Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mänsklig mesenkymal stamcellsbearbetning för kliniska tillämpningar med hjälp av ett slutet halvautomatiserat arbetsflöde

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64707
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 1
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att skörda vidhäftande celler från flerskiktskolvar på ett slutet halvautomatiserat sätt med hjälp av ett motströmscentrifugeringssystem. Detta protokoll kan tillämpas för att skörda både vidhäftande celler och suspensionsceller från andra cellexpansionsplattformar med få modifieringar av de befintliga stegen.

Abstract

Humana mesenkymala stamceller (hMSC) undersöks för närvarande som en lovande cellbaserad terapeutisk modalitet för olika sjukdomar, med fler marknadsgodkännanden för klinisk användning som förväntas under de närmaste åren. För att underlätta denna övergång är det viktigt att ta itu med flaskhalsarna i skala, lot-to-lot-reproducerbarhet, kostnad, regelefterlevnad och kvalitetskontroll. Dessa utmaningar kan hanteras genom att stänga processen och anta automatiserade tillverkningsplattformar. I denna studie utvecklade vi en sluten och halvautomatisk process för att passera och skörda Whartons gelé (WJ) -härledda hMSC (WJ-hMSC) från flerskiktiga kolvar med användning av motströmscentrifugering. WJ-hMSC utvidgades med hjälp av regulatoriskt kompatibelt serumfritt xenofritt (SFM XF) medium, och de visade jämförbar cellproliferation (populationsfördubbling) och morfologi med WJ-hMSC expanderade i klassiska seruminnehållande medier. Vårt slutna halvautomatiska skördeprotokoll visade hög cellåtervinning (~ 98%) och livskraft (~ 99%). Cellerna tvättades och koncentrerades med motströmscentrifugering bibehöll WJ-hMSC ytmarköruttryck, kolonibildande enheter (CFU-F), trilineagedifferentieringspotential och cytokinsekretionsprofiler. Det halvautomatiska cellskördeprotokollet som utvecklats i studien kan enkelt tillämpas för liten till medelstor bearbetning av olika vidhäftande celler och suspensionsceller genom att direkt ansluta till olika cellexpansionsplattformar för att utföra volymminskning, tvättning och skörd med låg produktionsvolym.

Introduction

Humana mesenkymala stamceller (hMSC) är en utmärkt kandidat för kliniska tillämpningar, både inom vävnadsteknik och cellterapier, med tanke på deras terapeutiska potential och höga självförnyelsepotential att växa in vitro, vilket är avgörande för att generera kliniskt relevanta doser av celler 1,2,3. Enligt ClinicalTrials.gov finns det över 1,000 kliniska prövningar som för närvarande undersöks för olika sjukdomstillstånd4. Mot bakgrund av det ökande intresset för att använda hMSC är fler kliniska prövningar och marknadsgodkännanden nära förestående inom en snar framtid 5,6. Tillverkningen av hMSC har dock många inneboende utmaningar när det gäller batch-till-batch-variabilitet, användningen av högriskråvaror, oro för kontaminering på grund av många öppna och manuella processer, eftersom tillverkningen innebär flera enhetsoperationer, högre arbetskraftskostnader, kostnaden för att skala ut eller skala upp och regulatoriska hinder 6,7,8,9,10, 11,12. Dessa frågor utgör fortfarande ett betydande hinder för nuvarande och framtida marknadstillträde.

Utvecklingen av slutna, modulära, automatiserade tillverkningslösningar och användning av lågriskreagens skulle lösa dessa utmaningar. Detta skulle också säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska sannolikheten för batchfel på grund av mänskliga fel, minska arbetskraftskostnaderna och förbättra processstandardisering och regelefterlevnad, till exempel när det gäller digital batchregistrering 8,12,13,14. För att kunna erhålla en kliniskt relevant dosering av celler, vare sig det är autolog eller allogen, är strömlinjeformad tillverkning som involverar uppströms cellexpansion och nedströms bearbetning på ett slutet, automatiserat sätt avgörande.

För uppströms hMSC-expansion är de två vanligaste tillverkningsmetoderna som för närvarande används utskalning (2D-monolager) och uppskalning (3D-mikrobärarbaserat upphängningssystem)15,16,17,18. Den mest traditionella och allmänt använda metoden för hMSC-expansion är 2D-monolagerbaserad kultur på grund av den låga produktionskostnaden och enkel installation19.

Flerskiktskolvar bestående av plana ytbrickor staplade i ett odlingskärl används vanligtvis för att skala ut hMSC-produktionen. Dessa system kommer vanligtvis i 1-lager till 40-lagers odlingskärl20 och hanteras manuellt inuti biosäkerhetsskåp. Bearbetningsstegen under cellpassage och skörd innefattar manuell dosering och dekantering av expansionsmediet, dissociationsreagens och tvättbuffert genom pipettering eller fysisk lutning av hela kärlet. Dessutom är hantering av flera enheter utmanande och tidskrävande på grund av deras stora storlek och vikt.

Därefter är efterskörd från flerskiktskolvar, centrifugering för medieutbyte, celltvätt och volymminskning viktiga steg i hela arbetsflödet för celltillverkning21. Konventionell bänkcentrifugering är en mestadels öppen och manuell process som involverar en mängd steg, såsom överföring av cellsuspensionen till täckta rör eller flaskor inuti ett biosäkerhetsskåp, snurrar ner cellerna, manuellt aspirerar supernatanten, cellresuspension med bufferten och upprepade celltvättar. Detta ökar dramatiskt både risken för kontaminering på grund av öppning och stängning av locken och risken att förlora cellpelleten under den manuella aspirations-/pipetteringprocessen22. I samband med hantering av flerskiktade odlingssystem för vidhäftande baserade celler som hMSC, skulle operatören behöva gå igenom en mödosam process med skytteltrafik mellan centrifugen och biosäkerhetsskåpet upprepade gånger och hantera en tung enhet samtidigt. Dessa manuella steg är mödosamma, medför risker i form av mänskliga fel och kontaminering och måste utföras i en renrumsmiljö av klass B, vilket är kostsamt23. Dessutom är den konventionella manuella centrifugeringsprocessen inte skalbar och kan orsaka cellulär skjuvning och spänning; Således är maximering av cellåtervinning, livskraft och tvätteffektivitet av kvarvarande föroreningar andra stora utmaningar22. Kommersiell cGMP-skaltillverkning av cellterapier kräver slutna, modulära automatiseringslösningar för att minska risken för kontaminering, säkerställa konsekvent produktkvalitet, minska arbets- och produktionskostnader och öka processäkerheten24,25. Flerskiktskolvar kan hanteras som ett slutet system genom att ha ett sterilt 0,2 μm-filter i en av portarna för att underlätta sterilt gasutbyte och en andra port aseptiskt ansluten via kontakter eller rörsvetsad direkt till ett automatiserat cellbearbetningsinstrument för cellskörd. Vi arbetade för att stänga och automatisera de flesta stegen i WJ-hMSC-passering och skörd genom att utvärdera en innovativ sluten motströmscentrifug avsedd för tillverkning av cell-, gen- eller vävnadsbaserade produkter. Denna motströmscentrifug har också flexibiliteten att utföra en mängd olika cellbehandlingsapplikationer, såsom cellseparation baserat på storlek, medium / buffertbyte, koncentration och skörd för en mängd olika celltyper 8,26,27,28. Instrumentet använder en sluten engångssats som kan anslutas sterilt med rörsvetsning eller aseptiska kontakter för att överföra påsar eller kan anslutas direkt till valfri expansionsplattform.

I denna studie konstruerade vi en anpassad slangenhet för att möjliggöra slutna sterila anslutningar mellan engångscentrifugeringssatsen för motflöde och flerskiktskolven. Vi optimerade ett protokoll för att enzymatiskt lossa, tvätta och skörda WJ-MSC från flerskiktskolven på ett helt slutet och halvautomatiserat sätt inom en enda körning. De skördade WJ-hMSC: erna karakteriserades för renhet (ytmarköranalys) och styrka (CFU-F, trilineagedifferentiering och cytokinsekretionsprofiler) för att säkerställa att slutprodukten uppfyllde de kritiska kvalitetsattributen (CQA) för partifrisättning.

Protocol

1. Beredning av odlingsmediet och beläggning av odlingskärlen

  1. Förberedelse för media
    1. Sammansättning av det klassiska seruminnehållande mediet: Förbered det klassiska seruminnehållande mediet genom att blanda αMEM (445 ml), fetalt bovint serum (FBS) (50 ml) och 100x penicillin-streptomycin (5 ml).
    2. Förbered hela SFM XF-mediet.
      1. Gör en 500 ml flaska genom att aseptiskt tillsätta 5 ml SFM XF-tillskott (100x) och 5 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se materialtabeller) till SFM XF-basmediet (500 ml).
      2. Gör en 2 L mediapåse genom att aseptiskt tillsätta 20 ml anpassat MSC SFM XF-tillskott (100x) och 20 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se materialtabeller) till SFM XF basalmediumpåse (2 L) genom att ansluta en 50 ml spruta till lämplig port på påsen.
        OBS: Innan du använder i kultur, tillsätt tillväxtfaktorer eller cytokiner (medföljer inte mediet) till hela SF XF-mediet: PDGF-BB (20 ng / ml), FGF basic (4 ng / ml) och TGFβ (0,5 ng / ml).
  2. Beläggning av cellodlingskärlen med vitronektin för användning med serumfria medier
    1. Tina en stam av vitronektin (VTN-N; 0,9 mg/ml) vid 4 °C.
    2. Använd steril Dulbeccos buffrade saltlösning utan kalcium och magnesium (DPBS) för att späda den tinade VTN-N till en arbetskoncentration på 5 μg / ml.
      OBS: Späd VTN-N omedelbart före användning och förvara inte den utspädda vitronektinlösningen.
    3. Tillsätt 1 ml/10cm2 av den utspädda VTN-N-lösningen till motsvarande odlingskärl. Den slutliga koncentrationen är 0,5 μg/cm2. Tillsätt till exempel 7,5 ml utspädd VTN-N-lösning till en T-75-kolv (75 cm2); tillsätt 17,5 ml utspädd VTN-N-lösning till en T-175-kolv (175 cm2); Tillsätt 250 ml utspädd VTN-N-lösning till en standardkolv i fyra lager i flera lager (2,528 cm2). och tillsätt 630 ml utspädd VTN-N-lösning till en 10-lagers flerskiktskolv (6,320 cm2).
    4. Under sterila förhållanden, inkubera kärlen i 1 h vid rumstemperatur (RT).
      OBS: Det belagda odlingskärlet kan förvaras i 4 °C i upp till 1 vecka. Vik odlingskärlet med laboratoriefilm för att förhindra att det torkar ut. Förvärm odlingskärlet till rumstemperatur i minst 1 h före användning.
    5. Aspirera VTN-N-lösningen, kassera och tillsätt omedelbart en tillräcklig volym odlingsmedium för att förhindra att den belagda kärlytan torkar.
      OBS: Det är inte nödvändigt att skölja av odlingskärlet efter avlägsnande av VTN-N.

2. WJ-hMSC-expansion

  1. Tina WJ-hMSC (p2) snabbt genom att placera kryovialen i ett vattenbad på 37 °C. Snurra injektionsflaskan långsamt tills innehållet börjar tina.
  2. Vid upptining ympas WJ-hMSC vid 5 000 celler/cm2 i en T-175-kolv (utan VTN-N-beläggning) och inkuberas i det klassiska seruminnehållande mediet vid 37 °C i en fuktad atmosfär på 5 %CO2 för cellexpansion. Efter två passager (p4), banka ner de expanderade cellerna i önskat kryokonserveringsmedium som en fungerande cellbank (WCB).
  3. Utför cellräkning med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt viabilitets- och cellräkningsmetoden för att bestämma det totala cellantalet, cellviabiliteten och cellstorleken29.
  4. Från p4 odlas WJ-hMSC vid 5 000 celler/cm2 i T-75-kolvar i antingen klassiskt seruminnehållande medium eller SFM XF-medium (använd VTN-N-belagda kolvar med SFM XF-medium).
  5. Behåll cellerna i båda odlingsmedierna i totalt tre passager (12 dagar) och mät cellexpansionen (veckökning) vid varje passage genom att dividera antalet viabla celler som räknas i slutet av kulturen för varje passage med antalet viabla celler i början av kulturen (dag för cellsådd).

3. Utskalning av utsädeståg

  1. WJ-hMSC-expansion i en T-175-kolv
    1. Tina WJ-hMSC vid p4 snabbt genom att placera kryovialen i ett vattenbad på 37 °C. Snurra injektionsflaskan långsamt tills lösningen börjar tina upp.
    2. Frö 5 000 celler/cm2 till en VTN-N-belagd T-175-kolv. Låt cellerna växa i en inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
    3. Byt ut det förbrukade odlingsmediet var 2-3: e dag med nyberedd förvärmd, komplett SFM XF-medium för optimal prestanda och celltillväxt.
  2. Hantering av flerskiktskolvar (figur 1A och B)
    1. Alla aseptiska anslutningar måste göras i en steril miljö.
    2. Packa upp flerskiktskolven i ett biologiskt säkerhetsskåp.
    3. Anslut det försteriliserade luftfiltret (0,2 μm) till en port så att trycket kan släppas under vätskeöverföringen med hjälp av motströmscentrifugen.
    4. Montera kolvkontakten i flera lager från den anpassade slanguppsättningen i den andra porten (bild 1B).
    5. Svetsa PVC-linjen i den anpassade slanguppsättningen till 2 L PVC-överföringspåsen som innehåller komplett SFM XF-medium.
      OBS: Blanda mediumpåsen helt innan du lägger den till flerskiktssystemet genom tyngdkraftsflöde. Se till att PVC-överföringspåsen hänger högre än flerskiktskolven.
    6. Placera flerskiktskolven på långsidan med luftfiltret överst (figur 1B).
    7. Öppna klämman på PVC-slangen för att börja fylla kolven i flera lager. Se till att mediet är jämnt mellan brickorna under fyllningen.
    8. När mediet har planat ut helt i alla brickor, vrid kolven i flera lager på kortsidan med portarna upprätt.
    9. Stäng klämman på PVC-ledningen och ta bort överföringspåsen genom att byta ut slanganslutningen med MPC-blått stängningslock.
      OBS: Ta inte bort luftfiltret, eftersom det möjliggör gasutbyte under cellexpansion.
    10. Vrid kolven i flera lager till inkubationsläget.
      OBS: Filtret och slanganslutningen ska vara vända uppåt.
    11. Töm kolven i flera lager genom att ansluta den till en suggasflaska. Placera den ovanför sugflaskan, och vätskan kommer att strömma ut.
      OBS: Luta kolven i flera lager på sidan för att helt tömma ut det förbrukade mediet genom tyngdkraften. Alternativt kan det använda mediet hällas i en avfallsflaska med hjälp av en anpassad slangenhet.
    12. Upprepa steg 3.2.5-3.2.11 för att fylla på det nya mediet.
  3. Subkultur av WJ-hMSC i flerskiktskolven (T-175 > 4-lagers > 10-lagers)
    1. Förvärmt celldissociationsreagens (TrypLE) och komplett SFM XF-medium inuti en 37 °C inkubator före användning.
    2. Aspirera det förbrukade mediet från T-175-kolven och kassera.
    3. Tvätta cellmonolagret med förvärmd DPBS, aspirera och kassera.
    4. Tillsätt TrypLE till varje kolv, se till att cellmonolagret täcks fullständigt och inkubera i 5–10 minuter vid 37 °C.
    5. Överför suspensionen till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
    6. Centrifugera röret vid 100-200 x g i 5 minuter vid RT. Aspirera och kassera DPBS och var försiktig så att du inte stör cellpelleten.
    7. Återsuspendera cellpelleten i en minimal volym (10 ml) förvärmt komplett SFM XF-medium för cellräkning.
    8. Fyll ett VTN-N-belagt odlingskärl med fyra lager med cirka 800 ml komplett SFM XF-medium, som nämns i avsnitt 2 ovan. Tillsätt 5 000 celler/cm2 (dvs. 1,26 x 107 viabla celler/kolv). Snurra försiktigt cellsuspensionen för att säkerställa en jämn fördelning.
    9. Inkubera i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 i en fuktad atmosfär.
    10. Byt ut det använda odlingsmediet var 2-3: e dag med färskt, förvärmt komplett SFM XF-medium för optimal celltillväxt tills cellerna når 60% -80% sammanflöde eller är redo att subkultiveras i 10-lagers flerskiktskolv.
    11. Fyll en VTN-N-belagd 10-lagers flerskiktskolv med ca 2 l komplett SFM XF-medium, enligt avsnitt 2. Tillsätt 5 000 celler/cm2 (dvs. 3,1 x 107 celler/kolv). Snurra försiktigt cellsuspensionen för att säkerställa en jämn fördelning.
    12. Inkubera i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 i en fuktad atmosfär.
    13. Byt ut det använda odlingsmediet var 2-3: e dag med färskt, förvärmt komplett SFM XF-medium för optimal celltillväxt tills cellerna når 60% -80% sammanflöde eller är redo att skördas.

4. Sluten halvautomatisk WJ-hMSC-dissociation och skörd med sluten motströmscentrifugering

  1. Motströmningscentrifugeringssats för engångsbruk
    1. Anslut engångssatsen till PVC-överföringspåsarna för engångsbruk via rörsvetsning, liknande konfigurationen som visas i figur 1A.
      OBS: Standardflödeshastigheten för engångssatsen är 30-165 ml / min.
    2. Fäst en 10-lagers flerskiktskolv som innehåller sammanflytande WJ-hMSC på den anpassade slangenheten inuti ett biosäkerhetsskåp.
    3. Överför det bifogade 10-lagers odlingskärlet med den anpassade slangenheten till en bänk och svetsa till linje E (3/32 i ID PVC) i engångssatsen, som visas i figur 1B.
    4. Se till att svetsa en steril provport till linje G i högflödessatsen för engångsbruk.
    5. Anslut sedan skördelinjen H till en steril Luer försedd med en 50 ml spruta.
      OBS: I alla ovanstående steg, se till att de manuella klämmorna är stängda för att säkra vätskan i varje kitpåse.
  2. Ställa in instrumentkörningen
    1. Slå på instrumentet " ON" genom att slå på vippomkopplaren på instrumentets baksida.
    2. Anslut den bärbara datorn till USB-C-porten på instrumentet med den medföljande USB-C-kabeln (bild 1B).
    3. Kör programvaran för grafiskt användargränssnitt (GUI) för motflödescentrifug från skrivbordet eller startmenyn.
    4. När du har loggat in laddar du protokollet genom att klicka på knappen Välj ett protokoll på välkomstsidan på huvudsidan.
      OBS: Motströmscentrifugeringsskördprotokollet (tabell 1) skapades med hjälp av Protocol Builder-programvaran och lagrades lokalt.
    5. Tryck på den blå upplåsningsknappen på instrumentet och öppna glasdörren.
    6. Ladda den monterade engångssatsen på motströmscentrifugeringssystemet.
    7. Börja med att hänga påsarna upphängda på hängkrokar i en ordning som bäst stämmer överens med rörportarna på bubbelsensorremsorna, med den 10-skiktade flerskiktskolven placerad i en vinkel, som visas i figur 1B.
    8. Rikta in satsen med de två satsplatsknapparna, sträck pumpslangen runt den peristaltiska pumpen och tryck den vita glödlampformade kontakten på plats.
      OBS: Se till att slangen över trycksensorn är korrekt placerad i slangspåret.
    9. Fäst centrifugkammaren genom att lyfta silverspaken på motströmscentrifugkammarens bärare och säkra den genom att återställa spaken till upprätt läge.
    10. Tryck slangen från varje port på satsen i spåren längs bubbelsensorremsorna.
      OBS: Se till att påsarna inte är trassliga så att protokollprocessen enkelt kan följas.
    11. Stäng dörren genom att trycka ner dörrlåset.
      OBS: Pumpklämmen stängs, centrifugkammaren snurrar och ventilerna stängs. Utan att stänga dörren kommer systemet inte att kunna initiera och köra protokollet.
    12. Tryck på initieringsknappen på GUI. En checklista visas; De första fyra objekten är instrumentkontroller och de två sista objekten är användarkontroller (se till att påsarna och anslutningarna matchar kitbilden och se till att de manuella klämmorna är öppna).
      OBS: För instrumentkontroller visas röda kryss istället för blå bockar om något inte står rätt till.
    13. Tryck på Bekräfta för att visa skärmen för protokollinmatningar.
    14. Ange värdet för dialogrutan Datainmatning (Skördevolym) till 45 ml och tryck på Bekräfta.
      OBS: Protokollets inmatningsskärm kommer att tillfrågas om några variabla datainmatningar är inställda i det användarskapade protokollet. Skördevolymen ställs in som en variabel i detta protokoll, och användaren kan välja att testa olika volymer beroende på de slutliga celldensitetskraven. Den minsta skördevolymen som systemet tillåter är 5 ml. Systemet tillåter att högst fyra datavariabler ställs in för varje protokoll.
  3. Köra protokollet
    1. Klicka på Initiera på GUI och tryck på den gröna Start-knappen på instrumentet för att starta protokollkörningen (se tabell 1).
      OBS: Systemet kommer att initiera stegen enligt protokollet som börjar med primingsekvensen genom att ersätta luften i systemet med en buffert.
    2. När grundningen är klar (tabell 1, steg 8) se till att det använda mediet pumpas ut helt i avfallspåsen.
      OBS: När 10-lagers flerskiktskolven är tom kommer systemet att uppmana användaren i GUI att bekräfta om kärlet är tomt. Tryck på "Skip" -knappen på instrumentet om fartyget är tomt; Om inte, tryck på den gröna "Spela / pausa" -knappen för att fortsätta tömma eventuella kvarvarande vätskor från kärlet.
    3. I paussteg 15, 19 och 22 (tabell 1) se till att lyfta upp flerskiktskolven och skaka för att fördela bufferten lika till alla brickor. När du är klar placerar du 10-lagers flerskiktskolven tillbaka i sitt ursprungliga dragläge för nästa steg.
      Anmärkning: Endast för steg 19 i tabell 1 , efter skakning, se till att placera flerskiktskolven platt och inkubera i 10-15 minuter vid RT för att dissociera cellerna.
    4. I steg 20 och steg 23 (tabell 1), se till att de trypsiniserade cellerna överförs helt till mellanpåsen.
    5. Blanda mellanpåsen väl manuellt i steg 25 (tabell 1).
    6. I steg 26 (tabell 1), använd en 2 ml Luer-spruta för att ta prov genom provtagningsporten.
      OBS: Det rekommenderas att prova minst tre gånger för exakta cellräkningar.
    7. I steg 29 och steg 30 (tabell 1), kontrollera den stabila bildningen av den fluidiserade cellbädden; den bör likna den fluidiserade cellbädden som visas i figur 1C.
      OBS: Om den stabila fluidiserade cellbädden inte bildas liknande den som visas i figur 1C, är optimering av förhållandet mellan g-kraften och flödeshastigheten (G / F) avgörande för att uppnå en stabil fluidiserad cellbädd (hög cellåtervinning) i kammaren under cellbelastnings- och tvättstegen. G / F-förhållandet beror på cellernas storlek och mediets densitet. Ett högt G/F-förhållande behövs för ett prov med hög densitet/tvättbuffert, medan ett lågt G/F-förhållande kan användas för ett prov med låg densitet/tvättbuffert.
    8. Körningen är klar vid steget Ramp till stopp (steg 35 i tabell 1) och alla klämvärden på motströmscentrifugeringssystemet stängs automatiskt.
      OBS: Slutligen, se till att de manuella klämmorna är stängda för att säkra vätskan i varje kitpåse innan du öppnar dörren.
    9. När protokollkörningen är klar trycker du på den blå upplåsningsknappen på instrumentet och öppnar glasdörren. Ta engångssatsen med det skördade koncentratet ur instrumentet.
    10. Försegla skördelinjen aseptiskt med en handbärande rörförseglare. Överför försiktigt den förseglade sprutan fylld med den koncentrerade cellskörden till det biologiska säkerhetsskåpet för cellräkning och kryokonservering.
    11. Lossa kammaren igen med spaken, dra ut lampkontakten ur kopplingen och lyft försiktigt bort satsen och kasta i en biohazard-påse.
    12. Rengör instrumentet med etanolservetter och se till att stänga dörren.
    13. Stäng GUI-applikationen först innan du stänger av strömbrytaren på baksidan av instrumentet.
      OBS: Cellskördeprotokollet testades i biologiska triplikater (n = 3).

5. Bedömning av kritiska kvalitetsattribut (CQA)

  1. Ytmarkörer för cellidentitet (CD73, CD90 och CD105) och icke-stromamarkörer (CD34 och CD45)
    1. Späd den skördade WJ-hMSC-cellsuspensionen till en koncentration av 1 x 106 viabla celler/ml genom att tillsätta en lämplig volym flödescytometribuffert (DPBS med 1% BSA eller 2% FBS).
    2. Tillsätt 100 μL av cellsuspensionen till varje mikrocentrifugrör eller 96-brunnsplatta. Se till att minst 0,1 x 106 celler finns per 100 μL cellsuspension.
    3. Tillsätt fluorkonjugerad antikropp till provet i lämplig spädning, enligt antikroppsleverantörens rekommendationer.
    4. Inkubera i 20 minuter i mörkret.
    5. Efter inkubationen tillsätts 100 μl flödescytometribuffert för att tvätta proverna genom centrifugering vid 380 x g i 3 minuter.
    6. Kassera supernatanten och lämna pelleten bakom.
    7. Resuspendera cellpelleten i 200 μL flödescytometribuffert och bli föremål för flödescytometrianalys30.
  2. Kolonibildande enheter fibroblastisk analys (CFU-F)
    1. Späd cellsuspensionen till en koncentration av 1 000 viabla celler/ml komplett odlingsmedium.
    2. Platta ~ 500 celler per brunn i en 6-brunns vävnadsodlingsplatta i komplett odlingsmedium.
    3. Inkubera i 10-14 dagar vid 37 °C i 5% fuktad CO2, tvätta med PBS och färga med 0,5% kristallviolett i metanol i 30 minuter vid rumstemperatur.
    4. Räkna upp kolonierna i varje brunn.
    5. Beräkna CFU-F-effektiviteten: Dela antalet kolonier som bildas av det ursprungliga såddnumret för att erhålla den procentuella effektiviteten för kolonibildning och uttrycka den i procent.
  3. Trilineage differentieringspotential
    1. Frö 5 x 103 celler / cm2 till osteogenes och adipogenesis differentieringsmedium i 12-brunnsplattor enligt tillverkarens protokoll. För kondrogenes, förbered 1,6 x 107 livskraftiga celler / ml och generera mikromasskulturer genom sådd av 5 μL droppar av celllösningen i mitten av brunnarna på 96-brunnsplattor, enligt tillverkarens protokoll.
    2. Under differentiering, gör fullständiga medieändringar var 3-4: e dag.
    3. Efter 14 dagar (för adipogenesis) eller 21 dagar (för osteogenes och kondrogenes), övervaka kulturerna för differentiering genom att använda härstamningsspecifika biologiska fläckar enligt tillverkarens protokoll. För adipogenic differentiering, färga kulturerna med 0,5% Oil Red O-lösning. För osteogenes, utför färgning genom att använda en 2% Alizarin Red S-lösning. För kondrogen differentiering, färga mikromasspelletsna med 1% Alcian Blue.
  4. Cytokinsekretionsprofiler
    1. Tina de kryokonserverade cellerna som skördats manuellt eller med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet och frö 5 000 celler/cm2 i en T-175-kolv med SFM XF-media.
    2. Efter 4 dagar samlas det använda odlingsmediet upp och förvaras vid -80 °C tills analys.
    3. Kvantifiera uttrycket av cytokiner med hjälp av en cytokinuttrycksprofil 19-plex panelsats på en multiplexläsare.
    4. Utför multipleximmunanalyserna enligt tillverkarens rekommendationer.

Representative Results

WJ-hMSC-mastercellbanken (MCB) efter upptining upprätthölls i tre på varandra följande passager (p1-p4) i klassiskt seruminnehållande medium för att producera tillräckligt med arbetscellbanker (WCB) för experimenten. P4 WCB tinades och expanderades i både seruminnehållande medium och SFM XF-medium för ytterligare tre passager (p4-p7) i T-175-kolvar. WJ-MSC anpassade sig väl när de expanderades i SFM XF-medium och kunde upprätthålla stabil proliferation liknande den i seruminnehållande medium (figur 2A). Cellerna expanderade i SFM XF-medium uppvisade dock något längre fibroblastliknande spindelformad morfologi, vilket resulterade i en något större cellstorlek (figur 2B) på i genomsnitt ~17 μm jämfört med ~15 μm i seruminnehållande medium. I båda medelförhållandena över de tre passagerna nådde WJ-hMSC konsekvent sin maximala celldensitet på ~ 2,3 x 104 celler / cm2 och en befolkningsfördubblingstid på ~ 34 h (figur 2C, D).

För storskalig WJ-hMSC-expansion i ett slutet system genomförde vi en såtågsexpansion av WJ-hMSC först i en 4-lagers kolv och därefter i en 10-lagers flerskiktskolv. Vid cirka 80% -90% sammanflöde efter 4 dagars kultur skördade vi 9,6 x 10 7± 0,9 x 107 och 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celler för 4-lagers respektive 10-lagers staplar. En högre celldensitet på 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celler/cm2 uppnåddes jämfört med i T-175-kolvarna, vilket innebär att staplarna möjliggjorde bättre cellexpansion med upp till sju gånger.

Vidare skördades WJ-hMSCs expanderade i 10-lagers odlingskärl direkt med hjälp av motströmscentrifugering. Den sterila anslutningen till engångssatsen var enkel att upprätta för direkt vätskeöverföring med en maximal flödeshastighet på 165 ml/min med hjälp av instrumentets peristaltiska pump. Den halvautomatiserade cellskördsprocessen uppnåddes genom att först skörda cellerna med enzymatisk dissociation, ladda cellerna i motströmskammaren för volymreduktion och koncentration och sedan tvätta med tvättbuffert, vilket var cirka 3x volymen för motströmscentrifugeringskammaren. Vidare koncentrerades de tvättade cellerna och skördades till önskad skördevolym förinställd i protokollet. Bearbetningsstegen som används för den halvautomatiska cellbearbetningen utformades för att efterlikna arbetsflödet för manuell skörd. Vi uppnådde en 10-faldig volymminskning, vilket resulterade i generering av cellkoncentrationer så höga som 5,3 miljoner celler / ml. Protokollet kunde uppnå hög cellåterhämtning vid ~ 98% och hög cellviabilitet vid ~ 99% konsekvent för alla tre oberoende körningar (figur 3A-C).

Vi utförde omfattande cellkarakteriseringsanalyser för att bestämma de kritiska kvalitetsegenskaperna för cellskörden med hjälp av motströmscentrifugering jämfört med manuell centrifugering. För att testa identiteten hos WJ-hMSC analyserades cellytemarkörer med flödescytometri. Som visas i figur 4A uppvisade WJ-hMSC som skördats med båda metoderna karakteristiska ytmarkörprofiler enligt ISCT-föreskrifterna, positivt uttryck av CD73, CD90 och CD105 samt negativt uttryck av CD34 och CD45. För att utvärdera den klonogena potentialen hos WJ-hMSC utfördes CFU-F-analyser. Som visas i figur 4B uppvisade celler som skördats från motströmscentrifugering en liknande CFU-F-potential jämfört med celler som skördats genom manuell centrifugering (21% ± 1% respektive 20% ± 1%). Vidare, som visas i figur 4C, behöll de centrifugeringsskördade cellerna efter motflöde förmågan att differentiera till adipocyter, osteoblaster och kondrocyter som liknar cellerna i den manuella centrifugeringsmetoden. Slutligen undersökte vi 18 olika cytokinsekretionsprofiler av cellerna med hjälp av multiplexa immunanalyser. Som visas i figur 4D upprätthöll cellerna som tvättades och koncentrerades med hjälp av efterflödescentrifugeringen cytokinsekretionsprofilerna, och profilerna var jämförbara med profilerna för det prov som togs före tvättning/koncentration av cellerna (centrifugering före motflöde).

Sammantaget har vi visat effektiv hMSC-expansion i ett SFM XF-odlingssystem, och cellerna som tvättades och koncentrerades med hjälp av det slutna, automatiserade motflödescentrifugeringssystemet gav hög cellåtervinning och livskraft efter tvätt och kunde behålla sin fenotyp och funktionalitet. Den slutna halvautomatiserade processen som utvecklats i denna studie kan leverera produktkvalitetskonsistens när det gäller slutlig WJ-MSC-återhämtning, vilket framgår av tre oberoende körningar.

Figure 1
Figur 1: Konfiguration och montering av högflödessatser för engångsbruk för skörd, tvättning och koncentration av hMSC . (A) Kitdiagram efter att säckarna har anslutits i linje med respektive slang. B) 10-lagers flerskiktskolv ansluten till högflödessatsen för engångsbruk med den anpassade slangenheten. (C) Visualisering av den stabila fluidiserade cellbädden som bildas i motströmskammaren via kamerafunktionen aktiverad i det grafiska användargränssnittet för motströmscentrifugeringsprogramvaran. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Jämförelse av cellmorfologi och expansion av hMSC i seruminnehållande medium och SFM XF-medium. (A) Den representativa cellmorfologin för hMSC i klassiskt serummedium och SFM XF-medium. De SFM XF-expanderade cellerna uppvisade en längre, spindelformad, karakteristisk fibroblastliknande morfologi, medan cellerna odlade i seruminnehållande medium uppvisade en mer tillplattad morfologi. (B) Den genomsnittliga MSC-storleken mellan det seruminnehållande mediet och SFM XF-mediet, mätt med en automatiserad cellräknare (n = 3). Det är tydligt att se att SFM XF-expanderade celler i allmänhet var större än serumexpanderade celler över olika passager. Det totala cellutbytet i olika passager (n = 3) (C) i termer av celler per odlingsyta och (D) populationsfördubblingsnivåer. Liknande nivåer av cellutbyte erhölls mellan SFM XF-mediet och seruminnehållande medium över olika passager. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av celler bearbetade med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet . a) Totalt antal viabla celler före och efter tvättning och koncentration. (B) En 10x volymreduktion uppnåddes efter centrifugeringsbearbetning efter motflöde. (C) Total återhämtning och livskraft hos cellerna. Data beräknas i genomsnitt över tre biologiska replikat (n = 3) av tvätt- och koncentrationskörningar. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av kritiska kvalitetsattribut . (A) Representativa data från flödescytometri. (B) Representativa bilder som visar den totala CFU. (C) Representativa mikroskopiska bilder av trelinjedifferentieringen. d) Resultat av analys av cytokinuttryck före och efter bearbetning av cellerna i motströmscentrifugeringssystemet (n = 3). Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Sekvens av hMSC-skörden genom trypsinisering, tvättning och koncentrationsprotokoll på motströmscentrifugeringssystemet, inklusive de inledande grundningsstegen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

I detta arbete har vi visat förmågan att stänga och halvautomatisera hMSC-dissociation och tvätta och skörda på bänken med hjälp av ett motströmscentrifugeringsinstrument. Ett av de kritiska stegen i hela arbetsflödet är att se till att slangarna är anslutna enligt det förinställda protokollet som definierats i protokollbyggaren för motflödescentrifugeringssystemet. Installationen och driften är enkel, och den tid det tog att bearbeta cirka 2 liter kultur från en 10-lagers kolv från kitmontering till cellskörd var cirka 60 minuter. Ett av de begränsande stegen i detta arbetsflöde är vätskeöverföringen från flerskiktskolven till överföringspåsarna anslutna till motströmscentrifugeringsinstrumentet. Högflödessatsen för engångsbruk kan endast köras med en maximal flödeshastighet på 165 ml/min, och detta kan vara utmanande för bearbetning, till exempel en 40-lagers kolv. För att påskynda processen för vätskeöverföring kan externa högflödespumpar användas för att överföra det trypsiniserade innehållet till en överföringspåse först, följt av tvättning / koncentration och skörd av cellerna från överföringspåsen med hjälp av motströmscentrifugeringssystemet. Dessutom kan detta protokoll också tillämpas för att passera celler från 4-lager till 10-lagers flerskiktiga kolvar. Längre uppströms kan motströmscentrifugeringssystemet också optimeras för tvättning av tinade hMSC och direkt skörd och mediumformulering i flerskiktskolvar för att starta såtåget. Det bör noteras att det minsta antalet celler som krävs för att bilda den fluidiserade bädden i motströmscentrifugeringskammaren är cirka 30 miljoner celler och den maximala rekommenderade volymen att bearbeta per sats är 20 liter.

För närvarande är det inte önskvärt att fästa den anpassade slangenheten på flerskiktskolven i biosäkerhetsskåpet och autoklaveringen av komponenternas delar i en cGMP-inställning. Som ett alternativ kan en anpassad gammasteriliserad slangenhet outsourcas till leverantörer. Leverantörer som tillhandahåller flerskiktskolvar erbjuder också möjligheten att förmontera kolvarna med önskade slangaggregat, inklusive ett 0,2 μm filter och gammasterilisering av hela utrustningen. Detta skulle säkerställa att flerskiktskolvarna och tillhörande slangar verkligen är stängda, vilket innebär att processen kan slutföras på bänken i en klass C-renrumsinställning.

Denna process som använder motströmscentrifugeringssystemet är inte begränsad till vidhäftningsbaserade odlade celler i ett flerskiktat kärl och kan anpassas till dynamiska (omrörda tank eller vågbioreaktorer) och statiska (gasgenomsläppliga) suspensionsbaserade cellexpansionsplattformar. Specifikt, för hMSC expanderade i 3D-mikrobärarkulturer, kan protokoll optimeras på motströmscentrifugeringssystemet för att skörda, tvätta och formulera hMSC: erna dissocierade från mikrobärare.

Sammantaget har det ökande intresset för att utveckla translationella cellulära terapier med förbättrad processrobusthet och tillförlitlighet lett till utvecklingen av slutna, automatiserade cellbehandlingsplattformar. Dessa system är absolut nödvändiga, eftersom de minskar antalet hanteringssteg, förhindrar potentiell kontaminering genom sterila anslutningar och minskar tillverkningskostnaderna genom att minska arbetskraften och förbättra den effektiva användningen av renrumsutrymme21. I linje med detta är många av de cellterapiproduktutvecklare som söker regulatoriskt godkännande för att översätta sina terapier medvetna om vikten av att stänga processen och implementera full automatisering eller halvautomatisering redan i processutvecklingsstadiet 14,31,32.

Med användning av regleringsvänligt SFM XF-medium, och tillsammans med tillhörande reagens som överensstämmer med 21 CFR GMP Part 11 och internationella kvalitetsriktlinjer, skulle denna halvautomatiserade process vara lätt lämplig för klinisk tillverkning. Vi har visat reproducerbarheten av den slutna processen och upprätthållandet av kvaliteten på WJ-MSC. Att förbättra effektiviteten och säkerheten vid odling av vidhäftningsbaserade celler i flerskiktskolvar skulle gynna inte bara hMSC-terapifältet utan även företag inom cellinjebank och vidhäftande virusproduktion.

Disclosures

P.J., A.B., R.L. och J.N. är anställda av Thermo Fisher Scientific. A.L. och S.O. har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för stöd från finansieringen från Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 och H18/AH/a0/001) från A*STAR, Singapore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24 (2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320 (2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101 (2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193 mesenkymala stamceller serumfria xenofria medier flerskiktskolv slutet system automatisering cellskörd motströmscentrifugering
Mänsklig mesenkymal stamcellsbearbetning för kliniska tillämpningar med hjälp av ett slutet halvautomatiserat arbetsflöde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, A. T. L., Jayaraman, P.,… More

Lam, A. T. L., Jayaraman, P., Becker, A., Lim, R., Teo, K. L., Ng, J., Oh, S. Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow. J. Vis. Exp. (193), e64707, doi:10.3791/64707 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter