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Bioengineering

Diélectrophorèse induite par la lumière pour caractériser le comportement électrique des cellules souches mésenchymateuses humaines

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64909
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,2,3,4, 1,2,4
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

Summary

Ici, nous présentons la diélectrophorèse induite par la lumière comme une approche sans marquage pour caractériser des lignées cellulaires hétérogènes, en particulier les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh). Cet article décrit un protocole d’utilisation et d’optimisation d’un dispositif microfluidique avec une couche photoconductrice pour caractériser le comportement électrique des hMSC sans altérer leur état natif.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) offrent une source cellulaire dérivée du patient pour mener des études mécanistiques de maladies ou pour plusieurs applications thérapeutiques. Comprendre les propriétés hMSC, telles que leur comportement électrique à différents stades de maturation, est devenu plus important ces dernières années. La diélectrophorèse (DEP) est une méthode qui peut manipuler des cellules dans un champ électrique non uniforme, grâce à laquelle des informations peuvent être obtenues sur les propriétés électriques des cellules, telles que la capacité et la permittivité de la membrane cellulaire. Les modes traditionnels de DEP utilisent des électrodes métalliques, telles que des électrodes tridimensionnelles, pour caractériser la réponse des cellules à la DEP. Dans cet article, nous présentons un dispositif microfluidique construit avec une couche photoconductrice capable de manipuler des cellules par des projections lumineuses qui agissent comme des électrodes virtuelles in situ avec des géométries facilement conformables. Un protocole est présenté ici qui démontre ce phénomène, appelé DEP induit par la lumière (LiDEP), pour caractériser les CSMh. Nous montrons que les réponses cellulaires induites par LiDEP, mesurées en tant que vitesses cellulaires, peuvent être optimisées par des paramètres variables tels que la tension d’entrée, les gammes de longueurs d’onde des projections lumineuses et l’intensité de la source lumineuse. À l’avenir, nous envisageons que cette plate-forme pourrait ouvrir la voie à des technologies sans marquage et effectuer une caractérisation en temps réel de populations hétérogènes de CSMh ou d’autres lignées de cellules souches.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) sont reconnues pour leurs propriétés immunosuppressives1, qui ont conduit à leur utilisation dans des traitements thérapeutiques pour le traitement de diverses maladies, telles que le diabète de typeII 2, la maladie du greffon contre l’hôte3 et la maladie du foie4. Les HMSC sont hétérogènes et contiennent des sous-populations de cellules qui se différencient en adipocytes, chondrocytes et ostéoblastes. Les HMSC sont dérivés du tissu adipeux, du tissu du cordon ombilical et de la moelle osseuse, et leur potentiel de différenciation dépend du tissu d’origine et du procédé de culture cellulaire utilisé5. Par exemple, selon une étude de Sakaguchi et al., les CSMh dérivées du tissu adipeux sont plus susceptibles de se différencier en adipocytes, tandis que les CSMh dérivées de la moelle osseuse sont plus susceptibles de se différencier enostéocytes6. Cependant, l’impact de l’origine tissulaire des CSMh sur leur potentiel de différenciation est un phénomène qui doit encore être mieux compris. En outre, les divers potentiels de différenciation des CSMh contribuent à leur hétérogénéité inhérente et créent des défis dans l’application des CSMh pour les traitements. En tant que tel, la caractérisation, ainsi que le tri, des lignées de cellules souches hétérogènes sont essentiels pour développer l’application in vitro et clinique de ces cellules. La cytométrie en flux, la technique de référence pour examiner les différences dans les phénotypes cellulaires, utilise des antigènes de surface cellulaire et des colorants fluorescents pour marquer les cellules cibles et les caractériser en fonction de la diffusion de la lumière ou des caractéristiques de fluorescence spécifiques aux cellules 6,7,8. Les inconvénients de cette méthode comprennent la disponibilité limitée de biomarqueurs d’antigènes de surface cellulaire, le coût élevé de l’équipement et du fonctionnement, et le fait que la coloration de la surface cellulaire pourrait potentiellement endommager la membrane cellulaire et affecter les applications thérapeutiques 9,10,11. Par conséquent, l’exploration de nouvelles techniques de caractérisation cellulaire sans compromettre l’état natif de la membrane cellulaire pourrait améliorer la performance clinique des thérapies à base de cellules souches.

La diélectrophorèse (DEP), une méthode de caractérisation cellulaire qui n’utilise pas d’étiquettes de surface, est au centre de ces travaux actuels. La DEP est une méthode sans marquage ou sans coloration mise en œuvre sur des plateformes microfluidiques pour caractériser des populations hétérogènes de cellules en fonction de leurs propriétés électriques. Le DEP utilise un champ électrique à courant alternatif (CA) en remplacement de la coloration par fluorescence (c.-à-d. une méthode basée sur l’étiquette)7. Les autres avantages de l’utilisation de dispositifs microfluidiques à base de DEP pour la caractérisation des cellules comprennent l’utilisation de petits volumes (microlitres), le temps d’analyse rapide, les exigences minimales en matière de préparation des échantillons cellulaires, le risque minimal de contamination des échantillons, la production minimale de déchets et le faible coût12,13. Un autre avantage de la DEP est la surveillance en temps réel des cellules14,15,16. Pour le DEP, les cellules en suspension sont exposées à un champ électrique alternatif non uniforme créé avec des électrodes, et elles deviennent polarisées6. Cette polarisation provoque le mouvement des cellules et permet la manipulation des cellules en fonction de la fréquence et de la tension du champ électrique AC appliqué. En ajustant la fréquence, généralement comprise entre 5 kHz et 20 MHz, les cellules peuvent être attirées ou repoussées loin des électrodes, correspondant à un comportement DEP positif et négatif, respectivement6.

Il existe plusieurs modes de caractérisation DEP, à savoir traditionnel, fractionnement par écoulement de champ et mode induit par la lumière, classés selon leur configuration d’électrode et/ou leur stratégie opérationnelle17. L’analyseur 3DEP, un mode traditionnel de DEP, intègre des électrodes métalliques physiques et surveille la réponse cellulaire à un champ électrique AC. Ce système utilise une puce constituée de micropuits avec de multiples électrodes circulaires tridimensionnelles et détecte les changements d’intensité lumineuse pour caractériser le comportement DEPdes cellules 18,19,20,21. La DEP positive est observée lorsque les cellules se déplacent vers les bords des électrodes circulaires le long des parois du micropuits, ce qui entraîne une augmentation de l’intensité lumineuse au centre du micropuits. La DEP négative est observée lorsque les cellules se regroupent au centre du micropuits, loin des électrodes circulaires, ce qui entraîne une diminution de l’intensité lumineuse au centre du micropuits. Ces deux phénomènes sont représentés à la figure 1. Les méthodes traditionnelles de DEP ont la capacité de caractériser les propriétés électriques de populations cellulaires hétérogènes 18,20,21. Par exemple, Mulhall et al. ont démontré le potentiel de distinguer entre les kératinocytes oraux normaux (HOK) et les lignées cellulaires de kératinocytes oraux malins (H357) en fonction des différences de capacitémembranaire 21 à l’aide de l’analyseur 3DEP. Cependant, une limitation des modes traditionnels de DEP est la géométrie fixe de l’électrode. Étant donné que les CSMh sont hétérogènes, il est avantageux d’avoir la possibilité de modifier facilement les géométries des électrodes lors des évaluations DEP. Par exemple, le fait de pouvoir modifier les électrodes ou les réseaux d’électrodes en temps réel pour le piégeage d’une seule cellule permet de caractériser les cellules en fonction de la vitesse et du comportement DEP. L’application de la modification des électrodes en temps réel dans les évaluations DEP des CSMh permet l’analyse unicellulaire des CSMh juste après leur prélèvement dans le tissu échantillon afin de caractériser l’hétérogénéité de la population échantillonnée.

Pour surmonter les limites des modes traditionnels de DEP (c.-à-d. électrodes physiques fixes) et explorer de nouvelles possibilités de modifications de la configuration des électrodes en temps réel à l’aide du phénomène DEP, la DEP induite par la lumière (LiDEP) a été explorée. LiDEP est un mode non traditionnel de DEP qui manipule des cellules à l’aide d’un dispositif microfluidique photoconducteur22,23 via des projections lumineuses, des électrodes localisées créent un champ électrique non uniforme, similaire à la méthode DEP traditionnelle. Cette approche permet également une flexibilité dans la géométrie des électrodes et pour déplacer les électrodes dans le dispositif microfluidique. Cela atténue la limitation observée avec les électrodes fixes et offre la possibilité d’obtenir plus d’informations sur l’hétérogénéité cellulaire. Le LiDEP a été utilisé pour détecter et analyser différents types de cellules dans des populations homogènes et hétérogènes de cellules22,23,24. Par exemple, Liao et al. ont utilisé LiDEP pour séparer les cellules tumorales circulantes (CTC) exprimant le module d’adhésion des cellules épithéliales (EpCAMneg) des globules rouges afin d’explorer leur signification dans les métastases cancéreuses22. L’analyse unicellulaire avec LiDEP a été utilisée avec succès pour caractériser et manipuler les cellules cancéreuses avec la stratification de la tumorigénicité pancréatique23 et l’analyse des CTC dans des échantillons pré et post-métastases24.

Ici, nous décrivons comment LiDEP peut être utilisé pour manipuler des hMSC avec une variété de géométries d’électrodes (cercle, losange, étoile et lignes parallèles) et de paramètres système (tension appliquée, intensité lumineuse et matériau de dispositif microfluidique), offrant ainsi une approche pour caractériser le comportement des cellules souches d’origine humaine avec des électrodes virtuelles.

Protocol

1. Fabrication de dispositifs microfluidiques LiDEP

NOTE: Le procédé de fabrication consiste à combiner trois composants en couches: (i) une couche photoconductrice avec du silicium amorphe (A:Si) et du molybdène déposés sur un substrat de verre d’oxyde d’indium-étain (ITO); ii) une couche de microcanaux découpée dans du ruban adhésif double face; et iii) un substrat de verre ITO supérieur avec des trous percés pour l’entrée et la sortie de la suspension cellulaire.

  1. Revêtement de verre d’oxyde d’indium-étain photoconducteur (ITO)
    1. Nettoyez le substrat de verre revêtu d’ITO (résistance de 15 à 20 Ω) en faisant circuler de l’azote (N2) gazeux à la surface à un débit suffisant pour déplacer les particules de poussière visibles. Après cette étape, rincez le substrat avec de l’acétone.
    2. Transférer la lame de verre revêtue d’ITO dans un bain d’alcool isopropylique pour éliminer les résidus d’acétone, rincer à l’eau DI et faire couler à nouveau le gazN2 jusqu’à ce que le substrat soit complètement sec.
    3. Placez la lame de verre avec le côté recouvert d’ITO vers le haut dans le système de pulvérisation sous vide.
    4. Pulvériser une couche de molybdène de 10 nm d’épaisseur sur le substrat de verre recouvert d’ITO (cible de molybdène) avec un taux de dépôt de 0,7 Å/s et un temps de dépôt de 140 s.
    5. Ajoutez un masque d’ombre sur un côté du substrat de verre pour laisser 2 mm du bord du substrat de verre découvert pour les connexions électriques. Déposer 1 μm d’A:Si par dépôt chimique amélioré plasma-plasma à couplage inductif (ICP-PECVD), tel que décrit dans Medjdoub et coll.25.
    6. Nettoyez la lame avec du gazN2 pour éliminer la poussière et autres impuretés. Pour tout A:Si déposé sous le masque d’ombre, immerger le bord jusqu’à la marque de 2 mm dans une solution d’hydroxyde de potassium à 25 % p/v pour graver l’A:Si.
  2. Fabrication de dispositifs à puce LiDEP
    1. Pour former le microcanal, procurez-vous du ruban adhésif double face (52 mm x 25 mm) et des trous de perforation (diamètre = 4 mm) à 5-6 mm du bord de la dimension la plus courte et centrés entre les côtés les plus longs du ruban. Utilisez un scalpel pour couper deux lignes droites (3 mm l’une de l’autre) à travers les trous. Assurez-vous que les feuilles de protection sur les deux faces du ruban double face sont en place pendant toute l’étape de coupe du microcanal.
    2. Percez deux trous de 3 mm de diamètre dans la lame de verre ITO supérieure. Le ruban peut être aligné sur le verre revêtu d’ITO, le long bord du ruban s’alignant sur le long bord du verre. Marquez l’emplacement du trou avec un marqueur lavable. Assurez-vous que les trous percés s’alignent avec les trous perforés dans le ruban adhésif double face. Ces deux trous serviront de trous d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique.
    3. Retirez un côté du film protecteur sur le ruban adhésif double face, alignez les trous du ruban et de la lame de verre ITO supérieure, puis pressez-les ensemble. Appuyez doucement pour retirer les poches d’air, en particulier près du microcanal. Les poches d’air peuvent permettre au milieu ou à d’autres solutions de s’infiltrer sous le ruban, ce qui peut endommager ou provoquer des moisissures dans le dispositif microfluidique.
    4. Retirez l’autre film protecteur du ruban adhésif double face et appuyez sur le côté en verre ITO revêtu de molybdène et de A:Si. Faites correspondre le bord de la lame photoconductrice opposé au côté de dégagement de 2 mm au bord du ruban double face qui se trouve vers le centre de la lame de verre ITO supérieure. Il y aura la gueule de bois de la lame de verre ITO supérieure et de la lame de verre ITO revêtue d’un matériau photoconducteur.
    5. Appuyez sur une surface plane pour assurer une bonne adhérence. Un schéma du substrat de verre et des couches de ruban adhésif double face est illustré à la figure 1A. Coupez l’excès de ruban adhésif sur le côté.
    6. Appliquez du ruban de cuivre sur les bords de la couche A et de la couche C pour connecter le générateur de fonctions. Pour ce faire, enroulez le ruban adhésif sur le côté de l’ITO ou du matériau photoconducteur, selon qu’il s’agit de la couche A ou de la couche C, du bord du ruban double face à environ 3 cm sur le côté non revêtu du substrat en verre.
    7. Pour assurer la réussite de la fabrication de l’appareil, utilisez un multimètre pour tester une lecture de résistance entre les lames revêtues des deux substrats de verre et le ruban de cuivre qui a été fixé au verre.
  3. Préparation du tampon DEP
    1. Mesurez 4,25 g de saccharose et placez-le dans un tube conique de 50 mL. Ensuite, mesurez 0,15 g de glucose et placez-le dans le même tube conique de 50 mL.
    2. Remplissez le tube conique avec 25 ml d’eau ultrapure, fermez le couvercle et mélangez. Une fois qu’environ la moitié du saccharose et du glucose sont dissous, remplissez le tube conique avec de l’eau ultrapure jusqu’à la ligne de 50 mL. Mélanger vigoureusement jusqu’à ce que tout le saccharose et le glucose soient dissous. La solution tampon DEP contient 8,5 % (p/v) de saccharose et 0,3 % (p/v) de glucose.
    3. Obtenez 20 mL de la solution préparée de saccharose et de glucose et placez-la dans un tube conique de 50 mL. Ensuite, mesurez 0,1 g d’albumine sérique bovine (BSA) et placez-la dans le tube conique de 50 mL contenant la solution de saccharose et de glucose. Vortex jusqu’à dissolution du BSA. La solution tampon DEP finale contient 0,5 % (p/v) de BSA.
  4. Préparation cellulaire
    1. Obtenir au moins 1 x 106 cellules (hMSCs ou HEK 293) en suspension dans 1 mL de milieu de croissance en utilisant le protocole de culture cellulaire décrit dans les études précédentes26,27. Placez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 10 mL.
    2. Centrifuger les cellules HEK 293 à 201 x g pendant 5 min et les hMSC à 290 x g pendant 10 min. Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de la solution tampon DEP avec 0,5% de BSA. Assurez-vous de ne pas ajouter la solution tampon trop rapidement car des bulles peuvent se former.
    3. Répétez le processus de centrifugation deux fois de plus, puis remettez en suspension les cellules dans le tampon DEP avec 0,5% BSA pour la caractérisation LiDEP. Le protocole de préparation cellulaire répertorié est suffisant pour 10 exécutions. Par exemple, un test de fréquence nécessite au moins 15 essais et, par conséquent, 2 mL de cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL doivent être effectués.

2. Caractérisation LiDEP

  1. Configuration expérimentale
    1. Assembler l’équipement suivant pour l’installation expérimentale de quantification des réponses cellulaires au LiDEP : un ordinateur portable, un projecteur, une lentille d’objectif, un microscope numérique et un générateur de fonctions. Utilisez l’ordinateur portable pour concevoir les projections lumineuses (étoile, losange, trois lignes et ovale) et connectez-le au projecteur.
    2. Utilisez le projecteur comme source lumineuse pour afficher les projections lumineuses sur la surface photoconductrice (couche C) de la puce LiDEP. Configurez-le de sorte que la lumière de la source lumineuse (projecteur) se déplace à travers une lentille d’objectif 10x sur la région du microcanal de la puce LiDEP. L’objectif 10x se trouve au-dessus de l’objectif du projecteur. La figure supplémentaire 1 montre l’intégration du projecteur dans le système LiDEP.
    3. Connectez la puce LiDEP au générateur de fonctions pour appliquer le champ électrique AC. Observez les cellules subissant la force LiDEP en utilisant le microscope numérique pour l’imagerie et l’enregistrement vidéo. La figure 1B montre un schéma de l’appareil expérimental. Suivez les protocoles de culture cellulaire standard26,27 pour toutes les cellules testées.
  2. Procédures expérimentales
    1. Rincer le microcanal avec de l’éthanol à 70 %, puis avec une solution de BSA à 0,5 %. Rincez à nouveau le microcanal avec une solution de BSA à 0,5 % deux fois de plus pour vous assurer que l’éthanol et les cellules précédentes sont complètement éliminés. Les cellules qui ont déjà été exposées au champ DEP réagiront différemment des cellules fraîches et peuvent perturber la collecte de données.
    2. Retirez la solution de BSA à 0,5 % à l’aide d’une pipette et insérez le dispositif microfluidique dans le support de l’appareil.
    3. Fixez des pinces crocodiles à chacune des connexions de ruban de cuivre de l’appareil. Réglez le générateur de fonctions sur la tension souhaitée (tension crête à crête, Vpp) et fréquence (Hz). La gamme de fréquences testée ici était de 30 kHz à 20 MHz.
    4. Ajouter 70 μL de suspension cellulaire (cellules + solution tampon DEP avec 0,5% de BSA) dans le microcanal du dispositif. En raison de la minceur du microcanal (~0,05 mm), des déversements par les trous d’entrée et de sortie peuvent se produire. Pour aider à réduire la quantité de déversement, utilisez une pointe de pipette plus petite et inclinez légèrement la pointe dans le trou vers le microcanal. Toute solution d’accès (0,5% de BSA ou cellules en solution) peut être essuyée avec des lingettes en papier à usage unique et jetée dans les déchets biologiques dangereux.
    5. Projetez la géométrie de l’électrode virtuelle souhaitée (ici, cercles, diamants, étoiles et/ou lignes parallèles) sur la puce LiDEP.
    6. Dans le logiciel de microscope numérique, réglez la durée de la vidéo sur 3 min. Réglez une minuterie de laboratoire sur 2 min 30 s. Une fois que les cellules sont stationnaires dans le microcanal de la puce LiDEP, appuyez sur Démarrer dans le logiciel de microscope numérique pour commencer le processus d’enregistrement vidéo.
    7. Attendez 10 secondes, puis appuyez sur le bouton ON de la sortie du canal du générateur de fonction pour appliquer le champ électrique CA, puis appuyez sur Démarrer pour la minuterie. Surveillez le comportement DEP de la cellule à l’aide du microscope numérique et empêchez les secousses ou les mouvements autour de la configuration.
    8. Une fois la minuterie désactivée, appuyez sur le bouton ON de la sortie du canal du générateur de fonctions. Cela éteint la sortie du canal du générateur de fonction et le champ électrique CA n’est plus fourni par les électrodes. Arrêtez l’enregistrement vidéo à 3 minutes et enregistrez-le au microscope numérique pour une analyse ultérieure.
    9. Pipeter les cellules hors de l’extrémité de sortie de la puce LiDEP en poussant lentement 60 μL de tampon DEP avec 0,5% de BSA dans le microcanal et en collectant simultanément à la sortie. Continuez jusqu’à ce qu’il y ait peu ou pas de cellules dans le microcanal.
    10. Répétez les étapes 2.2.3 à 2.2.9 jusqu’à ce que toutes les fréquences aient été testées.

Representative Results

Les essais de tension et de couleur des électrodes ont été effectués en utilisant la procédure ci-dessus avec une légère variation aux étapes 2.2.3 et 2.2.10. Pour le test de tension, la couleur et la fréquence de l’électrode sont restées constantes, et 5 V pp, 10 V pp et 20 Vpp ont été appliqués. Pour le test de couleur des électrodes, la tension et la fréquence appliquées ont été maintenues constantes à 30 kHz et 20 Vpp, et les électrodes projetées bleues, rouges, blanches et jaunes (référencées par les codes de couleur HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF et #FFFF00, respectivement) ont été examinées. La viabilité cellulaire a été examinée en colorant les cellules avec du bleu de trypan et en comptant le nombre de cellules vivantes et mortes à l’aide d’un hémocytomètre.

Avec la configuration LiDEP, nous avons pu manipuler les hMSC et générer des courbes de réponse DEP en réponse à la fréquence d’entrée, ce qui est une façon de caractériser le comportement électrique des cellules. Une série d’expériences ont été menées pour trouver les conditions de fonctionnement optimales en manipulant des paramètres tels que la tension appliquée et la couleur de l’électrode projetée (c’est-à-dire des formes avec des couleurs distinctes créées avec un logiciel d’éditeur graphique) pour observer le comportement cohérent des cellules au champ électrique alternatif non uniforme généré avec les électrodes virtuelles. Les données recueillies pour les réponses cellulaires à l’aide de LiDEP, la DEP non traditionnelle, ont été comparées aux résultats de l’analyseur 3DEP, la DEP traditionnelle.

Le premier test d’optimisation s’est concentré sur la réponse DEP positive des hMSC (c’est-à-dire les cellules se déplaçant vers l’électrode virtuelle) dans la puce LiDEP. Les cellules ne présentant pas de réponse DEP positive affichaient une réponse DEP négative en s’éloignant de l’électrode virtuelle, étaient stationnaires et en rotation, ou ne répondaient pas au champ électrique. La réponse des cellules a été quantifiée en suivant leurs vitesses (μm/s) dans ImageJ pendant une période de 2 min 30 s. Une projection ovale jaune a été utilisée pour l’électrode virtuelle, et les tensions appliquées de 5 V pp, 10 V pp et 20 Vpp ont été examinées à une fréquence définie de 30 kHz. Nous nous sommes concentrés sur les cellules situées à moins de 50 μm de l’électrode virtuelle pendant que le champ électrique CA était activé pour assurer la cohérence et minimiser les valeurs aberrantes. Le 20 V pp a entraîné le mouvement cellulaire le plus rapide des cellules HEK 293, avec une vitesse moyenne de 0,035 μm/s, suivi de 0,032 μm/s à 10 V pp et de 0,020 μm/s à 5 Vpp, ce qui signifie que ces cellules représentent un contrôle relativement homogène. Une tendance similaire a été observée pour les CSMh, qui avaient une vitesse moyenne de 0,051 μm/s à 20 V pp, 0,036 μm/s à 10 V pp et 0,025 μm/s à 5 Vpp, comme le montre la figure 2A (ici, * indique p < 0,05). À 20 Vpp, il a été observé que les CSMh présentaient simultanément une DEP positive et négative. Cela n’a pas été observé à 10 V pp et 5 V pp. Les résultats de viabilité des hMSC après avoir subi la force DEP ont montré que des tensions plus élevées entraînaient généralement une viabilité cellulaire plus faible, avec 66% des cellules viables à 5 V pp, 58% des cellules viables à 10 V pp et 57% des cellules viables à 20 V pp, comme dans la figure 2B (ici, ** indique p < 0,01).

LiDEP étant un système optique, l’intensité lumineuse et la couleur de l’électrode sont des paramètres qui peuvent être facilement réglés pour contrôler les performances de la puce LiDEP. Ici, différentes couleurs d’électrodes (blanc, jaune, rouge et bleu) générées en fonction de la forme projetée ont été évaluées pour déterminer l’effet sur les réponses DEP des cellules. Les cellules HEK 293 et les CSMh ont été évaluées à 20 Vpp et 30 kHz. Des électrodes de couleur blanche, jaune, rouge et bleue ont été choisies, mais l’éclairage à travers la puce LiDEP a été affecté par la couche photoconductrice, qui avait une couleur rouge-orange. Ainsi, l’électrode blanche projetée apparaissait jaune avec un intérieur blanc, l’électrode rouge apparaissait orange avec un contour rouge et l’électrode bleue apparaissait vert clair (Figure 3A-D). Les puissances de sortie pour ces quatre couleurs étaient les suivantes : 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW et 56,7 μW ± 0,9 μW pour le blanc, le jaune, le rouge et le bleu, respectivement. Cela suggère fortement que le jaune et le blanc avaient le champ DEP le plus fort, tandis que le bleu et le rouge étaient plus faibles, comme dans la figure 3E (ici, *** indique p < 0,001 pour les cellules HEK 293 et ** indique p < 0,01 pour les hMSC). Une rotation stationnaire des cellules sur les bords des électrodes virtuelles jaunes et blanches lors de l’application de la force DEP a également été observée. Pour toutes les variations de couleur des électrodes, des réponses DEP négatives et positives simultanées se sont produites, corrélées à ce qui a été montré à 20 Vpp pour l’essai de tension. De plus, alors que la vitesse des cellules variait en fonction de la couleur de l’électrode, presque toutes les cellules situées dans la limite de 50 μm répondaient au LiDEP. La taille des CSM a été mesurée entre 19,2 μm ± 5,8 μm.

Pour évaluer la capacité du LiDEP par rapport au DEP avec des électrodes conventionnelles, nous avons évalué les différences entre le comportement DEP des cellules utilisant le LiDEP et celui des cellules analysées par l’analyseur 3DEP. La réponse DEP des CSMh a été mesurée dans une solution tampon DEP à faible conductivité avec 0,5% de BSA (~100 μS/cm). Pour imiter l’analyseur 3DEP, une seule électrode virtuelle ovale jaune a été projetée à 10 Vpp. Le comportement DEP des hMSC a été caractérisé de 30 kHz à 20 MHz. À des fréquences inférieures à 25 kHz, nous avons observé une électrolyse, ce qui a entraîné la génération de bulles à la surface de la couche métallique à l’intérieur du dispositif microfluidique. Pour le LiDEP, à des fréquences plus basses, les CSMh ont subi une force DEP positive, comme dans la figure 4A, représentée par le pourcentage de cellules attirées par l’électrode virtuelle. Les cellules ont commencé avec une forte force DEP positive, qui s’est affaiblie à mesure que la fréquence augmentait. Les cellules ont subi la force DEP positive la plus forte de 30 kHz à 97 kHz. Après avoir appliqué le champ électrique AC à ces fréquences, certaines cellules ne répondaient plus, tandis que d’autres cellules présentaient un comportement DEP négatif. Cette tendance s’écarte de la réponse observée quantifiée à l’aide de l’analyseur 3DEP ; les cellules ont augmenté en DEP positive de 37 kHz à 255 kHz et ont diminué en DEP positive de 1 772 kHz à 20 MHz, comme le montre la figure 4B.

Figure 1
Figure 1 : Configuration expérimentale du protocole LiDEP décrite ici pour les hMSC. (A) Image schématique et réelle de la puce LiDEP avec la couche photoconductrice et la configuration expérimentale. (B) Images représentatives des réponses DEP positives et négatives des cellules dans l’analyseur 3DEP (utilisant des électrodes DEP conventionnelles, en haut) et représentation schématique des réponses DEP positives et négatives des cellules utilisant LiDEP (en utilisant des projections lumineuses comme électrodes virtuelles, en bas). (C) Exemples de formes différentes qui peuvent être projetées sur l’appareil sous forme d’électrodes virtuelles. Figure créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation des réponses DEP (vitesse) des CSMh et de leur viabilité dans les conditions données. (A) Les vitesses mesurées des réponses DEP positives des CSMh à 5 V pp, 10 V pp et 20 V pp. Les CSMh se déplaçaient à 0,051 μm/s à 20 V pp, 0,036 μm/s à 10 V pp et 0,025 μm/s à 5 Vpp. (B) La viabilité des hMSC après avoir subi la force DEP positive générée avec des électrodes virtuelles. La viabilité était de 57 %, 58 % et 66 % pour 20 V pp, 10 V pp et 5 Vpp, respectivement. Les barres d’erreur représentent l’écart type (ET). Analyse statistique effectuée sur des ensembles de données regroupées à l’aide de tests t (*p < 0,05 et **p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des réponses DEP entre des lignées cellulaires homogènes (HEK 293) et hétérogènes (hMSCs). Réponse DEP positive des cellules hMSC aux électrodes (A) blanches, (B) jaunes, (C) rouges et (D) bleues à 20 Vpp et 30 kHz. (E) Réponses de vitesse des cellules HEK 293 et des hMSC aux différentes électrodes colorées. Les cellules HEK 293 présentaient les vitesses les plus élevées, les électrodes jaune et rouge étant respectivement de 0,035 μm/s et 0,033 μm/s. Les cellules HEK 293 présentaient la vitesse la plus faible avec les électrodes bleues à 0,027 μm/s. Les hMSC présentaient les vitesses les plus élevées, les électrodes jaunes et blanches étant respectivement de 0,068 μm/s et 0,049 μm/s. Les hMSC ont connu la vitesse la plus faible avec les électrodes rouges à 0,039 μm/s. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Analyse statistique effectuée sur des ensembles de données regroupées à l’aide de tests t (*p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Comparaison des réponses DEP des CSMh utilisant LiDEP et 3DEP. Les réponses DEP des CSMh mesurées avec (A) LiDEP et (B) l’analyseur 3DEP à 10 Vpp. Avec le LiDEP, il y a eu une diminution de la réponse DEP positive des CSM de 30 kHz à 20 MHz. À partir de l’analyseur 3DEP, les cellules ont augmenté en DEP positive de 37 kHz à 255 kHz et ont diminué en DEP positive de 1 772 kHz à 20 MHz. Les barres d’erreur représentent le SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Images représentatives de la configuration LiDEP utilisée pour les expériences de ce protocole. Image agrandie du système LiDEP montrant l’intégration du projecteur. La lumière se déplace de la source (projecteur) à travers une lentille d’objectif 10x sur le microcanal de la puce LiDEP. L’objectif 10x se trouve au-dessus de l’objectif du projecteur. Chaque composant est numéroté dans les images et répertorié sur le côté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo représentative des CSMh répondant aux électrodes virtuelles blanches, jaunes, rouges et bleues. Les cellules sont visualisées comme subissant une DEP positive (se déplaçant vers l’électrode virtuelle), une DEP négative (s’éloignant de l’électrode virtuelle), stationnaire et en rotation, ou ne répondant pas au champ électrique. Les hMSC ont été testés à 37 kHz et 20 Vpp, et la vidéo a été accélérée de 20x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’examen de l’hétérogénéité des CSMh est important pour leur avancement thérapeutique. Ce travail fournit une première étape pour l’utilisation du LiDEP comme outil analytique pour l’évaluation des CSMh. Nous avons examiné la dépendance à la tension de la réponse DEP positive des cellules dans LiDEP en quantifiant la vitesse. On s’attend à ce que des tensions plus élevées produisent une force DEP positive plus forte, et nous avons observé cette tendance avec les vitesses mesurées. Les tensions de 10 V pp et 20 Vpp étaient suffisantes pour la manipulation des hMSC à l’aide de LiDEP. Des tensions plus faibles (c.-à-d. 5 Vpp) ont entraîné des réponses cellulaires plus lentes; Bien que cela ne soit pas optimal pour les CSMh, cela pourrait être avantageux pour d’autres types de cellules. Il y a eu une diminution dépendante de la tension de la viabilité des CSM d’environ 9 %. Cela diffère légèrement de la littérature précédente 6,12,28,29, dans laquelle l’utilisation de DEP et de LiDEP traditionnels dans l’examen des cellules biologiques n’a pas diminué la viabilité cellulaire. Cependant, l’objectif expérimental de chaque étude variait. Glasser et Fuhr ont surveillé la croissance de fibroblastes de souris L929 adhérents sur des électrodes métalliques dans un milieu de culture cellulaire28. Inversement, Lu et al. ont examiné la viabilité des cellules souches neurales exposées aux champs électriques AC pendant différentes périodesde temps 12. Adams et al. ont caractérisé les propriétés diélectriques des CSMh avec des électrodes métalliques12, et Li et al. manipulé des cellules leucémiques avec LiDEP29. La différence entre ces études et les nôtres était l’utilisation de BSA, qui peut être la cause de la diminution de la viabilité que nous avons observée. Cependant, la viabilité globale plus faible peut également être due au temps d’exposition (2 min 30 s) utilisé dans le protocole établi ici. Ce temps a été choisi pour fournir suffisamment de temps pour visualiser la manipulation des cellules pendant l’exposition au champ électrique alternatif non uniforme.

Les méthodes de caractérisation des cellules ont été testées via la couleur de l’électrode pour déterminer les capacités et les limites de notre système LiDEP construit comme décrit dans le protocole. Dans ce protocole spécifique, la couleur de l’électrode peut être contrôlée en fonction de la couleur de la forme projetée via un fichier d’éditeur graphique. Nous avons utilisé quatre couleurs : blanc, jaune, rouge et bleu. À partir des lectures de puissance de sortie pour chaque couleur, les électrodes jaunes (#FFFF00) et blanches (#FFFFFF) projetées ont été mesurées pour avoir des intensités plus élevées, ce qui a été la raison pour laquelle ces couleurs étaient plus favorables à utiliser dans les expériences ultérieures. De plus, en raison de la dépendance établie de l’intensité lumineuse des matériaux photoconducteurs30,31, les résultats suggèrent que la performance des dispositifs LiDEP repose sur A:Si photoconductrice et peut être réglée par le choix de la couleur de l’électrode projetée. Une combinaison de réponses DEP positives et négatives des CSM a également été observée à l’aide du LiDEP, ce qui est similaire au phénomène observé dans les méthodes DEP traditionnelles. Avec chaque couleur d’électrode, les CSh ont subi une force DEP négative, une force DEP positive et une rotation cellulaire, ce qui indique que l’échantillon de cellule était hétérogène à une fréquence unique (vidéo supplémentaire 1). Cela concorde avec les conclusions d’Adams et coll.6 selon lesquelles les CSMh présentent un comportement DEP négatif et positif à une fréquence unique. Ces conditions (couleur de l’électrode, forme de l’électrode et matériau photoconducteur) peuvent fournir des paramètres supplémentaires pour détecter le niveau d’hétérogénéité dans les échantillons hMSC.

Enfin, les résultats de l’évaluation LiDEP ont été comparés aux résultats de l’analyseur 3DEP comme référence du comportement de la DEP hMSC. Une différence dans la gamme de fréquences de la réponse DEP positive des CSMh a été observée, mais les tendances dans les données recueillies via le LiDEP et l’analyseur 3DEP étaient similaires dans l’ensemble (c.-à-d. que la réponse DEP positive diminuait avec l’augmentation de la fréquence). Lorsque le champ électrique AC a été fourni à la puce LiDEP et que la lumière a été projetée dessus, la conductance dans la zone de projection lumineuse a chuté, créant un champ électrique non uniforme. Par conséquent, les caractéristiques de la source lumineuse (c.-à-d. l’intensité et la longueur d’onde) influencent la réponse attendue des cellules dans la puce LiDEP, comme le montrent les résultats des tests de variation de tension et de couleur des électrodes. D’autres paramètres qui peuvent être modifiés sont le matériau de la couche photoconductrice et la conductivité de la solution tampon DEP. En tant que tel, les conditions utilisées pour évaluer le comportement DEP des cellules doivent être évaluées en fonction de la configuration du système LiDEP. Inversement, pour l’analyseur 3DEP, ou d’autres méthodes qui utilisent des électrodes métalliques pour appliquer la force DEP, les caractéristiques de l’électrode sont constantes et ne peuvent pas être modifiées instantanément pour s’adapter à ce qui est nécessaire pour les cellules étudiées. Cette variation du comportement positif de DEP pourrait être bénéfique pour les recherches futures sur la caractérisation de différents types de cellules dans les échantillons hMSC, l’analyse de cellules uniques ou le tri cellulaire. De plus, à mesure que les cellules s’éloignent des électrodes virtuelles, le champ électrique AC devient plus faible. Cependant, avec l’analyseur 3DEP ou d’autres modes DEP traditionnels qui utilisent des électrodes métalliques, une plus grande région de champ électrique peut être appliquée, ce qui permet de manipuler plus de cellules. Par conséquent, moins de cellules par expérience LiDEP ont subi les effets du champ électrique AC dans le microcanal de la puce LiDEP. D’autres écarts peuvent être causés par des changements dans le rendement de l’appareil au fil du temps (c.-à-d. 2 h ou 3 h), qui font toujours l’objet d’une enquête. Le débit constant d’eau, d’éthanol et de solution tampon DEP pourrait décomposer la surface de la couche de microcanaux (c.-à-d. le matériau photoconducteur) et doit être pris en compte. Les performances du dispositif au fil du temps pour la caractérisation des cellules doivent également être prises en compte pour l’utilisation prolongée d’une puce LiDEP. Les modifications apportées aux paramètres expérimentaux en temps réel n’ont pris que quelques secondes à quelques minutes. La couleur et les géométries des électrodes ont été ajustées instantanément à l’aide des paramètres du logiciel d’édition graphique.

En résumé, cet article démontre les capacités du LiDEP à manipuler et à caractériser une lignée cellulaire avec des populations cellulaires hétérogènes telles que les hMSC. En utilisant cette configuration et le protocole décrit, nous avons pu réaliser la caractérisation réussie des hMSC dans les conditions de 20 Vpp et d’électrodes jaunes virtuelles projetées. Les études futures devraient se concentrer sur l’ajustement du temps d’exposition des hMSC au champ électrique AC créé via LiDEP, l’augmentation de l’intensité lumineuse des électrodes virtuelles et l’évaluation de différentes sources de hMSC (ou d’autres populations de cellules souches) pour développer un catalogue LiDEP des signatures électriques des populations hétérogènes de cellules souches.

Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le prix CAREER de la National Science Foundation (2048221) via CBET. Nous tenons à remercier Mo Kebaili du Centre de recherche intégré sur les nanosystèmes (INRF) de l’UCI. De plus, nous tenons à remercier le Dr Devin Keck pour son aide au développement du système LiDEP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
10x objective AmScope ---
Amorphous silicon (A:Si) Millipore Sigma S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9706-100
Copper Tape Zehhe BF4964
Dextrose (glucose) Fisher D16-1
Digital microscope Keyence VHX-7000
Double Sided Tape Insulectro FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
Function Generator Tektronix AFG 31102
Graphic editor software Microsoft Office Powerpoint ---
Indium tin oxidec coated glass slides MSE Supplied GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine ATCC PCS-999-034
Laptop Dell Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium ATCC PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs ATCC PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) Giblo A10490-01
Molybdenum, 99.95% Kurt J. Lesker EJTMOXX352A4 Sputtering target
Phenol Red Sigma P5530
Power Meter Thor Labs S130VC/PM400
Projector Vecupoi ---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media Gibco 11875-093 This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose Fisher BP220-1
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061 0.40%
Trypsin Neutralizer Gibco R002100
Vacuum Sputtering System Denton DV-502M

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