Summary
アクセサリータンパク質TnpBが個々の生きた 大腸菌 細胞の転位のダイナミクスにどのように影響するかを定量化するために、ライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルが概説されています。
Abstract
ここでは、転位に結合された一連の蛍光レポーターを使用して、生細菌細胞における転移因子活性のライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルの概要を説明します。特に、トランスポーズ可能なエレメントのIS200/IS605ファミリーのメンバーであるトランスポザブルエレメントIS608の活性に対するアクセサリータンパク質TnpBの影響を評価するために、リアルタイムイメージングをどのように使用できるかを示しています。IS200/IS605ファミリーの転移性エレメントは、自然界に見られる最も無数の遺伝子の1つであるtnpBと結合した豊富な可動エレメントです。配列相同性は、TnpBタンパク質がCRISPR/Cas9システムの進化的前駆体である可能性があることを示唆しています。さらに、TnpBは、Cas様RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼとして作用することが示され、新たな関心を集めています。IS608の転位率に対するTnpBの効果は定量化され、IS608のTnpBの発現は、TnpB発現を欠く細胞と比較してトランスポゾン活性を~5倍増加させることが実証されています。
Introduction
転移要素(TE)は、切除または触媒コピーとそれに続くゲノム再統合によって宿主ゲノム内で動員される遺伝的要素です。TEは生命のすべてのドメインに存在し、転位は宿主ゲノムを再構築し、コード領域と制御領域を変異させます1。これにより、進化2,3、発生4,5、および癌7を含むいくつかのヒト疾患6において重要な役割を果たす突然変異と多様性が生成されます。
転位活性の側面を蛍光レポーターに結合する新しい遺伝子構築物を使用して、私たちの以前の研究では、広く普及しているIS200/IS605ファミリーのTEファミリーの代表である細菌TE IS608に基づく実験システムの開発について説明しました。 TE システムを図 1A に示します。TEは、トランスポザーゼコード配列tnpAで構成され、TnpAの認識部位と切除部位である左端(LE)と右端(RE)の不完全な回文反復(IP)が挟まれています。tnpAは、テットリプレッサーによって抑制され、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)9で誘導されるプロモーターPLTetO1を用いて発現されます。TEは、構成的PlacIQ1プロモーター10の-10および-35配列を青色レポーターmCerulean311のために分割する。図1Cに示すように、tnpAの産生が誘導されると、TEを切除することができ、プロモーター再構成につながる。産生された細胞はmCerulean3を発現し、青色を発する。TnpAのN末端は黄色レポーターVenus12に融合しており、黄色蛍光によるTnpAレベルの測定が可能です。
IS608およびIS200/IS605ファミリーのトランスポゾンの他のメンバーも、これまで知られていなかった機能の2番目の遺伝子であるtnpB13を典型的にコードする。TnpBタンパク質は、非常に豊富ではあるが不完全に特徴付けられたヌクレアーゼファミリーであり、いくつかの細菌および古細菌のTE14,15によってコードされており、多くの場合tnpB16のみで構成されています。さらに、最近の研究では、TnpBがCRISPR/Cas様プログラマブルRNAガイドエンドヌクレアーゼとして機能し、さまざまな条件下でdsDNAまたはssDNA切断のいずれかを生成することを発見することにより、TnpBへの関心が新たになっています17,18。しかし、転位の調節においてTnpBがどのような役割を果たすかは不明である。IS608転位に対するTnpBの影響をリアルタイムで可視化するために、赤色蛍光タンパク質mCherryへのN末端融合を有するTnpBのコード領域を含むトランスポゾンのバージョンが作成された。
Kuhlman lab19によって実施されたより詳細なバルクレベルの研究を補完するために、トランスポゾン活性のリアルタイムイメージングが転位ダイナミクスに対するTnpBまたは他のアクセサリータンパク質の影響を定量的に明らかにする方法がここで示されています。TnpBをmCherryに融合させることにより、個々の転位事象を青色蛍光によって同定し、TnpA(黄色蛍光)およびTnpB(赤色蛍光)の発現レベルと相関させる。
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Protocol
1.細菌培養物の調製
- プラスミドトランスポゾン構築物(Kimら8で前述)を含む大腸菌株MG1655を、適切な抗生物質(25 μg/mLのカナマイシン、材料の表を参照)を含むLB中で37°Cで一晩増殖させます。
注:使用されるコンストラクトの配列および関連する配列は、GenBank20 アクセッション番号OP581959、OP581957、OP581958、OP717084、およびOP717085として入手できます。 - 定常状態の指数関数的成長を達成するには、培養液を≥M63培地(100 mM KH 2 PO 4、1 mM MgSO4、1.8 μM FeSO 4、15 mM [NH 4]2SO 4、0.5 μg/mLチアミン[ビタミンB1])に希釈し、炭素源(ここでは0.5%w / vグルコース)と適切な抗生物質(材料の表を参照)を添加します。
- 600 nm(OD600)での光学密度が~0.2に達するまで、37°Cで培養物を成長させます。文化は使用の準備ができています。
2.スライドの準備
- M63を電子レンジで0.5%w / vグルコースと1.5%w / vアガロースで沸騰させてスライドを準備し、アガロースを溶かし、完全に溶融してよく混合されていることを確認します。
- 抗生物質と誘導剤(25 μg/mLカナマイシンと10 ng/μLアンヒドロテトラサイクリン[aTc]、 材料の表を参照)を加える前に、混合物を~55°Cに冷却します。
- 顕微鏡スライドを作業台に置きます。最初のスライドに垂直にさらに2つのスライドを積み重ね、別のスライドを下のスライドと平行に上に配置します。下部スライドと上部スライドの間にスライドの厚さが 1 つに等しい隙間があることを確認します。M63アガロース混合物をスライド間のこの隙間に~1 mLピペットでゆっくりと入れ、小さなゲルの正方形を作成します。
- ゲルが固まったら(~10〜15分)、上部のスライドをスライドさせて取り除きます。かみそりの刃またはナイフでアガロースパッドを切り取ります。次に培養液2.5 μLをピペットで入れ(ステップ1.3)、カバーガラスを上に置きます。
- スライドとカバーガラスの間のスペースをエポキシでシールします( 材料の表を参照)。エポキシを乾燥させ、細胞をアガロースパッド上に37°Cで少なくとも1時間沈降させます。
3. タイムラプス蛍光顕微鏡
- 調製したサンプル(ステップ1.3)を蛍光顕微鏡( 材料表参照)に置き、37°Cに加熱・維持した環境下に置く。
- 画像取得に使用するカメラに適した露出時間を設定します。光退色を最小限に抑えるように照明強度を調整します。
注:本研究では、各波長の2秒の露光時間を使用しました。 - 各波長について、最小蛍光を含む視野(FOV)を見つけます。バックグラウンド減算の解析中に使用する画像を取得します。
- 画像取得に使用するカメラに適した露出時間を設定します。光退色を最小限に抑えるように照明強度を調整します。
- グリッド内の画像を異なる波長で一定の時間間隔で取得するためのプロトコルを設定します。
- タイムラプス写真をプロトコルにエンコードします。取得頻度を希望の時間間隔(ここでは20分)に設定し、合計タイムラプス時間を希望の長さ(24時間)に設定します。
- 適切な波長をプロトコルにエンコードします(使用する構造によって異なります)。
注:mCherry励起ピークは587nmにあり、発光ピークは610nmにあります21;mVenusは515 nmと527 nm12にあり、mCerulean3は433 nmと475 nm11にあります。 - 必要な数のFOV間でキャプチャするグリッドサイズを設定します。
注:ここに示す代表的なデータは、8 x 8 FOVを使用しています。
4. 画像解析
- 各カラーチャンネルで、手順3.1.2で取得したそれぞれの背景画像を使用して、背景減算を実行します。すべての分析ステップでは、オープンソースプラットフォームFiji22 の標準モジュールを使用します( 材料表を参照)。
- mCerulean チャネルを閾値化し、閾値面積を平均細胞面積で割ることにより、各時点における総人口を概算します。
- ユニークな切除イベントをカウントするには、mCerulean3チャネルの時間微分を取ります。これを実行するには、mCerulean3チャネル内の連続する画像を減算します。切除イベントは、蛍光の明るい閃光として時間微分で検出されます。
- 切除イベントのスタックに閾値を付けて、不要な蛍光を排除します。このプロセスでは、切除自体の一部がしきい値化されることに注意してください。これを修正するには、画像を拡張して切除を元のサイズに戻します。
注:同様の閾値化および画像解析技術を使用した分析は、他の蛍光チャネルでも実行できます(たとえば、切除イベントをトランスポザーゼTnpA[黄色の金星蛍光]およびTnpB[赤色のmCherry蛍光]のレベルと相関させます)。
- 切除イベントのスタックに閾値を付けて、不要な蛍光を排除します。このプロセスでは、切除自体の一部がしきい値化されることに注意してください。これを修正するには、画像を拡張して切除を元のサイズに戻します。
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Representative Results
生細胞中のトランスポゾン活性を蛍光顕微鏡で可視化するこの方法は、バルク蛍光測定よりもスループットは低いものの、個々の生細胞におけるトランスポゾン活性を直接可視化することができます。トランスポゾン切除イベントはmCerulean3のプロモーターの再構成をもたらし(図1)、明るい青色蛍光によってトランスポゾン活性を受けている細胞を同定することができます(図2、TnpB+:補足動画1およびTnpB-:補足動画2)。
アクセサリータンパク質TnpBを発現する細胞(図3、オレンジ色)は、そうでない細胞(図3、青色)と比較して4〜5倍高いレベルのトランスポゾン活性を経験することが見出され、より詳細なバルクレベルの研究と一致しています19。 mCherry-tnpB のコード配列を含めるとトランスポゾンの長さが~2,000 bp増加するため、これは特に顕著ですが、以前の研究では、 IS608 トランスポゾンの切除はトランスポゾン長23の指数関数的に減少する関数であることがわかっています。
リアルタイムイメージングの利点は、一度同定されると、転位事象を受けている細胞をさらに追跡および分析して、増殖速度などの他の特徴的なパラメータを決定し、適応度効果の分布またはアクセサリータンパク質の発現レベルを決定して、転位活性への影響を決定できることです。例えば、TnpB+細胞において、トランスポゾン切除事象を受けている細胞は、一般集団よりもmCherry-TnpBの発現レベルが高い(図4A)。さらに、切除イベントを受けている細胞(図4B、濃い黄色)では、TnpB+細胞(図4B、下)は、TnpB-細胞(図4B、上)よりもわずかに高いレベルのVenus-TnpAトランスポザーゼしか発現せず(TnpB-158.3 ± 68.2 AU、TnpB+:193 ± 79.9 AU)、これは一般集団の黄色蛍光(図4B)よりも高い。、淡黄色)。まとめると、これらのデータは、TnpBタンパク質が観察されたより高いレベルの転位活性の原因であることを示唆しています。
図1:トランスポゾン動態のリアルタイムイメージングのための遺伝子構築物。 (A)mCerulean3プロモーターはTEによって破壊され、その末端は左端と右端の欠陥のある回文配列(LE IPおよびRE IP)に隣接しています。トランスポザーゼtnpA(灰色)はPLtetO1から発現し、これはtetリプレッサー(灰色)によって調節され、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)で誘導されます。プロモーター/TE接合部とプロモーター-10および-35配列(赤いボックス)の配列、およびTnpA切断部位を矢印で示しています。(B)TnpB+構築物は、mCherry-tnpBが金星-tnpAに転写的に融合され、両方がポリシストロニックmRNAとして転写され、IS608の自然な配置を模倣している場所です。(C)切除すると、mCerulean3プロモーターが修復され、細胞は青色蛍光を呈する。再構成されたプロモーター配列が図の下に表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トランスポゾン切除イベントの可視化。TnpB+の視野を青色蛍光で検出する直前および(B)直後の細胞(A)を有する。白い矢印は切除イベントを示します。2つのフレームの時間差は20分です。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TnpBはトランスポゾン切除率を高める。TnpB+細胞(オレンジ)およびTnpB-(青色)細胞の切除率。3回の反復の平均率は、95%信頼区間で影付きの領域を持つポイントとして表示されます。データは、細胞がt = 0で切除を開始するように整列されます。TnpB+細胞の最大測定速度は、1時間あたり細胞あたり5.1±2.4 x 10-2イベントでしたが、TnpB-では1時間あたり1.4±0.48 x 10-2イベントでした。示された全区間の平均速度は、TnpB+細胞では1時間あたり2.6 ± 1.8 x 10-2イベント、TnpB-細胞では1時間あたり細胞あたり5.3 ± 2.9 x 10-3イベントでした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:全細胞集団に対する切除細胞のタンパク質発現統計。 各フレームを64等分し、ブロック内の切除細胞および切除活性に関係なくブロック内に含まれるすべての細胞について蛍光を測定した。確率は、Y 軸にプロットされるように、各セル タイプで示された強度のピクセル数をピクセルの総数で割ったものとして測定されます。各フレームのブロック サイズは 445 x 445 ピクセルに設定されました。(A)切除イベントを受ける細胞(暗赤色)は、一般集団(明るい赤色)よりも多くのTnpBを発現します。細胞を切除した場合の平均赤色蛍光は51.3 ± 15.4 AU(暗赤色)であったが、全細胞の平均赤色蛍光は42.5 ± 7.4 AU(淡赤色)であった。(B)金星-TnpAトランスポザーゼレベルは、TnpB-(上)細胞とTnpB+(下)細胞で類似しています。データセットは、全細胞集団の平均黄色蛍光(淡黄色)が105.7AUのTnpB+/-に対して等しくなるように正規化されています。トランスポゾン切除イベントを受けていると同定された細胞(濃い黄色)は、一般集団よりも高い黄色の蛍光を示し、TnpB-(上)とTnpB+(下)の分布は類似しています。切除集団の平均黄色蛍光は、TnpB-:158.3 ± 68.2 AUおよびTnpB+:193 ± 79.9 AUです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足動画1:TnpB発現による IS608 切除のリアルタイムダイナミクス。 リアルタイム IS608 ダイナミクスの5時間のセグメントを示すムービー。フレームは20分ごとにキャプチャされ、IS608の切除は明るい青色の蛍光の発生として視覚化されます。この動画に写っている細胞にはTnpBの発現が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画2:TnpB発現なしの IS608 切除のリアルタイムダイナミクス。 リアルタイム IS608 ダイナミクスの5時間のセグメントを示すムービー。フレームは20分ごとにキャプチャされ、 IS608 の切除は明るい青色の蛍光の発生として視覚化されます。この動画に示されている細胞には、TnpBの発現は含まれていません。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生細胞における転移因子活性のリアルタイムイメージングのためにここで紹介するユニークな方法は、生細胞における転位をリアルタイムで直接検出し、この活性をアクセサリータンパク質の発現と相関させることができる高感度アッセイです。スループットはバルク法で達成できるよりも低くなりますが、この方法では個々の生細胞におけるTE活性とタンパク質発現の詳細な測定が可能になります。
さまざまなツールや技術を使用して、顕微鏡上で直接細胞を増殖させ、リアルタイムイメージングを行うことができます。ここで使用されるアガロースパッド上での細胞増殖の方法は、高速、安価、および実行が容易であるという利点を有する。考えられる欠点は、対象となる細胞増殖状態に応じて、アガロースパッド内の細胞増殖をサポートするために利用可能なリソースが限られているため、細胞が自然にこれらのリソースを使い果たし、比較的短期間(12〜24時間)後に増殖を停止することです。したがって、定常状態で増殖する細胞を準備し、測定に十分な時間を与えるのに十分な低密度でパッドを接種するように注意する必要があります。マイクロフルイディクスは、細胞を長期間にわたって定常状態の指数関数的成長に維持するために使用できますが24、これらの方法を効果的にするには、追加の専門知識、機器、およびセットアップが必要です。
Kuhlman Laboratory19のより詳細な研究を補完すると、IS200/IS605 TEファミリー関連タンパク質TnpBはIS608切除率を最大5倍増加させ、切除の増加はTnpBの発現レベルの上昇と直接相関していることが示されています。これらの方法は、トランスポゾンの活性と突然変異および進化のダイナミクスへの影響を明らかにするのに役立つ可能性のある改良されたアッセイ技術の一例です。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究への財政的支援は、カリフォルニア大学のスタートアップ資金によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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