין אם זה אוטולוגי או אלוגני, ייצור יעיל הכולל הרחבת תאים במעלה הזרם ועיבוד במורד הזרם באופן סגור ואוטומטי הוא חיוני.

עבור הרחבת hMSC במעלה הזרם, שתי שיטות הייצור הנפוצות ביותר המשמשות כיום הן scale-out (monolayer דו-ממדי) ו-scale-up (מערכת מתלים תלת-ממדית מבוססת מיקרו-מוביל)15,16,17,18. השיטה המסורתית והנפוצה ביותר להרחבת hMSC היא תרבות דו-ממדית חד-שכבתית בשל עלות הייצור הנמוכה וקלות ההתקנה19.

צלוחיות רב-שכבתיות המורכבות ממגשי משטח שטוחים המוערמים בתוך כלי תרבית משמשות בדרך כלל להרחבת ייצור hMSC. מערכות אלה מגיעות בדרך כלל בכלי תרבית של שכבה אחת עד 40 שכבות20 ומטופלות ידנית בתוך ארונות בטיחות ביולוגית. שלבי העיבוד במהלך העברת התאים וקצירתם כוללים ניפוק ידני וניקוי של מדיית ההתפשטות, מגיב דיסוציאציה וחיץ שטיפה על ידי פיפטינג או הטיה פיזית של הכלי כולו. חוץ מזה, הטיפול ביחידות מרובות הוא מאתגר וגוזל זמן בשל גודלן ומשקלן העצום.

לאחר הקציר, לאחר הקציר מצלוחיות רב-שכבתיות, צנטריפוגה להחלפת מדיה, שטיפת תאים והפחתת נפח הם שלבים חיוניים בכל תהליך הייצור של התא21. צנטריפוגה קונבנציונלית היא תהליך פתוח וידני ברובו הכולל מספר רב של שלבים, כגון העברת מתלה התא לצינורות מכוסים או בקבוקים בתוך ארון בטיחות ביולוגית, סיבוב התאים, שאיפה ידנית של הסופר-נטנט, מתלה תאים עם החיץ ושטיפות תאים חוזרות ונשנות. זה מגדיל באופן דרמטי הן את הסיכון לזיהום עקב פתיחה וסגירה של הפקקים והן את הסיכוי לאבד את כדורית התא במהלך תהליך השאיפה / צנרת ידנית22. בהקשר של טיפול במערכות תרבית רב-שכבתיות עבור תאים מבוססי דבק כגון hMSCs, המפעיל יצטרך לעבור תהליך מייגע של מעבר בין הצנטריפוגה לארון הבטיחות הביולוגית שוב ושוב וטיפול ביחידה כבדה בו זמנית. צעדים ידניים אלה מייגעים, מהווים סיכונים במונחים של טעויות אנוש וזיהום, ויש לבצע אותם בסביבת חדר נקי Class B, שהיא יקרה23. בנוסף, תהליך הצנטריפוגה הידנית הקונבנציונלית אינו ניתן להרחבה ועלול לגרום לגזירה וללחץ תאי; לפיכך, מקסום התאוששות התא, הכדאיות ויעילות השטיפה של זיהומים שיוריים הם אתגרים מרכזיים אחרים22. ייצור מסחרי בקנה מידה cGMP של טיפולים תאיים דורש פתרונות אוטומציה סגורים ומודולריים כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להבטיח איכות מוצר עקבית, להפחית את עלויות העבודה והייצור ולהגדיל את אמינות התהליך24,25. ניתן לטפל בצלוחיות רב-שכבתיות כמערכת סגורה על ידי מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר באחת היציאות כדי להקל על חילופי גזים סטריליים ויציאה שנייה המחוברת באופן אספטי באמצעות מחברים או מרותכת בצינור ישירות למכשיר עיבוד תאים אוטומטי לקצירת תאים. עבדנו לקראת סגירה ואוטומציה של רוב השלבים של המעבר והקציר של WJ-hMSC על ידי הערכת צנטריפוגה חדשנית של זרימה נגדית סגורה המיועדת לייצור מוצרים מבוססי תאים, גנים או רקמות. לצנטריפוגה זו של זרימה נגדית יש גם את הגמישות לבצע מגוון יישומי עיבוד תאים, כגון הפרדת תאים על בסיס גודל, חילופי בינוני/חיץ, ריכוז וקציר עבור מגוון סוגי תאים 8,26,27,28. המכשיר משתמש בערכה חד-פעמית סגורה הניתנת לחיבור סטרילי באמצעות ריתוך צינור או מחברים אספטיים להעברת שקיות או שניתן לחבר אותה ישירות לכל פלטפורמת הרחבה לפי בחירתו.

במחקר זה תכננו מכלול צינורות מותאם אישית שיאפשר חיבורים סטריליים סגורים בין ערכת הצנטריפוגה החד-פעמית נגד הזרימה לבין הצלוחית הרב-שכבתית. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לניתוק, שטיפה וקציר אנזימטיים של WJ-MSCs מהבקבוק הרב-שכבתי באופן סגור לחלוטין ואוטומטי למחצה בהפעלה אחת. ה-WJ-hMSCs שנקטפו אופיינו בטוהר (ניתוח סמנים על פני השטח) ובעוצמה (CFU-F, התמיינות תלת-שושלת ופרופילי הפרשת ציטוקינים) כדי להבטיח שהמוצר הסופי עומד בתכונות האיכות הקריטיות (CQAs) לשחרור לוט.

Protocol

1. הכנת אמצעי התרבות וציפוי כלי התרבות

  1. הכנת מדיה
    1. הרכב המדיום הקלאסי המכיל סרום: הכינו את המדיום הקלאסי המכיל סרום על ידי ערבוב αMEM (445 מ"ל), סרום בקר עוברי (FBS) (50 מ"ל) ו-100x פניצילין-סטרפטומיצין (5 מ"ל).
    2. הכן את מדיום SFM XF המלא.
      1. הכינו בקבוק של 500 מ"ל על ידי הוספה אספטית של 5 מ"ל תוסף SFM XF (100x), ו-5 מ"ל של 100x L-alanyl-L-גלוטמין (ראו טבלאות חומרים) למדיום הבסיסי SFM XF (500 מ"ל).
      2. הכינו שקית מדיה בנפח 2 ליטר על ידי הוספה אספטית של 20 מ"ל תוסף MSC SFM XF מותאם אישית (100x) ו-20 מ"ל של 100x L-alanyl-L-גלוטמין (ראו טבלאות חומרים) לשקית הבינונית הבסיסית SFM XF (2 L) על ידי חיבור מזרק 50 מ"ל ליציאה המתאימה של השקית.
        הערה: לפני השימוש בתרבית, יש להוסיף גורמי גדילה או ציטוקינים (שאינם מסופקים עם המדיום) למדיום SF XF המלא: PDGF-BB (20 ננוגרם/מ"ל), FGF בסיסי (4 ננוגרם/מ"ל) ו-TGFβ (0.5 ננוגרם/מ"ל).
  2. ציפוי כלי תרבית התאים בויטרונקטין לשימוש במדיה נטולת סרום
    1. הפשירו מלאי של ויטרונקטין (VTN-N; 0.9 מ"ג/מ"ל) ב-4°C.
    2. השתמש במי מלח חוצצים סטריליים של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (DPBS) כדי לדלל את VTN-N המופשר לריכוז עבודה של 5 מיקרוגרם/מ"ל.
      הערה: יש לדלל את VTN-N מיד לפני השימוש ואין לאחסן את תמיסת הוויטרונקטין המדוללת.
    3. הוסף 1 מ"ל / 10 ס"מ2 של פתרון VTN-N מדולל לכלי התרבות המתאים; הריכוז הסופי הוא 0.5 מק"ג/ס"מ2. לדוגמה, להוסיף 7.5 מ"ל של פתרון VTN-N מדולל לבקבוק T-75 (75 ס"מ2); הוסף 17.5 מ"ל של פתרון VTN-N מדולל לבקבוק T-175 (175 ס"מ2); להוסיף 250 מ"ל של פתרון VTN-N מדולל לבקבוק רב-שכבתי סטנדרטי בעל ארבע שכבות (2,528 ס"מ2); ולהוסיף 630 מ"ל של תמיסת VTN-N מדוללת לבקבוק רב שכבתי בן 10 שכבות (6,320 ס"מ2).
    4. בתנאים סטריליים, לדגור על הכלים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: ניתן לאחסן את כלי התרבית המצופה ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. עטפו את כלי התרבית בסרט מעבדה כדי למנוע ממנו להתייבש. לפני השימוש, חממו מראש את כלי התרבית לטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
    5. שאפו את תמיסת VTN-N, השליכו והוסיפו מיד נפח מספיק של מדיום תרבית כדי למנוע התייבשות משטח הכלי המצופים.
      הערה: אין צורך לשטוף את כלי התרבית לאחר הסרת VTN-N.

2. הרחבת WJ-hMSC

  1. הפשיר WJ-hMSCs (p2) במהירות על ידי הצבת cryovial באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; מערבלים באיטיות את הבקבוקון עד שתכולתו מתחילה להפשיר.
  2. עם ההפשרה, זרעו את WJ-hMSCs ב-5,000 תאים/ס"מ2 בבקבוק T-175 (ללא ציפוי VTN-N), ודגרו בתווך הקלאסי המכיל סרום בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה של 5%CO2 לצורך הרחבת תאים. לאחר שני מעברים (עמ' 4), שמרו את התאים המורחבים במדיום השימור הקריוגני הרצוי כבנק תאים עובדים (WCB).
  3. בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם לשיטת הכדאיות וספירת התאים כדי לקבוע את ספירת התאים הכוללת, כדאיות התא וגודל התא29.
  4. מ-p4, תרבית את WJ-hMSCs ב-5,000 תאים/ס"מ2 בצלוחיות T-75 בתווך קלאסי המכיל סרום או בתווך SFM XF (השתמש בצלוחיות מצופות VTN-N עם מדיום SFM XF).
  5. לשמור על התאים בשתי מדיות התרבית במשך שלושה מעברים בסך הכל (12 ימים), ולמדוד את התפשטות התא (הגדלת הקיפול) בכל מעבר על ידי חלוקת מספר התאים בני קיימא שנספרו בסוף התרבית של כל מעבר במספר התאים בני קיימא בתחילת התרבית (יום זריעת התא).

3. הרחבת קנה המידה של רכבת זרעים

  1. הרחבת WJ-hMSC בבקבוק T-175
    1. הפשיר את WJ-hMSCs ב p4 במהירות על ידי הצבת cryovial באמבט מים 37 ° C; מערבלים באיטיות את הבקבוקון עד שהתמיסה מתחילה להפשיר.
    2. זרעו 5,000 תאים/ס"מ2 לתוך צלוחיות T-175 מצופות VTN-N. אפשר לתאים לגדול באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
    3. החלף את מדיום התרבית המשומש כל 2-3 ימים בתווך SFM XF מלא שחומם מראש לביצועים מיטביים ולצמיחת תאים.
  2. טיפול בצלוחיות הרב-שכבתיות (איור 1A, B)
    1. כל הקשרים האספטיים צריכים להיעשות בסביבה סטרילית.
    2. פרקו את הבקבוק הרב-שכבתי בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
    3. חבר את מסנן האוויר המעוקר מראש (0.2 מיקרומטר) ליציאה אחת כדי לאפשר שחרור לחץ במהלך העברת הנוזל באמצעות צנטריפוגת הזרימה הנגדית.
    4. הכנס את מחבר הבקבוק הרב-שכבתי ממערכת הצינורות המותאמת אישית ליציאה השנייה (איור 1B).
    5. רתכו את קו ה-PVC של הצינור המותאם אישית לשקית העברת PVC בנפח 2 ליטר המכילה מדיום SFM XF מלא.
      הערה: ערבבו את השקית הבינונית לחלוטין לפני הוספתה למערכת הרב-שכבתית באמצעות זרימת כוח הכבידה. ודא ששקית העברת PVC תלויה גבוה יותר מהצלוחית הרב-שכבתית.
    6. הניחו את הבקבוק הרב-שכבתי על צדו הארוך, עם מסנן האוויר בחלק העליון (איור 1B).
    7. פתח את המהדק על צינורות ה- PVC כדי להתחיל למלא את הבקבוק הרב-שכבתי. ודא שהמדיום ישר בין המגשים במהלך המילוי.
    8. לאחר שהמדיום התיישר במלואו בכל המגשים, הפכו את הבקבוק הרב-שכבתי על צדו הקצר כשהיציאות זקופות.
    9. סגור את המהדק בקו ה-PVC והסר את שקית ההעברה על-ידי החלפת חיבור הצינור במכסה הסגירה הכחול MPC.
      הערה: אין להסיר את מסנן האוויר, מכיוון שהדבר מאפשר חילוף גזים במהלך התפשטות התא.
    10. הופכים את הבקבוק הרב שכבתי למצב הדגירה.
      הערה: המסנן וחיבור הצינור צריכים להיות פונים כלפי מעלה.
    11. רוקנו את הבקבוק הרב-שכבתי על ידי חיבורו לבקבוק אספירטור; הניחו אותו מעל בקבוק השואב, והנוזל יזרום החוצה.
      הערה: הטה את הבקבוק הרב-שכבתי על צדו כדי לנקז לחלוטין את התווך המשומש על ידי כוח הכבידה. לחלופין, ניתן לשפוך את המדיום המשומש לבקבוק פסולת באמצעות מכלול צינורות בהתאמה אישית.
    12. חזור על שלבים 3.2.5-3.2.11 כדי לחדש את המדיום הטרי.
  3. תת-תרבות של WJ-hMSCs בבקבוק הרב-שכבתי (T-175 > 4-שכבות >-10 שכבות)
    1. מגיב דיסוציאציה תאים טרום חם (TrypLE) ומדיום SFM XF מלא בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. לשאוף את המדיום בילה מן בקבוק T-175 ולהשליך.
    3. שטפו את שכבת התא עם DPBS שחומם מראש, שאפו והשליכו.
    4. הוסיפו TrypLE לכל צלוחיות, הבטיחו כיסוי מלא של חד-שכבת התא ודגרו במשך 5-10 דקות בטמפרטורה של 37°C.
    5. מעבירים את המתלה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את הצינור ב 100-200 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף ולהשליך את DPBS, ולהיזהר לא להפריע את גלולת התא.
    7. השהה מחדש את גלולת התא בנפח מינימלי (10 מ"ל) של מדיום SFM XF מלא טרום חימום לספירת תאים.
    8. מלא כלי תרבית ארבע שכבתי מצופה VTN-N בכ- 800 מ"ל של תווך SFM XF מלא, כאמור בסעיף 2 לעיל. הוסף 5,000 תאים/ס"מ2 (כלומר, 1.26 x 107 תאים קיימא/בקבוק). סובבו בעדינות את מתלה התא כדי להבטיח פיזור אחיד.
    9. דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באטמוספירה לחה.
    10. החלף את מדיום התרבית המשומש כל 2-3 ימים בתווך SFM XF מלא טרי שחומם מראש לצמיחת תאים אופטימלית עד שהתאים מגיעים למפגש של 60%-80% או מוכנים לתרבית תת-רב-שכבתית לצלוחית רב-שכבתית בת 10 שכבות.
    11. מלאו בקבוק רב-שכבתי בציפוי VTN-N בן 10 שכבות בכ-2 ליטר של מדיום SFM XF מלא, כאמור בסעיף 2. הוסף 5,000 תאים/ס"מ2 (כלומר, 3.1 x 107 תאים/בקבוק). סובבו בעדינות את מתלה התא כדי להבטיח פיזור אחיד.
    12. דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באטמוספירה לחה.
    13. החלף את מדיום התרבית המשומש כל 2-3 ימים בתווך SFM XF מלא טרי שחומם מראש לצמיחת תאים אופטימלית עד שהתאים מגיעים למפגש של 60%-80% או מוכנים לקציר.

4. דיסוציאציה וקציר סגורים חצי אוטומטיים של WJ-hMSC באמצעות צנטריפוגה סגורה של זרימה נגדית

  1. הרכבת ערכת צנטריפוגה חד-פעמית נגד זרימה
    1. חברו את הערכה החד-פעמית לשקיות ההעברה החד-פעמיות באמצעות ריתוך צינורות, בדומה לתצורה המוצגת באיור 1A.
      הערה: קצב הזרימה המוגדר כברירת מחדל של הערכה לשימוש חד-פעמי הוא 30-165 מ"ל/דקה.
    2. חבר בקבוק רב-שכבתי בן 10 שכבות המכיל WJ-hMSCs מתלכדים למכלול צינורות מותאם אישית בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    3. העבירו את כלי התרבית בן 10 השכבות המחובר עם מכלול הצינורות המותאם אישית לספסל, ורתכו לקו E (3/32 ב-ID PVC) של הערכה החד-פעמית, כפי שמוצג באיור 1B.
    4. הקפידו לרתך יציאת דגימה סטרילית לקו G של הערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה.
    5. לאחר מכן, חבר את קו הקציר H ללואר סטרילי המצויד מזרק 50 מ"ל.
      הערה: בכל השלבים לעיל, ודא שהמלחציים הידניים סגורים כדי לאבטח את הנוזלים בכל שקית ערכה.
  2. הגדרת הפעלת המכשיר
    1. הפעל את המכשיר " ON" על ידי הפעלת מתג המתג בחלק האחורי של המכשיר.
    2. חבר את המחשב הנייד ליציאת USB-C במכשיר באמצעות כבל USB-C שסופק (איור 1B).
    3. הפעל את תוכנת ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של צנטריפוגת זרימה נגדית משולחן העבודה או מתפריט ההתחלה.
    4. לאחר הכניסה, טען את הפרוטוקול על ידי לחיצה על הלחצן בחר פרוטוקול בדף הפתיחה הראשי.
      הערה: פרוטוקול קצירת הצנטריפוגות בזרימה נגדית (טבלה 1) נוצר באמצעות התוכנה Protocol Builder ואוחסן באופן מקומי.
    5. לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית.
    6. טען את הערכה החד-פעמית שהורכבה על מערכת הצנטריפוגות נגד הזרם.
    7. התחילו בתליית השקיות התלויות על ווי קולב בסדר שמיישר אותן בצורה הטובה ביותר עם יציאות הצינור ברצועות חיישן הבועות, כאשר הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות ממוקם בזווית, כפי שמוצג באיור 1B.
    8. יישרו את הערכה עם שני כפתורי המיקום של הערכה, מתחו את צינורות המשאבה סביב המשאבה הפריסטלטית ולחצו על המחבר בצורת נורה לבנה למקומו.
      הערה: ודא שהצינור מעל חיישן הלחץ ממוקם כראוי במסלול הצינורות.
    9. חבר את תא הצנטריפוגה על ידי הרמת ידית הכסף של מוביל תא הצנטריפוגות נגד הזרימה ואבטחתו על ידי החזרת הידית למקומה הזקוף.
    10. לחץ על הצינור מכל יציאה בערכה לתוך המסילות לאורך רצועות חיישן הבועות.
      הערה: ודא שהשקיות אינן סבוכות כדי שניתן יהיה לעקוב בקלות אחר תהליך הפרוטוקול.
    11. סגור את הדלת על ידי לחיצה כלפי מטה על תפס הדלת.
      הערה: זרוע הידוק המשאבה תיסגר, תא הצנטריפוגה יסתובב והשסתומים ייסגרו. ללא סגירת הדלת, המערכת לא תוכל ליזום ולהריץ את הפרוטוקול.
    12. הכה את ליזום כפתור בממשק המשתמש הגרפי. תופיע רשימת תיוג; ארבעת הפריטים הראשונים הם בדיקות מכשירים, ושני הפריטים האחרונים הם בדיקות משתמש (ודא שהשקיות והחיבורים תואמים את תמונת הערכה, וודא שהמהדקים הידניים פתוחים).
      הערה: עבור בדיקות מכשירים, סימני X אדומים במקום כחולים מוצגים אם משהו אינו כשורה.
    13. לחץ על אישור כדי להציג את מסך קלט הפרוטוקול.
    14. הגדר את ערך תיבת הדו-שיח הזנת נתונים (אמצעי אחסון קציר) כ- 45 מ"ל והקש על אישור.
      הערה: מסך קלט הפרוטוקול יתבקש אם קלט נתונים משתנה כלשהו מוגדר בפרוטוקול שנוצר על-ידי המשתמש. נפח הקציר מוגדר כמשתנה בפרוטוקול זה, והמשתמש יכול לבחור לבדוק אמצעי אחסון שונים בהתאם לדרישות צפיפות התאים הסופיות. נפח הקציר המינימלי שהמערכת מאפשרת הוא 5 מ"ל. המערכת מאפשרת להגדיר עד ארבעה משתני נתונים לכל פרוטוקול.
  3. הפעלת הפרוטוקול
    1. לחץ על Initiate on the GUI, ולחץ על לחצן Start הירוק במכשיר כדי להתחיל את הפעלת הפרוטוקול (עיין בטבלה 1).
      הערה: המערכת תיזום את השלבים בהתאם לפרוטוקול החל מרצף הפריימינג על ידי החלפת האוויר במערכת בחיץ.
    2. לאחר השלמת הפריימינג (טבלה 1, שלב 8) ודא שהמדיום המשומש נשאב במלואו לתוך שקית האשפה.
      הערה: לאחר שהבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות מתרוקן, המערכת תבקש מהמשתמש בממשק המשתמש הגרפי לאשר אם הכלי ריק. לחץ על כפתור "דלג" במכשיר אם הכלי ריק; אם לא, לחץ על הלחצן הירוק "הפעל/השהה" כדי להמשיך לנקז את שאריות הנוזלים מהכלי.
    3. בשלבי הפסקה 15, 19 ו-22 (טבלה 1) הקפידו להרים את הבקבוק הרב-שכבתי ולנער כדי לפזר את החיץ באופן שווה לכל המגשים. לאחר שתסיים, החזירו את הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות למיקום הציור המקורי שלו לשלבים הבאים.
      הערה: עבור שלב 19 בטבלה 1 בלבד, לאחר ניעור, הקפד למקם את הבקבוק הרב-שכבתי שטוח, ולדגור במשך 10-15 דקות ב- RT כדי לנתק את התאים.
    4. בשלב 20 ושלב 23 (טבלה 1), ודא שתאי הטריפסינציה מועברים במלואם לשקית הביניים.
    5. ערבבו היטב את תיק הביניים באופן ידני בשלב 25 (טבלה 1).
    6. בשלב 26 (טבלה 1), השתמש במזרק Luer בנפח 2 מ"ל כדי לדגום דרך יציאת הדגימה.
      הערה: מומלץ לדגום לפחות שלוש פעמים לספירת תאים מדויקת.
    7. בשלב 29 ושלב 30 (טבלה 1), בדוק את היווצרות יציבה של מיטת התא הנוזלית; היא צריכה להיות דומה למיטת התאים הנוזלית כפי שמוצג באיור 1C.
      הערה: אם מצע התא הנוזלי היציב אינו נוצר בדומה לזה שמוצג באיור 1C, מיטוב היחס בין כוח G לקצב הזרימה (G/F) הוא קריטי להשגת מצע תא נוזלי יציב (התאוששות תאים גבוהה) בתא במהלך שלבי הטעינה והשטיפה של התא. יחס G/F תלוי בגודל התאים ובצפיפות התווך. יחס G/F גבוה נדרש עבור חיץ דגימה/שטיפה בצפיפות גבוהה, בעוד שניתן להשתמש ביחס G/F נמוך עבור דגימה בצפיפות נמוכה/חיץ שטיפה.
    8. הריצה תושלם בשלב Ramp to Stop (שלב 35 בטבלה 1), וכל ערכי הצביטה במערכת הצנטריפוגות של הזרימה הנגדית ייסגרו באופן אוטומטי.
      הערה: לבסוף, ודא שהמלחציים הידניים סגורים כדי לאבטח את הנוזל בכל שקית לפני פתיחת הדלת.
    9. לאחר השלמת הפעלת הפרוטוקול, לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית. הוציאו את הערכה החד-פעמית עם התרכיז שנקטף מהמכשיר.
    10. אטמו את קו הקציר באמצעות אוטם צינור ידני. העבירו בזהירות את המזרק האטום המלא בקציר התאים המרוכז לארון הבטיחות הביולוגי לצורך ספירת תאים ושימור בהקפאה.
    11. נתקו שוב את התא באמצעות הידית, משכו את מחבר הנורה מההתאמה שלו והרימו בזהירות את הערכה והשליכו לתוך שקית מסוכנת ביולוגית.
    12. נקו את המכשיר באמצעות מגבוני אתנול, והקפידו לסגור את הדלת.
    13. סגור תחילה את יישום ממשק המשתמש הגרפי לפני כיבוי המתג בחלק האחורי של המכשיר.
      הערה: פרוטוקול קצירת התאים נבדק בטריפליקטים ביולוגיים (n = 3).

5. הערכת תכונות איכות קריטיות (CQA)

  1. סמני פני שטח של זהות התא (CD73, CD90 ו- CD105) וסמנים שאינם סטרומליים (CD34 ו- CD45)
    1. דלל את תרחיף תאי WJ-hMSC שנקצר לריכוז של 1 x 106 תאים קיימא / מ"ל על ידי הוספת נפח מתאים של חיץ ציטומטריית זרימה (DPBS עם 1% BSA או 2% FBS).
    2. הוסף 100 μL של תרחיף התא לכל צינור מיקרוצנטריפוגה או צלחת 96 באר. ודא שקיימים לפחות 0.1 x 106 תאים לכל 100 μL של השעיית תאים.
    3. יש להוסיף נוגדן מצומד פלואורופור לדגימה בדילול מתאים, בהתאם להמלצת ספק הנוגדנים.
    4. דוגרים במשך 20 דקות בחושך.
    5. לאחר הדגירה, הוסף 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה כדי לשטוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 380 x גרם במשך 3 דקות.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השאירו את הגלולה מאחור.
    7. השהה מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של חיץ ציטומטריית זרימה, ובכפוף לניתוח ציטומטריית זרימה30.
  2. יחידות יוצרות מושבה בדיקה פיברובלסטית (CFU-F)
    1. לדלל את תרחיף התא לריכוז של 1,000 תאים קיימא / מ"ל של מדיום תרבית שלם.
    2. צלחת ~ 500 תאים לבאר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות בתווך תרבית שלם.
    3. יש לדגור במשך 10-14 ימים בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO2 לח, לשטוף עם PBS ולהכתים עם 0.5% סגול קריסטל במתנול למשך 30 דקות ב-RT.
    4. מנה את המושבות בכל באר.
    5. חישוב יעילות CFU-F: חלק את מספר המושבות שנוצרו במספר הזריעה המקורי כדי לקבל את אחוז היעילות של היווצרות מושבות, ובטא אותו באחוזים.
  3. פוטנציאל בידול תלת-שושלת
    1. זרע 5 x 103 תאים / ס"מ2 לתוך אוסטאוגנזה ו adipogenesis התמיינות בינוני בצלחות 12 באר לפי פרוטוקול היצרן. עבור chondrogenesis, להכין 1.6 x 107 תאים קיימא / מ"ל, וליצור תרביות מסה מיקרו על ידי זריעת 5 טיפות μL של תמיסת התא במרכזי בארות של לוחות 96 בארות, על פי פרוטוקול היצרן.
    2. במהלך הבידול, בצע שינויים בינוניים מלאים כל 3-4 ימים.
    3. לאחר 14 יום (עבור אדיפוגנזה) או 21 יום (עבור אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה), עקוב אחר התרביות לצורך התמיינות באמצעות כתמים ביולוגיים ספציפיים לשושלת בהתאם לפרוטוקול היצרן. להתמיינות אדיפוגנית, מכתימים את התרביות בתמיסת 0.5% שמן אדום O. עבור אוסטאוגנזה, בצע צביעה באמצעות תמיסת Alizarin Red S 2%. להתמיינות כונדרוגנית, יש להכתים את כדורי המסה הזעירה ב-1% Alcian Blue.
  4. פרופילי הפרשת ציטוקינים
    1. הפשירו את התאים השמורים בהקפאה שנקטפו ידנית או באמצעות מערכת הצנטריפוגות נגד הזרם, וזרעו 5,000 תאים לסמ"ק2 בבקבוק T-175 עם מדיית SFM XF.
    2. לאחר 4 ימים, לאסוף את המדיום תרבית משומש, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד הניתוח.
    3. כמת את הביטוי של ציטוקינים באמצעות ערכת 19 לוחות של ביטויי ציטוקינים בקורא מרבב.
    4. בצע את החיסונים המרובבים בהתאם להמלצות היצרן.

Representative Results

בנק תאי האב WJ-hMSC (MCB) לאחר ההפשרה נשמר במשך שלושה מעברים רצופים (p1-p4) בתווך קלאסי המכיל סרום כדי לייצר מספיק בנקי תאים עובדים (WCB) לניסויים. ה-wcb p4 הופשרו והורחבו הן בתווך המכיל סרום והן בתווך SFM XF לשלושה מעברים נוספים (עמ' 4-p7) בצלוחיות T-175. ה-WJ-MSCs הסתגלו היטב כאשר הורחבו בתווך SFM XF, והצליחו לשמור על שגשוג יציב בדומה לזה שבתווך המכיל סרום (איור 2A). אולם התאים שהתרחבו בתווך SFM XF הציגו מורפולוגיה מעט ארוכה יותר דמוית ציר דמוי פיברובלסט, וכתוצאה מכך גודל התא מעט גדול יותר (איור 2B) של ממוצע של ~17 מיקרומטר בהשוואה ל~15 מיקרומטר בתווך המכיל סרום. בשני התנאים הבינוניים לאורך שלושת המעברים, WJ-hMSCs הגיעו באופן עקבי לצפיפות התאים המקסימלית שלהם של ~2.3 x 104 תאים/ס"מ2 וזמן הכפלת אוכלוסייה של ~34 שעות (איור 2C,D).

לצורך הרחבת WJ-hMSC בקנה מידה גדול במערכת סגורה, ביצענו הרחבה של רכבת זרעים של WJ-hMSCs תחילה בבקבוק בן 4 שכבות, ולאחר מכן, בצלוחית רב-שכבתית בת 10 שכבות. בסביבות 80%-90% מפגש לאחר 4 ימי תרבית, קצרנו 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 ו- 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 10 8 תאים עבור ערימות 4 שכבות ו- 10 שכבות, בהתאמה. צפיפות תאים גבוהה יותר של 3.6 x 10 4-3.8 x 104 תאים/ס"מ2 הושגה בהשוואה לצלוחיות T-175, כלומר הערימות אפשרו התרחבות תאים טובה יותר עד פי שבעה.

יתר על כן, WJ-hMSCs שהורחבו בכלי תרבית של 10 שכבות נקטפו ישירות באמצעות צנטריפוגה נגד הזרם. החיבור הסטרילי לערכה החד-פעמית היה קל להעברה ישירה של נוזלים בקצב זרימה מרבי של 165 מ"ל/דקה באמצעות המשאבה הפריסטלטית של המכשיר. תהליך קצירת התאים האוטומטי למחצה הושג על ידי קצירת התאים תחילה באמצעות דיסוציאציה אנזימטית, העמסת התאים לתוך תא הזרימה הנגדית לצורך הפחתת נפח וריכוז, ולאחר מכן שטיפה עם חיץ שטיפה, שהיה בערך פי 3 מנפח תא הצנטריפוגה של הזרימה הנגדית. יתר על כן, התאים שנשטפו רוכזו ונקטפו לנפח הקציר הרצוי שנקבע מראש בפרוטוקול. שלבי העיבוד המשמשים לעיבוד התאים האוטומטי למחצה תוכננו לחקות את זרימת העבודה הידנית של הקציר. השגנו הפחתה של פי 10 בנפח, וכתוצאה מכך נוצרו ריכוזי תאים גבוהים עד 5.3 מיליון תאים/מ"ל. הפרוטוקול הצליח להשיג התאוששות תאים גבוהה ב~98% ויכולת קיום תאים גבוהה ב~99% באופן עקבי בכל שלוש הריצות הבלתי תלויות (איור 3A-C).

ביצענו בדיקות אפיון תאים מקיפות כדי לקבוע את תכונות האיכות הקריטיות של קציר התאים באמצעות צנטריפוגה נגד זרימה בהשוואה לצנטריפוגה ידנית. כדי לבחון את זהותם של WJ-hMSCs, סמני פני השטח של התא נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4A, ה-WJ-hMSCs שנקטפו בשתי השיטות הציגו פרופילי סמן פני שטח אופייניים בהתאם לתקנות ISCT, ביטוי חיובי של CD73, CD90 ו-CD105, כמו גם ביטוי שלילי של CD34 ו-CD45. לאחר מכן, כדי להעריך את הפוטנציאל הקלונוגני של WJ-hMSCs, בוצעו בדיקות CFU-F. כפי שניתן לראות באיור 4B, תאים שנקצרו מצנטריפוגות נגד זרימה הציגו פוטנציאל CFU-F דומה בהשוואה לתאים שנקצרו באמצעות צנטריפוגה ידנית (21% ±-1% לעומת 20% ±-1%, בהתאמה). יתר על כן, כפי שניתן לראות באיור 4C, תאי הצנטריפוגות שנקטפו לאחר הזרימה הנגדית שמרו על היכולת להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים בדומה לתאים בשיטת הצנטריפוגה הידנית. לבסוף, חקרנו 18 פרופילי הפרשת ציטוקינים שונים של התאים באמצעות בדיקות חיסוניות מרובות. כפי שניתן לראות באיור 4D, התאים שנשטפו ורוכזו באמצעות הצנטריפוגה שלאחר הזרימה הנגדית שמרו על פרופילי הפרשת ציטוקינים, והפרופילים היו דומים לאלה של הדגימה שנלקחה לפני שטיפה/ריכוז התאים (צנטריפוגה לפני זרימה נגדית).

בסך הכל, הדגמנו הרחבת hMSC יעילה במערכת תרבית SFM XF, והתאים שנשטפו ורוכזו באמצעות מערכת הצנטריפוגה הסגורה והאוטומטית של זרימה נגדית הניבו התאוששות תאים גבוהה וכדאיות לאחר השטיפה ויכלו לשמור על הפנוטיפ והפונקציונליות שלהם. התהליך החצי-אוטומטי הסגור שפותח במחקר זה יכול לספק עקביות באיכות המוצר במונחים של התאוששות סופית של WJ-MSC, כפי שמעידים שלושה ריצות עצמאיות.

Figure 1
איור 1: תצורה והרכבה של ערכה חד-פעמית בזרימה גבוהה עבור הקציר, השטיפה והריכוז של hMSCs . (A) דיאגרמת הערכה לאחר שהשקיות חוברו בקו אחד עם הצינור המתאים. (B) הבקבוק הרב-שכבתי בעל 10 השכבות המחובר לערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה באמצעות מכלול צינורות מותאם אישית. (C) הדמיה של מצע התא הנוזלי היציב שנוצר בתא הזרימה הנגדית באמצעות פונקציית המצלמה המופעלת בממשק המשתמש הגרפי של תוכנת הצנטריפוגה נגד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השוואה בין המורפולוגיה של התא והתפשטות של hMSCs בתווך המכיל בסרום ובתווך SFM XF. (A) המורפולוגיה התאית המייצגת של hMSCs בתווך סרום קלאסי ובתווך SFM XF. התאים המורחבים SFM XF הציגו מורפולוגיה ארוכה יותר, בצורת ציר ואופיינית לפיברובלסט, בעוד שהתאים שגדלו בתווך המכיל סרום הציגו מורפולוגיה שטוחה יותר. (B) גודל MSC הממוצע בין התווך המכיל סרום לבין מדיום SFM XF, הנמדד על-ידי מונה תאים אוטומטי (n = 3). ניתן לראות בבירור שהתאים המורחבים של SFM XF היו בדרך כלל גדולים יותר מתאים מורחבים בסרום במעברים שונים. תפוקת התא הכוללת במעברים שונים (n=3) (C) במונחים של תאים לכל שטח פנים של תרבית ו-(D) רמות הכפלת האוכלוסייה. רמות דומות של תפוקת תאים התקבלו בין התווך SFM XF לבין התווך המכיל בסרום במעברים שונים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון תאים שעובדו באמצעות מערכת הצנטריפוגות של הזרימה הנגדית . (A) סך כל התאים הקיימים לפני ואחרי השטיפה והריכוז. (B) הפחתת נפח פי 10 הושגה עיבוד צנטריפוגות לאחר זרימה נגדית. (C) התאוששות מלאה ויכולת קיום של התאים. הנתונים ממוצעים על פני שלושה שכפולים ביולוגיים (n = 3) של ריצות כביסה וריכוז. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח תכונות איכות קריטיות . (A) נתונים מייצגים מציטומטריית זרימה. (B) תמונות מייצגות המציגות את סך כל יחידות ה-CFU. (C) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של התמיינות הטרי-שושלת. (D) תוצאות ניתוח ביטוי ציטוקינים לפני ואחרי עיבוד התאים במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה (n = 3). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רצף קציר hMSC לפי פרוטוקול טריפסיניזציה, שטיפה וריכוז במערכת הצנטריפוגות נגד הזרם, כולל שלבי הפריימינג הראשוניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

בעבודה זו, הראינו את היכולת לסגור ולהפוך דיסוציאציה hMSC לאוטומטית למחצה ולשטוף ולקצור על הספסל באמצעות מכשיר צנטריפוגה נגד הזרם. אחד השלבים הקריטיים בתהליך העבודה כולו הוא לוודא שהצינורות מחוברים בהתאם לפרוטוקול המוגדר מראש המוגדר בבונה פרוטוקולי מערכת הצנטריפוגות של זרימה נגדית. ההתקנה והתפעול פשוטים, והזמן שלקח לעבד כ-2 ליטר תרבית מבקבוק בן 10 שכבות מהרכבת הערכה ועד קציר התאים היה כ-60 דקות. אחד השלבים המגבילים בתהליך עבודה זה הוא העברת נוזלים מהבקבוק הרב-שכבתי לשקיות ההעברה המחוברות למכשיר הצנטריפוגה נגד הזרם. הערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה יכולה להיות מופעלת רק בקצב זרימה מרבי של 165 מ"ל/דקה, וזה עשוי להיות מאתגר לעיבוד, לדוגמה, בקבוק של 40 שכבות. כדי לזרז את תהליך העברת הנוזלים, ניתן להשתמש תחילה במשאבות חיצוניות בעלות קצב זרימה גבוה כדי להעביר תחילה את תכולת הטריפסינציה לשקית העברה, ולאחר מכן לשטוף/לרכז ולקצור את התאים משקית ההעברה באמצעות מערכת הצנטריפוגות נגד הזרם. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם עבור תאים עוברים מ 4 שכבות ל 10 שכבות צלוחיות רב שכבתיות. בהמשך הזרם, מערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה יכולה להיות מותאמת גם לשטיפה של hMSCs מופשרים ולקציר ישיר ופורמולציה בינונית לצלוחיות רב-שכבתיות כדי להתחיל את רכבת הזרעים. יש לציין כי מספר התאים המינימלי הדרוש ליצירת המצע הנוזלי בתא הצנטריפוגה נגד הזרימה הוא כ-30 מיליון תאים, והנפח המרבי המומלץ לעיבוד לכל אצווה הוא 20 ליטר.

נכון לעכשיו, החיבור של מכלול הצינור המותאם אישית לבקבוק הרב-שכבתי בארון הבטיחות הביולוגית והאוטוקלאבינג של חלקי הרכיבים אינם רצויים בהגדרת cGMP. כחלופה, מכלול צינורות מעוקר גמא מותאם אישית יכול להיות במיקור חוץ לספקים. ספקים המספקים צלוחיות רב שכבתיות מציעים גם אפשרות של התאמה מראש של הצלוחיות עם מכלולי צינורות רצויים, כולל מסנן 0.2 מיקרומטר, ועיקור גמא של התלבושת כולה. זה יבטיח שהצלוחיות הרב-שכבתיות והצנרת המחוברת יהיו סגורות באמת, כלומר ניתן יהיה להשלים את התהליך על הספסל בסביבה של חדר נקי Class C.

תהליך זה המשתמש במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה אינו מוגבל לתאים מתורבתים מבוססי דבק בכלי רב שכבתי וניתן להתאים אותו לפלטפורמות התפשטות תאים דינמיות (ביוריאקטורים של מיכל ערבוב או גל) וסטטיות (חדירות לגז) המבוססות על התפשטות תאים. באופן ספציפי, עבור hMSCs שהורחבו בתרביות מיקרו-נשא תלת-ממדיות, ניתן למטב פרוטוקולים במערכת הצנטריפוגות נגד הזרימה כדי לקצור, לשטוף ולנסח את ה-hMSCs המנותקים ממיקרו-נשאים.

בסך הכל, העניין הגובר בפיתוח טיפולים תאיים תרגומיים עם חוסן ואמינות משופרים של תהליכים הוביל לפיתוח פלטפורמות סגורות ואוטומטיות לעיבוד תאים. מערכות אלה הכרחיות, שכן הן מפחיתות את מספר שלבי הטיפול, מונעות זיהום פוטנציאלי על ידי חיבורים סטריליים ומפחיתות את עלויות הייצור על ידי הפחתת כוח אדם ושיפור השימוש היעיל בשטח החדר הנקי21 . בהתאם לכך, רבים ממפתחי מוצרי התרפיה התאית המבקשים אישור רגולטורי לתרגם את הטיפולים שלהם מודעים לחשיבות של סגירת התהליך ויישום אוטומציה מלאה או אוטומציה למחצה כבר בשלב פיתוח התהליך 14,31,32.

עם השימוש בתווך SFM XF ידידותי לרגולציה, ויחד עם ריאגנטים נלווים התואמים ל- 21 CFR GMP Part 11 ולהנחיות איכות בינלאומיות, תהליך אוטומטי למחצה זה יתאים בקלות לייצור קליני. הראינו את יכולת השחזור של התהליך הסגור ואת התחזוקה של איכות WJ-MSCs. שיפור היעילות והבטיחות של גידול תאים מבוססי דבק בצלוחיות רב-שכבתיות יועיל לא רק לתחום הטיפול ב-hMSC אלא גם לחברות בתחום בנקאות קווי התאים וייצור וירוסים דבקים.

Disclosures

P.J., A.B., R.L. ו- J.N. הם עובדים של Thermo Fisher Scientific. לא.ל. ולש.א. אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות על תמיכת קרן התיאום התעשייתי Pre-Positioning Fund (IAF-PP) (H18/01/a0/021 ו-H18/AH/a0/001) מ-A*STAR, סינגפור.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24 (2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320 (2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101 (2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 193 תאי גזע מזנכימליים מדיה נטולת קסנו ללא סרום צלוחיות רב שכבתיות מערכת סגורה אוטומציה קצירת תאים צנטריפוגה נגד זרימה
עיבוד תאי גזע מזנכימליים אנושיים ליישומים קליניים באמצעות זרימת עבודה סגורה חצי אוטומטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, A. T. L., Jayaraman, P.,… More

Lam, A. T. L., Jayaraman, P., Becker, A., Lim, R., Teo, K. L., Ng, J., Oh, S. Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow. J. Vis. Exp. (193), e64707, doi:10.3791/64707 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter