Lichtinduzierte Dielektrophorese zur Charakterisierung des elektrischen Verhaltens humaner mesenchymaler Stammzellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir die lichtinduzierte Dielektrophorese als markierungsfreien Ansatz zur Charakterisierung heterogener Zelllinien, insbesondere humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSCs), vor. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Verwendung und Optimierung eines mikrofluidischen Geräts mit einer photoleitenden Schicht beschrieben, um das elektrische Verhalten von hMSCs zu charakterisieren, ohne ihren nativen Zustand zu verändern.

Zusammenfassung

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten eine patienteneigene Zellquelle für die Durchführung mechanistischer Studien von Krankheiten oder für verschiedene therapeutische Anwendungen. Das Verständnis der Eigenschaften von hMSC, wie z.B. ihres elektrischen Verhaltens in verschiedenen Reifestadien, hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Die Dielektrophorese (DEP) ist eine Methode, mit der Zellen in einem ungleichmäßigen elektrischen Feld manipuliert werden können, wodurch Informationen über die elektrischen Eigenschaften der Zellen, wie z. B. die Kapazität und Permittivität der Zellmembran, gewonnen werden können. Herkömmliche DEP-Modi verwenden Metallelektroden, wie z. B. dreidimensionale Elektroden, um die Reaktion von Zellen auf DEP zu charakterisieren. In dieser Arbeit stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das mit einer photoleitenden Schicht aufgebaut ist, die in der Lage ist, Zellen durch Lichtprojektionen zu manipulieren, die als virtuelle In-situ-Elektroden mit leicht anpassbaren Geometrien fungieren. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Charakterisierung von hMSCs vorgestellt, das dieses Phänomen demonstriert, das als lichtinduzierte DEP (LiDEP) bezeichnet wird. Wir zeigen, dass LiDEP-induzierte Zellantworten, gemessen als Zellgeschwindigkeiten, durch Variation von Parametern wie der Eingangsspannung, den Wellenlängenbereichen der Lichtprojektionen und der Intensität der Lichtquelle optimiert werden können. In Zukunft stellen wir uns vor, dass diese Plattform den Weg für Technologien ebnen könnte, die markierungsfrei sind und heterogene Populationen von hMSCs oder anderen Stammzelllinien in Echtzeit charakterisieren.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) sind für ihre immunsuppressiven Eigenschaften bekannt¹, die zu ihrer Verwendung in Therapeutika zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten geführt haben, wie z. B. Typ-II-Diabetes², Graft-versus-Host-Krankheit³ und Lebererkrankung⁴. HMSCs sind heterogen und enthalten Subpopulationen von Zellen, die sich in Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten differenzieren. HMSCs werden aus Fettgewebe, Nabelschnurgewebe und Knochenmark gewonnen, und ihr Differenzierungspotenzial hängt vom Ursprungsgewebe und dem verwendeten Zellkulturverfahren ab⁵. Laut einer Studie von Sakaguchi et al. differenzieren sich beispielsweise hMSCs aus Fettgewebe eher zu Adipozyten, während hMSCs aus dem Knochenmark eher zu Osteozyten differenzieren⁶. Der Einfluss des Gewebeursprungs von hMSCs auf ihr Differenzierungspotenzial ist jedoch ein Phänomen, das noch weiter verstanden werden muss. Darüber hinaus tragen die unterschiedlichen Differenzierungspotenziale von hMSCs zu ihrer inhärenten Heterogenität bei und stellen eine Herausforderung bei der Anwendung von hMSCs für Therapeutika dar. Daher ist die Charakterisierung und Sortierung heterogener Stammzelllinien von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung der In-vitro- und klinischen Anwendung dieser Zellen. Die Durchflusszytometrie, die Goldstandardtechnik zur Untersuchung von Unterschieden in zellulären Phänotypen, verwendet Zelloberflächenantigene und Fluoreszenzfarbstoffe, um Zielzellen zu markieren und sie anhand von Lichtstreuung oder zellspezifischen Fluoreszenzeigenschaften zu charakterisieren ^6,7,8. Zu den Nachteilen dieser Methode gehören die begrenzte Verfügbarkeit von Antigen-Biomarkern auf der Zelloberfläche, die hohen Kosten für die Ausrüstung und den Betrieb sowie die Tatsache, dass die Färbung der Zelloberfläche möglicherweise die Zellmembran schädigen und therapeutische Anwendungen beeinträchtigen könnte 9,10,11. Daher könnte die Erforschung neuer Techniken zur Zellcharakterisierung, ohne den nativen Zustand der Zellmembran zu beeinträchtigen, die klinische Leistung von Stammzelltherapeutika verbessern.

Die Dielektrophorese (DEP), eine Methode zur Zellcharakterisierung, die ohne Oberflächenmarkierungen auskommt, steht im Mittelpunkt dieser aktuellen Arbeit. DEP ist eine markierungsfreie oder nicht-färbende Methode, die auf mikrofluidischen Plattformen implementiert wird, um heterogene Zellpopulationen anhand ihrer elektrischen Eigenschaften zu charakterisieren. DEP verwendet ein elektrisches Wechselstromfeld (AC) als Ersatz für die Fluoreszenzfärbung (d. h. eine markierungsbasierte Methode)⁷. Zu den weiteren Vorteilen der Verwendung von DEP-basierten mikrofluidischen Geräten für die Zellcharakterisierung gehören die Verwendung kleiner Volumina (Mikroliter), die schnelle Analysezeit, die minimalen Anforderungen an die Vorbereitung der Zellproben, das minimale Risiko einer Probenkontamination, die minimale Abfallproduktion und die geringen Kosten^12,13. Ein weiterer Vorteil von DEP ist die Echtzeitüberwachung der Zellen^14,15,16. Bei DEP werden Zellen in Suspension einem ungleichmäßigen elektrischen Wechselstromfeld ausgesetzt, das mit Elektroden erzeugt wird, und sie werden polarisiert⁶. Diese Polarisation bewirkt eine Zellbewegung und ermöglicht eine Zellmanipulation basierend auf der Frequenz und Spannung des angelegten elektrischen Wechselfelds. Durch Einstellen der Frequenz, typischerweise zwischen 5 kHz und 20 MHz, können Zellen von den Elektroden angezogen oder von ihnen abgestoßen werden, was einem positiven bzw. negativen DEP-Verhalten entspricht⁶.

Es gibt mehrere Modi der DEP-Charakterisierung, nämlich die traditionelle, die Feldflussfraktionierung und die lichtinduzierte Charakterisierung, die nach ihrer Elektrodenkonfiguration und/oder Betriebsstrategie klassifiziert^{werden 17}. Der 3DEP-Analysator, ein herkömmlicher Modus der DEP, enthält physikalische Metallelektroden und überwacht die zelluläre Reaktion auf ein elektrisches Wechselstromfeld. Dieses System verwendet einen Chip, der aus Mikrotitern mit mehreren dreidimensionalen kreisförmigen Elektroden besteht, und erkennt Änderungen der Lichtintensität, um das DEP-Verhalten der Zellen zu charakterisieren 18,19,20,21. Positives DEP wird beobachtet, wenn sich die Zellen entlang der Wände des Mikrotopfs zu den Rändern der kreisförmigen Elektroden bewegen, was zu einer erhöhten Lichtintensität in der Mitte des Mikrotopfs führt. Negatives DEP wird beobachtet, wenn sich Zellen in der Mitte des Mikrotopfs von den kreisförmigen Elektroden entfernen, was zu einer verringerten Lichtintensität in der Mitte des Mikrotopfs führt. Diese beiden Phänomene sind in Abbildung 1 dargestellt. Herkömmliche DEP-Methoden sind in der Lage, die elektrischen Eigenschaften heterogener Zellpopulationen zu charakterisieren 18,20,21. Zum Beispiel zeigten Mulhall et al. mit dem 3DEP-Analysator das Potenzial, zwischen normalen oralen Keratinozyten (HOK) und malignen oralen Keratinozyten (H357) zu unterscheiden, basierend auf Unterschieden in der Membrankapazität²¹. Eine Einschränkung herkömmlicher DEP-Modi ist jedoch die feste Elektrodengeometrie. Da hMSCs heterogen sind, ist es von Vorteil, die Elektrodengeometrien während der DEP-Bewertung leicht modifizieren zu können. Die Möglichkeit, die Elektroden oder Elektrodenarrays in Echtzeit für das Einfangen einzelner Zellen zu modifizieren, ermöglicht es beispielsweise, die Zellen auf der Grundlage von Geschwindigkeit und DEP-Verhalten zu charakterisieren. Die Anwendung von Echtzeit-Elektrodenmodifikationen bei der DEP-Bewertung von hMSCs ermöglicht die Einzelzellanalyse von hMSCs direkt nach der Gewinnung aus dem Probengewebe, um die Heterogenität der Probenpopulation zu charakterisieren.

Um die Einschränkungen traditioneller DEP-Moden (d. h. fester physikalischer Elektroden) zu überwinden und neue Möglichkeiten für Echtzeit-Modifikationen der Elektrodenkonfiguration unter Verwendung des DEP-Phänomens zu erkunden, wurde das lichtinduzierte DEP (LiDEP) erforscht. LiDEP ist ein nicht-traditioneller DEP-Modus, bei dem Zellen mit einem photoleitenden mikrofluidischen Gerät^22,23 über Lichtprojektionen manipuliert werden, wobei lokalisierte Elektroden ein ungleichmäßiges elektrisches Feld erzeugen^, ähnlich der traditionellen DEP-Methode. Dieser Ansatz ermöglicht auch Flexibilität in der Elektrodengeometrie und beim Bewegen der Elektroden innerhalb des mikrofluidischen Geräts. Dies mildert die Einschränkungen bei festen Elektroden und bietet die Möglichkeit, mehr Informationen über die zelluläre Heterogenität zu erhalten. LiDEP wurde verwendet, um verschiedene Zelltypen in homogenen und heterogenen Zellpopulationen zu detektieren und zu analysieren^22,23,24. Liao et al. nutzten LiDEP beispielsweise, um zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die das Epithelzelladhäsionsmodul (EpCAM^neg) exprimieren, von roten Blutkörperchen zu trennen, um ihre Bedeutung bei der Krebsmetastasierung^{zu untersuchen 22}. Die Einzelzellanalyse mit LiDEP wurde erfolgreich zur Charakterisierung und Manipulation von Krebszellen mit der Stratifizierung der Pankreastumorigenität²³ und der Analyse von CTCs in Proben vor und nach der Metastasierung²⁴ eingesetzt.

Hier beschreiben wir, wie LiDEP verwendet werden kann, um hMSCs mit einer Vielzahl von Elektrodengeometrien (Kreis-, Diamant-, Stern- und parallele Linien) und Systemeinstellungen (angelegte Spannung, Lichtintensität und mikrofluidisches Bauelementmaterial) zu manipulieren, und bieten so einen Ansatz zur Charakterisierung des Verhaltens von humanen Stammzellen mit virtuellen Elektroden.

Protokoll

1. Herstellung von mikrofluidischen LiDEP-Geräten

HINWEIS: Der Herstellungsprozess besteht aus der Kombination von drei Schichtkomponenten: (i) einer photoleitenden Schicht mit amorphem Silizium (A:Si) und Molybdän, die auf einem Indiumzinnoxid (ITO)-Glassubstrat abgeschieden ist; (ii) eine Mikrokanalschicht, die aus doppelseitigem Klebeband ausgeschnitten ist; und (iii) ein oberes ITO-Glassubstrat mit gebohrten Löchern für den Ein- und Auslass der Zellsuspension.

1. Glasbeschichtung aus photoleitfähigem Indiumzinnoxid (ITO)
   1. Reinigen Sie das ITO-beschichtete Glassubstrat (15-20 Ω Widerstand), indem Stickstoff (_{N 2}) mit einer Durchflussrate an der Oberfläche strömt, die ausreicht, um sichtbare Staubpartikel zu bewegen. Spülen Sie nach diesem Schritt den Untergrund mit Aceton ab.
   2. Übertragen Sie den ITO-beschichteten Glasobjektträger in ein Isopropylalkoholbad, um die Acetonrückstände abzuwaschen, spülen Sie ihn mit DI-Wasser ab und lassen Sie erneut N₂ -Gas fließen, bis das Substrat vollständig trocken ist.
   3. Legen Sie den Objektträger mit der ITO-beschichteten Seite nach oben in die Vakuum-Sputteranlage.
   4. Sputtern Sie eine 10 nm dicke Schicht Molybdän mit einer Abscheiderate von 0,7 Å/s und einer Abscheidezeit von 140 s auf das ITO-beschichtete Glassubstrat (Molybdän-Target).
   5. Fügen Sie eine Schattenmaske auf einer Seite des Glassubstrats hinzu, um 2 mm vom Rand des Glassubstrats für elektrische Verbindungen unbedeckt zu lassen. Abscheidung von 1 μm A:Si mittels induktiv gekoppelter Plasma-Plasma-verstärkter chemischer Gasphasenabscheidung (ICP-PECVD), wie in Medjdoub et ^al.25 beschrieben.
   6. Reinigen Sie den Objektträger mit N₂ Gas, um Staub und andere Verunreinigungen zu entfernen. Tauchen Sie bei jedem A:Si, das sich unter der Schattenmaske abgelagert hat, den Rand bis zur 2-mm-Markierung in eine 25%ige w/v-Kaliumhydroxidlösung, um das A:Si zu ätzen.
2. Herstellung von LiDEP-Chips
   1. Um den Mikrokanal zu bilden, besorgen Sie sich doppelseitiges Klebeband (52 mm x 25 mm) und stanzen Sie Löcher (Durchmesser = 4 mm) 5-6 mm vom Rand des kürzeren Maßes entfernt und zentriert zwischen den längeren Seiten des Bandes. Schneiden Sie mit einem Skalpell zwei gerade Linien (im Abstand von 3 mm) über die Löcher. Stellen Sie sicher, dass die Schutzfolien auf beiden Seiten des doppelseitigen Klebebandes während des gesamten Mikrokanal-Schneideschritts angebracht sind.
   2. Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm in den oberen ITO-Objektträger. Das Klebeband kann auf dem ITO-beschichteten Glas ausgerichtet werden, wobei die lange Kante des Bandes mit der langen Kante des Glases ausgerichtet ist. Markieren Sie die Position des Lochs mit einem abwaschbaren Marker. Achte darauf, dass die gebohrten Löcher mit den Löchern im doppelseitigen Klebeband übereinstimmen. Diese beiden Löcher dienen als Einlass- und Auslasslöcher des mikrofluidischen Geräts.
   3. Entfernen Sie eine Seite der Schutzfolie auf dem doppelseitigen Klebeband, richten Sie die Löcher im Klebeband und auf dem oberen ITO-Glasobjektträger aus und drücken Sie sie zusammen. Drücken Sie vorsichtig, um Lufteinschlüsse zu entfernen, insbesondere in der Nähe des Mikrokanals. Lufteinschlüsse können dazu führen, dass das Medium oder andere Lösungen unter das Klebeband sickern, was das mikrofluidische Gerät beschädigen oder Schimmel verursachen kann.
   4. Entfernen Sie die andere Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband und drücken Sie sie auf die Molybdän- und A:Si-beschichtete ITO-Glasseite. Passen Sie die Kante des fotoleitenden Objektträgers, die der 2-mm-Abstandsseite gegenüberliegt, an die Kante des doppelseitigen Klebebandes an, das sich in der Mitte des oberen ITO-Glasobjektträgers befindet. Es wird einen Kater von der oberen ITO-Glasrutsche und der photoleitenden, materialbeschichteten ITO-Glasrutsche geben.
   5. Auf eine ebene Fläche drücken, um eine gute Haftung zu gewährleisten. Eine schematische Darstellung des Glassubstrats und der doppelseitigen Bandschichten ist in Abbildung 1A dargestellt. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband an der Seite ab.
   6. Bringen Sie Kupferband an den Kanten von Schicht A und Schicht C an, um den Funktionsgenerator anzuschließen. Wickeln Sie dazu das Klebeband auf der Seite des ITO oder des photoleitenden Materials, je nachdem, ob es sich um Schicht A oder Schicht C handelt, vom Rand des doppelseitigen Klebebandes bis etwa 3 cm auf die unbeschichtete Seite des Glassubstrats.
   7. Um eine erfolgreiche Herstellung des Geräts sicherzustellen, verwenden Sie ein Multimeter, um einen Widerstandswert zwischen den beschichteten Objektträgern beider Glassubstrate und dem Kupferband, das am Glas befestigt war, zu testen.
3. Vorbereitung des DEP-Puffers
   1. Messen Sie 4,25 g Saccharose ab und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Messen Sie dann 0,15 g Glukose ab und geben Sie sie in dasselbe konische 50-ml-Röhrchen.
   2. Füllen Sie das konische Röhrchen mit 25 ml Reinstwasser, schließen Sie den Deckel und mischen Sie. Sobald sich etwa die Hälfte der Saccharose und der Glukose aufgelöst hat, füllen Sie das konische Röhrchen bis zur 50-ml-Linie mit Reinstwasser. Kräftig mischen, bis sich die gesamte Saccharose und Glukose aufgelöst haben. Die DEP-Pufferlösung enthält 8,5 % (w/v) Saccharose und 0,3 % (w/v) Glukose.
   3. Nehmen Sie 20 ml der vorbereiteten Saccharose- und Glukoselösung und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Messen Sie dann 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) ab und geben Sie es in das konische 50-ml-Röhrchen mit der Saccharose- und Glukoselösung. Wirbeln, bis sich die BSA aufgelöst hat. Die endgültige DEP-Pufferlösung enthält 0,5 % (w/v) BSA.
4. Zellvorbereitung
   1. Mindestens 1 x 10^{6 Zellen (}hMSCs oder HEK 293) werden in 1 ml Wachstumsmedium suspendiert, wobei das in früheren Studien beschriebene Zellkulturprotokoll verwendet^{wird 26,27}. Geben Sie die Zellsuspension in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Zentrifugieren Sie die HEK 293-Zellen bei 201 x g für 5 min und die hMSCs bei 290 x g für 10 min. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in 1 ml der DEP-Pufferlösung mit 0,5 % BSA resuspendiert. Achten Sie darauf, die Pufferlösung nicht zu schnell hinzuzufügen, da sich Blasen bilden können.
   3. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang noch zwei weitere Male und resuspendieren Sie dann die Zellen im DEP-Puffer mit 0,5 % BSA zur LiDEP-Charakterisierung. Das aufgeführte Zellvorbereitungsprotokoll reicht für 10 Durchläufe. Zum Beispiel erfordert ein Frequenztest mindestens 15 Durchläufe, und daher müssen 2 ml Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml hergestellt werden.

2. LiDEP-Charakterisierung

1. Versuchsaufbau
   1. Stellen Sie die folgenden Geräte für den Versuchsaufbau zur Quantifizierung der zellulären Reaktionen auf LiDEP zusammen: einen Laptop, einen Projektor, eine Objektivlinse, ein digitales Mikroskop und einen Funktionsgenerator. Verwenden Sie den Laptop, um die Lichtprojektionen (Stern, Diamant, drei Linien und Oval) zu entwerfen, und schließen Sie ihn an den Projektor an.
   2. Verwenden Sie den Projektor als Lichtquelle, um die Lichtprojektionen auf die photoleitende Oberfläche (Schicht C) des LiDEP-Chips anzuzeigen. Richten Sie es so ein, dass das Licht von der Lichtquelle (Projektor) durch eine 10-fach-Objektivlinse auf den Mikrokanalbereich des LiDEP-Chips gelangt. Die 10-fach-Objektivlinse sitzt auf der Projektorlinse. Die ergänzende Abbildung 1 zeigt die Integration des Projektors in das LiDEP-System.
   3. Verbinden Sie den LiDEP-Chip mit dem Funktionsgenerator, um das elektrische Wechselfeld anzulegen. Beobachten Sie die Zellen, die der LiDEP-Kraft ausgesetzt sind, indem Sie das digitale Mikroskop für die Bildgebung und Videoaufzeichnung verwenden. Abbildung 1B zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsapparatur. Befolgen Sie die Standard-Zellkulturprotokolle^26,27 für alle getesteten Zellen.
2. Experimentelle Verfahren
   1. Spülen Sie den Mikrokanal mit 70 % Ethanol, gefolgt von 0,5 % BSA-Lösung. Spülen Sie den Mikrokanal noch zweimal mit 0,5%iger BSA-Lösung, um sicherzustellen, dass das Ethanol und die vorherigen Zellen vollständig weggespült werden. Zellen, die bereits dem DEP-Feld ausgesetzt waren, reagieren anders als frische Zellen und können die Datenerfassung stören.
   2. Entfernen Sie die 0,5%ige BSA-Lösung mit einer Pipette und setzen Sie das mikrofluidische Gerät in die Gerätehalterung ein.
   3. Befestigen Sie Krokodilklemmen an jedem der Kupferbandanschlüsse am Gerät. Stellen Sie den Funktionsgenerator auf die gewünschte Spannung (Spannung Spitze-Spitze, V_pp) und Frequenz (Hz) ein. Der hier getestete Frequenzbereich lag bei 30 kHz bis 20 MHz.
   4. Geben Sie 70 μl Zellsuspension (Zellen + DEP-Pufferlösung mit 0,5 % BSA) in den Mikrokanal des Geräts. Aufgrund der geringen Dicke des Mikrokanals (~0,05 mm) kann es zu einem Auslaufen aus den Einlass- und Auslasslöchern kommen. Um das Verschütten zu reduzieren, verwenden Sie eine kleinere Pipettenspitze und kippen Sie die Spitze leicht in das Loch in Richtung des Mikrokanals. Jede Zugangslösung (0,5 % BSA oder Zellen in Lösung) kann mit Einweg-Papiertüchern abgewischt und in biologisch gefährlichen Abfällen entsorgt werden.
   5. Projizieren Sie die gewünschte virtuelle Elektrodengeometrie (hier Kreise, Diamanten, Sterne und/oder parallele Linien) auf den LiDEP-Chip.
   6. Stellen Sie in der Digitalmikroskop-Software die Videolänge auf 3 Minuten ein. Stellen Sie einen Labor-Timer auf 2 Minuten 30 s ein. Sobald die Zellen im Mikrokanal des LiDEP-Chips stationär sind, drücken Sie in der Digitalmikroskop-Software auf Start , um den Videoaufzeichnungsprozess zu starten.
   7. Warten Sie 10 Sekunden, drücken Sie dann die ON-Taste des Kanalausgangs des Funktionsgenerators, um das elektrische Wechselfeld anzulegen, und drücken Sie Start für den Timer. Überwachen Sie das DEP-Verhalten der Zelle durch das digitale Mikroskop und verhindern Sie Verwacklungen oder Bewegungen im Aufbau.
   8. Sobald der Timer abgelaufen ist, drücken Sie die ON-Taste des Kanalausgangs des Funktionsgenerators. Dadurch wird der Kanalausgang des Funktionsgenerators abgeschaltet und das elektrische Wechselfeld wird nicht mehr über die Elektroden zugeführt. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung nach 3 Minuten und speichern Sie sie zur späteren Analyse auf dem digitalen Mikroskop.
   9. Pipettieren Sie die Zellen aus dem Auslassende des LiDEP-Chips, indem Sie langsam 60 μl DEP-Puffer mit 0,5 % BSA in den Mikrokanal drücken und gleichzeitig am Auslass sammeln. Fahren Sie fort, bis sich wenig bis gar keine Zellen mehr im Mikrokanal befinden.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3-2.2.9, bis alle Frequenzen getestet wurden.

Ergebnisse

Die Spannungs- und Elektrodenfarbprüfungen wurden mit dem obigen Verfahren durchgeführt, mit einer geringfügigen Abweichung in den Schritten 2.2.3 und 2.2.10. Für die Spannungsprüfung blieben die Farbe und Frequenz der Elektrode konstant und es wurden 5 V pp, 10 V pp und 20 V_pp angelegt. Für den Elektrodenfarbtest wurden die angelegte Spannung und Frequenz bei 30 kHz und 20 V_pp konstant gehalten, und blaue, rote, weiße und gelbe (referenziert durch die HEX-Farbcodes #4472C4, #FF0000, #FFFFFF bzw. #FFFF00) projizierten Elektroden wurden untersucht. Die Viabilität der Zellen wurde untersucht, indem die Zellen mit Trypanblau gefärbt und die Anzahl der lebenden und toten Zellen mit einem Hämozytometer gezählt wurde.

Mit dem LiDEP-Aufbau waren wir in der Lage, die hMSCs zu manipulieren und DEP-Antwortkurven in Abhängigkeit von der Eingangsfrequenz zu erzeugen, was eine Möglichkeit ist, das elektrische Verhalten von Zellen zu charakterisieren. Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die optimalen Betriebsbedingungen zu finden, indem Parameter wie die angelegte Spannung und die projizierte Elektrodenfarbe (d. h. Formen mit unterschiedlichen Farben, die mit einer Grafikeditor-Software erstellt wurden) manipuliert wurden, um ein konsistentes Zellverhalten gegenüber dem ungleichmäßigen elektrischen Wechselstromfeld zu beobachten, das mit den virtuellen Elektroden erzeugt wird. Die Daten, die für Zellantworten mit LiDEP, nicht-traditionellem DEP, gesammelt wurden, wurden mit den Ergebnissen des 3DEP-Analysators, herkömmlichem DEP, verglichen.

Der erste Optimierungstest konzentrierte sich auf die positive DEP-Antwort von hMSCs (d.h. den Zellen, die sich auf die virtuelle Elektrode zubewegen) im LiDEP-Chip. Die Zellen, die keine positive DEP-Antwort zeigten, zeigten entweder eine negative DEP-Antwort, indem sie sich von der virtuellen Elektrode wegbewegten, waren stationär und rotierten oder reagierten nicht auf das elektrische Feld. Die Reaktion der Zellen wurde quantifiziert, indem ihre Geschwindigkeiten (μm/s) in ImageJ über einen Zeitraum von 2 Minuten und 30 s verfolgt wurden. Für die virtuelle Elektrode wurde eine gelbe ovale Projektion verwendet, und die angelegten Spannungen von 5 V pp, 10 V pp und 20 V_pp wurden bei einer eingestellten Frequenz von 30 kHz untersucht. Wir konzentrierten uns auf Zellen, die sich innerhalb von 50 μm von der virtuellen Elektrode befanden, während das elektrische Wechselfeld eingeschaltet war, um die Konsistenz zu gewährleisten und Ausreißer zu minimieren. Die 20 V pp führten mit einer mittleren Geschwindigkeit von 0,035 μm/s zur schnellsten Zellbewegung der HEK 293-Zellen, gefolgt von 0,032 μm/s bei 10 V pp und 0,020 μm/s bei 5 V_pp, was bedeutet, dass diese Zellen eine relativ homogene Steuerung darstellen. Ein ähnlicher Trend wurde für hMSCs beobachtet, die eine mittlere Geschwindigkeit von 0,051 μm/s bei 20 V pp, 0,036 μm/s bei 10 V pp und 0,025 μm/s bei 5_{V pp} aufwiesen, wie in Abbildung 2A dargestellt (hier steht * für p < 0,05). Bei 20 V_pp wurde beobachtet, dass die hMSCs gleichzeitig eine positive und eine negative DEP erfuhren. Dies wurde bei 10 V pp und 5 V pp nicht beobachtet. Die Viabilitätsergebnisse der hMSCs nach dem Erleben der DEP-Kraft zeigten, dass höhere Spannungen im Allgemeinen zu einer geringeren Zellviabilität führten, wobei 66 % der Zellen bei 5 V pp, 58 % der Zellen bei 10 V pp und 57 % der Zellen bei 20 V _pp lebensfähig waren_. wie in Abbildung 2B (hier steht ** für p < 0,01).

Da es sich bei LiDEP um ein optisches System handelt, sind die Lichtintensität und die Elektrodenfarbe Parameter, die leicht eingestellt werden können, um die Leistung des LiDEP-Chips zu steuern. Hier wurden verschiedene Elektrodenfarben (weiß, gelb, rot und blau), die basierend auf der projizierten Form erzeugt wurden, ausgewertet, um die Auswirkungen auf die DEP-Antworten der Zellen zu bestimmen. HEK 293 Zellen und hMSCs wurden bei 20 V_pp und 30 kHz evaluiert. Es wurden weiße, gelbe, rote und blaue Elektroden gewählt, aber die Beleuchtung durch den LiDEP-Chip wurde durch die photoleitende Schicht beeinflusst, die eine rot-orange Farbe hatte. So erschien die projizierte weiße Elektrode gelb mit einem weißen Inneren, die rote Elektrode orange mit einem roten Umriss und die blaue Elektrode hellgrün (Abbildung 3A-D). Die Ausgangsleistung für diese vier Farben war wie folgt: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW bzw. 56,7 μW ± 0,9 μW für Weiß, Gelb, Rot und Blau. Dies deutet stark darauf hin, dass Gelb und Weiß das stärkste DEP-Feld aufwiesen, während Blau und Rot schwächer waren, wie in Abbildung 3E (hier zeigt *** p < 0,001 für HEK 293-Zellen und ** p < 0,01 für hMSCs an). Eine stationäre Rotation der Zellen an den Rändern der gelben und weißen virtuellen Elektroden während des Aufbringens der DEP-Kraft wurde ebenfalls beobachtet. Bei allen Farbvariationen der Elektroden traten gleichzeitig negative und positive DEP-Reaktionen auf, die mit dem korrelierten, was bei 20 V_pp für den Spannungstest gezeigt wurde. Während die Geschwindigkeit der Zellen je nach Elektrodenfarbe variierte, reagierten fast alle Zellen innerhalb der 50-μm-Grenze auf LiDEP. Die Größe der hMSCs wurde mit 19,2 μm ± 5,8 μm gemessen.

Um die Leistungsfähigkeit von LiDEP im Vergleich zu DEP mit konventionellen Elektroden zu beurteilen, untersuchten wir die Unterschiede zwischen dem DEP-Verhalten von Zellen, die LiDEP verwenden, und dem von Zellen, die mit dem 3DEP-Analysator analysiert wurden. Die DEP-Antwort von hMSCs wurde in einer DEP-Pufferlösung mit niedriger Leitfähigkeit und 0,5% BSA (~100 μS/cm) gemessen. Um den 3DEP-Analysator nachzuahmen, wurde eine einzelne ovale gelbe virtuelle Elektrode auf 10 V_pp projiziert. Das DEP-Verhalten der hMSCs wurde von 30 kHz bis 20 MHz charakterisiert. Bei Frequenzen unterhalb von 25 kHz beobachteten wir eine Elektrolyse, die zu einer Blasenbildung an der Oberfläche der Metallschicht innerhalb des mikrofluidischen Geräts führte. Bei LiDEP erfuhren die hMSCs bei niedrigeren Frequenzen eine positive DEP-Kraft, wie in Abbildung 4A, dargestellt als Prozentsatz der Zellen, die von der virtuellen Elektrode angezogen werden. Die Zellen begannen mit einer starken positiven DEP-Kraft, die mit zunehmender Frequenz schwächer wurde. Die Zellen erfuhren die stärkste positive DEP-Kraft von 30 kHz bis 97 kHz. Nach dem Anlegen des elektrischen Wechselfelds bei diesen Frequenzen reagierten einige Zellen nicht mehr, während andere Zellen ein negatives DEP-Verhalten zeigten. Dieser Trend weicht von der beobachteten Reaktion ab, die mit dem 3DEP-Analysator quantifiziert wurde. Die Zellen erhöhten den positiven DEP von 37 kHz auf 255 kHz und verringerten den positiven DEP von 1.772 kHz auf 20 MHz, wie in Abbildung 4B dargestellt.

Abbildung 1: Versuchsaufbau für das hier beschriebene LiDEP-Protokoll für hMSCs. (A) Schematisches und reales Bild des LiDEP-Chips mit der photoleitenden Schicht und dem Versuchsaufbau. (B) Repräsentative Bilder positiver und negativer DEP-Antworten von Zellen im 3DEP-Analysator (unter Verwendung herkömmlicher DEP-Elektroden, oben) und schematische Darstellung positiver und negativer DEP-Antworten von Zellen mit LiDEP (unter Verwendung von Lichtprojektionen als virtuelle Elektroden, unten). (C) Beispiele für verschiedene Formen, die als virtuelle Elektroden auf das Gerät projiziert werden können. Figur erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Charakterisierung der DEP-Antworten (Geschwindigkeit) von hMSCs und ihrer Viabilität unter den gegebenen Bedingungen. (A) Die gemessenen Geschwindigkeiten der positiven DEP-Antworten von hMSCs auf 5 V pp, 10 V pp und 20 V _pp. Die hMSCs bewegten sich mit 0,051 μm/s bei 20 V pp, 0,036 μm/s bei 10 V pp und 0,025 μm/s bei 5 V_pp. (B) Die Lebensfähigkeit der hMSCs nach dem Erleben der positiven DEP-Kraft, die mit virtuellen Elektroden erzeugt wird. Die Viabilität betrug 57 %, 58 % bzw. 66 % für 20 V pp, 10 V pp bzw. 5 V_pp. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Statistische Analyse an gepoolten Datensätzen mit t-Tests (*p < 0,05 und **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vergleich der DEP-Antworten zwischen homogenen (HEK 293) und heterogenen (hMSCs) Zelllinien. Positive DEP-Reaktion von hMSC-Zellen auf (A) weiße, (B) gelbe, (C) rote und (D) blaue Elektroden bei 20 V_pp und 30 kHz. (E) Geschwindigkeitsreaktionen von HEK 293 Zellen und hMSCs auf die verschiedenfarbigen Elektroden. Die Zellen des HEK 293 zeigten mit den gelben und roten Elektroden mit 0,035 μm/s bzw. 0,033 μm/s die höchsten Geschwindigkeiten. Die Zellen des HEK 293 zeigten mit den blauen Elektroden mit 0,027 μm/s die geringste Geschwindigkeit. Die hMSCs zeigten mit den gelben und weißen Elektroden mit 0,068 μm/s bzw. 0,049 μm/s die höchsten Geschwindigkeiten. Die hMSCs wiesen mit den roten Elektroden mit 0,039 μm/s die niedrigste Geschwindigkeit auf. Die Fehlerbalken stellen die SD dar. Statistische Analyse, die an gepoolten Datensätzen mithilfe von t-Tests (*p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001) durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Vergleich der DEP-Antworten von hMSCs mit LiDEP und 3DEP. Die DEP-Antworten von hMSCs, gemessen mit (A) LiDEP und (B) dem 3DEP-Analysator bei 10 V_pp. Bei LiDEP kam es zu einem Abfall der positiven DEP-Antwort der hMSCs von 30 kHz auf 20 MHz. Mit dem 3DEP-Analysator stieg die positive DEP der Zellen von 37 kHz auf 255 kHz und die positive DEP von 1.772 kHz auf 20 MHz ab. Fehlerbalken stellen die SD dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder des LiDEP-Aufbaus, der für die Experimente in diesem Protokoll verwendet wurde. Vergrößertes Bild des LiDEP-Systems, das die Integration des Projektors zeigt. Das Licht wandert von der Quelle (Projektor) durch eine 10-fache Objektivlinse auf den Mikrokanal des LiDEP-Chips. Das 10-fach-Objektiv sitzt auf der Oberseite des Projektorobjektivs. Jedes Bauteil ist auf den Bildern nummeriert und auf der Seite aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Repräsentatives Video von hMSCs, die auf die weißen, gelben, roten und blauen virtuellen Elektroden reagieren. Die Zellen werden so visualisiert, dass sie ein positives DEP erfahren (sich auf die virtuelle Elektrode zubewegen), ein negatives DEP erfahren (sich von der virtuellen Elektrode wegbewegen), stationär und rotierend sind oder nicht auf das elektrische Feld reagieren. Die hMSCs wurden bei 37 kHz und 20 V_pp getestet, und das Video wurde um das 20-fache beschleunigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Untersuchung der Heterogenität von hMSCs ist wichtig für ihre Weiterentwicklung in der Therapeutik. Diese Arbeit stellt einen ersten Schritt dar, um LiDEP als analytisches Werkzeug für die Bewertung von hMSCs zu nutzen. Wir untersuchten die Spannungsabhängigkeit der positiven DEP-Antwort von Zellen in LiDEP, indem wir die Geschwindigkeit quantifizierten. Es wird erwartet, dass höhere Spannungen eine stärkere positive DEP-Kraft erzeugen sollten, und wir haben dieses Muster mit den gemessenen Geschwindigkeiten beobachtet. Die Spannungen von 10_{V pp} und 20 V_pp waren für die Manipulation von hMSCs mittels LiDEP ausreichend. Niedrigere Spannungen (d. h. 5 V_pp) führten zu langsameren Zellantworten; Dies ist zwar nicht optimal für hMSCs, könnte aber für andere Zelltypen von Vorteil sein. Es kam zu einer spannungsabhängigen Abnahme der Viabilität der hMSCs um ca. 9%. Dies unterscheidet sich geringfügig von der bisherigen Literatur 6,12,28,29^, in der die Verwendung von herkömmlichem DEP und LiDEP bei der Untersuchung biologischer Zellen die Zellviabilität nicht verringerte. Das experimentelle Ziel in jeder Studie variierte. Glasser und Fuhr beobachteten das Wachstum adhärenter L929-Mausfibroblasten auf Metallelektroden in Zellkulturmedium²⁸. Umgekehrt untersuchten Lu et al. die Lebensfähigkeit von neuralen Stammzellen, die über verschiedene Zeiträume elektrischen Wechselfeldern ausgesetzt waren¹². Adams et al. charakterisierten die dielektrischen Eigenschaften von hMSCs mit Metallelektroden¹² und Li et al. manipulierten Leukämiezellen mit LiDEP²⁹. Der Unterschied zwischen diesen Studien und unseren Studien war die Verwendung von BSA, die die Ursache für die von uns beobachtete Abnahme der Lebensfähigkeit sein könnte. Die geringere Gesamtlebensfähigkeit kann jedoch auch auf die im hier etablierten Protokoll verwendete Belichtungszeit (2 min 30 s) zurückzuführen sein. Diese Zeit wurde gewählt, um genügend Zeit zu haben, um die Zellmanipulation während der Exposition gegenüber dem ungleichmäßigen elektrischen Wechselstromfeld zu visualisieren.

Die Methoden der Zellcharakterisierung wurden anhand der Elektrodenfarbe getestet, um die Fähigkeiten und Grenzen unseres LiDEP-Systems zu bestimmen, das wie im Protokoll beschrieben aufgebaut ist. In diesem speziellen Protokoll kann die Elektrodenfarbe basierend auf der Farbe der Form gesteuert werden, die über eine Grafikeditordatei projiziert wird. Wir haben vier Farben verwendet: Weiß, Gelb, Rot und Blau. Anhand der Leistungsmessungen für jede Farbe wurden die projizierten gelben (#FFFF00) und weißen (#FFFFFF) Elektroden mit höheren Intensitäten gemessen, was die Grundlage dafür war, warum diese Farben für die nachfolgenden Experimente günstiger waren. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse aufgrund der nachgewiesenen Lichtintensitätsabhängigkeit von photoleitenden Materialien^30,31 darauf hin, dass die Leistung von LiDEP-Bauelementen von photoleitendem A:Si abhängt und durch die Wahl der projizierten Elektrodenfarbe eingestellt werden kann. Eine Kombination aus positiven und negativen DEP-Antworten von hMSCs wurde auch mit LiDEP beobachtet, was dem Phänomen ähnelt, das bei herkömmlichen DEP-Methoden beobachtet wird. Mit jeder Elektrodenfarbe erfuhren die hMSCs eine negative DEP-Kraft, eine positive DEP-Kraft und eine Zellrotation, was darauf hindeutet, dass die Zellprobe bei einer einzigen Frequenz heterogen war (Ergänzendes Video 1). Dies stimmt mit den Erkenntnissen von Adams et ^al.6 überein, dass hMSCs sowohl negatives als auch positives DEP-Verhalten bei einer einzigen Frequenz zeigen. Diese Bedingungen (Elektrodenfarbe, Elektrodenform und photoleitendes Material) können zusätzliche Parameter für die Bestimmung des Heterogenitätsgrades in hMSC-Proben liefern.

Abschließend wurden die Ergebnisse des LiDEP-Assessments mit den Ergebnissen des 3DEP-Analysators als Benchmark für das hMSC-DEP-Verhalten verglichen. Es wurde ein Unterschied im Frequenzbereich der positiven DEP-Antwort von hMSCs beobachtet, aber die Trends in den mit LiDEP und dem 3DEP-Analysator gesammelten Daten waren insgesamt ähnlich (d.h. die positive DEP-Antwort nahm mit zunehmender Frequenz ab). Wenn das elektrische Wechselfeld dem LiDEP-Chip zugeführt und Licht darauf projiziert wurde, sank die Leitfähigkeit im Bereich innerhalb der Lichtprojektion, wodurch ein ungleichmäßiges elektrisches Feld entstand. Daher beeinflussen die Eigenschaften der Lichtquelle (d. h. Intensität und Wellenlänge) die erwartete Reaktion der Zellen innerhalb des LiDEP-Chips, wie aus den Ergebnissen der Spannungs- und Elektrodenfarbvariationstests hervorgeht. Weitere Parameter, die verändert werden können, sind das Material der photoleitenden Schicht und die Leitfähigkeit der DEP-Pufferlösung. Daher müssen die Bedingungen, die zur Bewertung des DEP-Verhaltens von Zellen verwendet werden, auf der Grundlage des Aufbaus des LiDEP-Systems bewertet werden. Umgekehrt sind die Eigenschaften der Elektrode beim 3DEP-Analysator oder anderen Methoden, bei denen Metallelektroden zur Aufbringung der DEP-Kraft verwendet werden, konstant und können nicht sofort variiert werden, um sich an die Anforderungen der zu untersuchenden Zellen anzupassen. Diese Variation des positiven DEP-Verhaltens könnte für zukünftige Forschungen zur Charakterisierung verschiedener Zelltypen in hMSC-Proben, zur Einzelzellanalyse oder zur Zellsortierung von Vorteil sein. Je weiter sich die Zellen von den virtuellen Elektroden entfernen, desto schwächer wird das elektrische Wechselstromfeld. Mit dem 3DEP-Analysator oder anderen herkömmlichen DEP-Modi, die Metallelektroden verwenden, kann jedoch ein größerer elektrischer Feldbereich angelegt werden, wodurch mehr Zellen manipuliert werden können. Daher erfuhren weniger Zellen pro LiDEP-Experiment die Auswirkungen des elektrischen Wechselfelds im Mikrokanal des LiDEP-Chips. Weitere Diskrepanzen können durch Änderungen der Geräteleistung im Laufe der Zeit (d. h. 2 h oder 3 h) verursacht werden, die noch untersucht werden. Der konstante Fluss von Wasser, Ethanol und DEP-Pufferlösung könnte die Oberfläche der Mikrokanalschicht (d. h. des photoleitenden Materials) aufbrechen und muss berücksichtigt werden. Die Leistung des Geräts im Laufe der Zeit für die Zellcharakterisierung muss auch für die erweiterte Verwendung eines LiDEP-Chips berücksichtigt werden. Änderungen an den experimentellen Parametern in Echtzeit dauerten nur wenige Sekunden bis Minuten. Die Farbe und Geometrie der Elektroden wurden sofort über die Einstellungen in der Grafikeditor-Software angepasst.

Zusammenfassend demonstriert diese Arbeit die Fähigkeiten von LiDEP, eine Zelllinie mit heterogenen Zellpopulationen wie hMSCs zu manipulieren und zu charakterisieren. Mit diesem Aufbau und dem beschriebenen Protokoll konnten wir die erfolgreiche Charakterisierung von hMSCs unter den Bedingungen von 20 V_pp und projizierten virtuellen gelben Elektroden erreichen. Zukünftige Studien sollten sich darauf konzentrieren, die Belichtungszeit der hMSCs an das durch LiDEP erzeugte elektrische Wechselfeld anzupassen, die Lichtintensität der virtuellen Elektroden zu erhöhen und verschiedene Quellen von hMSCs (oder anderen Stammzellpopulationen) zu bewerten, um einen LiDEP-Katalog der elektrischen Signaturen heterogener Stammzellpopulationen zu entwickeln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
10x Objektiv	AmScope	---
Amorphes Silizium (A:Si)	Millipore Sigma	S5130
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Gibco	15240-062
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher	BP9706-100
Kupferband		BF4964
Dextrose (Glukose)	Fisher	D16-1
Digitalmikroskop	Keyence	VHX-7000
Doppelseitiges Tape	Insulectro	FLX000484
Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14190-144
Fetel Rinderserum (FBS)	Corning	35-011-CV
Funktionsgenerator	Tektronix	AFG 31102
Grafikeditor-Software	Microsoft Office Powerpoint	---
Indiumzinn oxidec beschichtete Glasobjektträger	Mitgeliefert	GL0333
L-Alanyl-L-Glutamin	ATCC	PCS-999-034
Laptop	Dell	Inspiron 14, 2-in-1
mesenchymale Stammzelle Basal Medium	ATCC	PCS-500-030
Mesenchymales Stammzell-Wachstumskit für aus Nabelschnur und Fettstrang gewonnene MSCs	ATCC	PCS-500-040
Minimum Essentielles Mediaum Alpha (MEM A, 1X)	Giblo	A10490-01
Molybdän, 99,95%	Kurt J. Lesker	EJTMOXX352A4	Sputtertarget
Phenol Red	Sigma	P5530
Leistungsmesser	Thor Labs	S130VC/PM400
Projektor	Vecupoi	---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media	Gibco	11875-093	Dieses Medium enthält L-Glutamin und Phenolrot.
Saccharose	Fisher	BP220-1
Trypanblauer Fleck	Gibco	15250-061	0,40%
Trypsin-Neutralisator	Gibco	R002100
Vakuum-Sputtersystem	Denton	DV-502M