Summary
Aqui, apresentamos a dieletroforese induzida por luz como uma abordagem livre de marcação para caracterizar linhagens celulares heterogêneas, especificamente células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs). Este trabalho descreve um protocolo de uso e otimização de um dispositivo microfluídico com camada fotocondutora para caracterizar o comportamento elétrico de hMSCs sem alterar seu estado nativo.
Abstract
As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) oferecem uma fonte celular derivada do paciente para a realização de estudos mecanísticos de doenças ou para diversas aplicações terapêuticas. A compreensão das propriedades das hMSC, como seu comportamento elétrico em vários estágios de maturação, tornou-se mais importante nos últimos anos. A dieletroforese (DEP) é um método que pode manipular células em um campo elétrico não uniforme, através do qual podem ser obtidas informações sobre as propriedades elétricas das células, como a capacitância e permissividade da membrana celular. Os modos tradicionais de DEP utilizam eletrodos metálicos, como eletrodos tridimensionais, para caracterizar a resposta das células à DEP. Neste trabalho, apresentamos um dispositivo microfluídico construído com uma camada fotocondutora capaz de manipular células através de projeções de luz que atuam como eletrodos virtuais in situ com geometrias prontamente conformáveis. Apresenta-se aqui um protocolo que demonstra esse fenômeno, denominado DEP induzida por luz (LiDEP), para caracterização das hMSCs. Mostramos que as respostas celulares induzidas por LiDEP, medidas como velocidades celulares, podem ser otimizadas por parâmetros variados, como a tensão de entrada, as faixas de comprimento de onda das projeções de luz e a intensidade da fonte de luz. No futuro, imaginamos que essa plataforma possa abrir caminho para tecnologias livres de rótulos e que realizem a caracterização em tempo real de populações heterogêneas de hMSCs ou outras linhagens de células-tronco.
Introduction
As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) são reconhecidas por suas propriedades imunossupressoras1, o que levou ao seu uso terapêutico para o tratamento de uma variedade de doenças, como diabetes tipo II2, doença do enxerto contra o hospedeiro3 e doença hepática4. Os HMSCs são heterogêneos, contendo subpopulações de células que se diferenciam em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Os HMSCs são derivados do tecido adiposo, tecido do cordão umbilical e medula óssea, e seu potencial de diferenciação depende do tecido de origem e do processo de cultura celularutilizado5. Por exemplo, de acordo com o estudo de Sakaguchi e col., as hMSC derivadas do tecido adiposo são mais propensas a se diferenciar em adipócitos, enquanto as hMSC derivadas da medula óssea são mais propensas a se diferenciar em osteócitos6. Entretanto, o impacto da origem tecidual das hMSC sobre seu potencial de diferenciação é um fenômeno que ainda precisa ser mais bem compreendido. Além disso, os variados potenciais de diferenciação das hMSCs contribuem para sua heterogeneidade inerente e criam desafios na aplicação das hMSC para terapêutica. Dessa forma, a caracterização, bem como a triagem, de linhagens heterogêneas de células-tronco é fundamental para o desenvolvimento da aplicação clínica e in vitro dessas células. A citometria de fluxo, técnica padrão-ouro para examinar diferenças nos fenótipos celulares, utiliza antígenos de superfície celular e corantes fluorescentes para marcar células-alvo e caracterizá-las com base no espalhamento de luz ou em características de fluorescência célula-específicas 6,7,8. As desvantagens desse método incluem a disponibilidade limitada de biomarcadores de antígenos de superfície celular, o alto custo do equipamento e da operação, e o fato de que a coloração da superfície celular poderia potencialmente danificar a membrana celular e afetar aplicações terapêuticas 9,10,11. Portanto, explorar novas técnicas de caracterização celular sem comprometer o estado nativo da membrana celular poderia beneficiar o desempenho clínico da terapêutica com células-tronco.
A dieletroforese (DEP), um método de caracterização celular que não utiliza marcadores de superfície, é o foco deste trabalho atual. DEP é um método livre ou não colorido implementado em plataformas microfluídicas para caracterizar populações heterogêneas de células com base em suas propriedades elétricas. A DEP utiliza um campo elétrico de corrente alternada (CA) em substituição à coloração por fluorescência (ou seja, um método baseado em etiquetas)7. As outras vantagens do uso de dispositivos microfluídicos baseados em DEP para caracterização celular incluem o uso de pequenos volumes (microlitros), tempo de análise rápido, requisitos mínimos de preparação de amostras celulares, risco mínimo de contaminação da amostra, produção mínima de resíduos e baixo custo12,13. Outro benefício da DEP é o monitoramento celular em tempo real14,15,16. Para o DEP, as células em suspensão são expostas a um campo elétrico CA não uniforme criado com eletrodos, tornando-se polarizadas6. Essa polarização causa o movimento celular e permite a manipulação celular com base na frequência e voltagem do campo elétrico AC aplicado. Ajustando-se a frequência, tipicamente entre 5 kHz a 20 MHz, as células podem ser atraídas ou repelidas para longe dos eletrodos, correspondendo ao comportamento positivo e negativo da DEP, respectivamente6.
Existem vários modos de caracterização da DEP, a saber, tradicional, fracionamento de fluxo de campo e induzido por luz, classificados pela configuração do eletrodo e/ou estratégia operacional17. O analisador 3DEP, um modo tradicional de DEP, incorpora eletrodos metálicos físicos e monitora a resposta celular a um campo elétrico CA. Esse sistema utiliza um chip composto por micropoços com múltiplos eletrodos circulares tridimensionais e detecta mudanças nas intensidades de luz para caracterizar o comportamento dos DEP celulares 18,19,20,21. A DEP positiva é observada quando as células se movem em direção às bordas dos eletrodos circulares ao longo das paredes do micropoço, resultando em aumento da intensidade de luz no centro do micropoço. DEP negativo é observado como células se agrupando no centro do micropoço longe dos eletrodos circulares, resultando em diminuição da intensidade de luz no centro do micropoço. Esses dois fenômenos estão representados na Figura 1. Os métodos tradicionais de DEP têm a capacidade de caracterizar as propriedades elétricas de populações celulares heterogêneas 18,20,21. Por exemplo, Mulhall e col. demonstraram o potencial de distinguir entre linhagens celulares de queratinócitos orais normais (HOK) e queratinócitos orais malignos (H357) com base em diferenças na capacitância da membrana21 usando o analisador 3DEP. No entanto, uma limitação dos modos tradicionais de DEP é a geometria fixa do eletrodo. Como as hMSCs são heterogêneas, é vantajoso ter a capacidade de modificar facilmente as geometrias dos eletrodos durante as avaliações da DEP. Por exemplo, ser capaz de modificar os eletrodos ou arranjos de eletrodos em tempo real para aprisionamento de célula única permite que as células sejam caracterizadas com base na velocidade e no comportamento do DEP. A aplicação da modificação de eletrodos em tempo real em avaliações de DEP de hMSCs permite a análise unicelular de hMSCs logo após obtê-las do tecido da amostra para caracterizar a heterogeneidade da população amostral.
Para superar a limitação dos modos tradicionais de DEP (isto é, eletrodos físicos fixos) e explorar novas oportunidades para modificações na configuração de eletrodos em tempo real usando o fenômeno DEP, a DEP induzida por luz (LiDEP) tem sido explorada. A LiDEP é um modo não tradicional de DEP que manipula células usando um dispositivo microfluídico fotocondutor22,23 através de projeções de luz, eletrodos localizados criam um campo elétrico não uniforme, semelhante ao método DEP tradicional. Esta abordagem também permite flexibilidade na geometria do eletrodo e para mover os eletrodos dentro do dispositivo microfluídico. Isso atenua a limitação observada com eletrodos fixos e fornece a oportunidade de obter mais informações sobre a heterogeneidade celular. A LiDEP tem sido utilizada para detectar e analisar diferentes tipos celulares em populações homogêneas e heterogêneas de células22,23,24. Por exemplo, Liao e col. usaram LiDEP para separar células tumorais circulantes (CTCs) que expressam o módulo de adesão de células epiteliais (EpCAMneg) de hemácias para explorar sua importância na metástase de câncer22. A análise unicelular com LiDEP tem sido utilizada com sucesso para caracterizar e manipular células cancerosas com a estratificação da tumorigenicidade pancreática23 e a análise de CTCs em amostras pré e pós-metástases24.
Aqui, descrevemos como a LiDEP pode ser utilizada para manipular hMSCs com uma variedade de geometrias de eletrodos (círculo, diamante, estrela e linhas paralelas) e configurações do sistema (tensão aplicada, intensidade de luz e material de dispositivo microfluídico), oferecendo assim uma abordagem para caracterizar o comportamento de células-tronco derivadas de humanos com eletrodos virtuais.
Protocol
1. Fabricação de dispositivos microfluídicos LiDEP
NOTA: O processo de fabricação consiste na combinação de três componentes em camadas: (i) uma camada fotocondutora com silício amorfo (A:Si) e molibdênio depositado sobre um substrato de vidro de óxido de índio estanho (ITO); (ii) uma camada de microcanal recortada de fita dupla face; e (iii) um substrato de vidro ITO superior com furos perfurados para a entrada e saída da suspensão celular.
- Revestimento vítreo de óxido de índio estanho fotocondutor (ITO)
- Limpe o substrato de vidro revestido com ITO (resistência de 15-20 Ω) fluindo gás nitrogênio (N2) na superfície a uma taxa de fluxo suficiente para mover partículas de poeira visíveis. Após essa etapa, enxágue o substrato com acetona.
- Transfira a lâmina de vidro revestida com ITO para um banho de álcool isopropílico para lavar o resíduo de acetona, enxaguar com água DI e fluir novamente o gás N2 até que o substrato esteja completamente seco.
- Coloque a lâmina de vidro com o lado revestido de ITO para cima no sistema de pulverização a vácuo.
- Sputter uma camada de 10 nm de espessura de molibdênio sobre o substrato de vidro revestido com ITO (alvo de molibdênio) com uma taxa de deposição de 0,7 Å/s e um tempo de deposição de 140 s.
- Adicione uma máscara de sombra a um lado do substrato de vidro para deixar a 2 mm da borda do substrato de vidro descoberta para conexões elétricas. Depositar 1 μm de A:Si usando deposição química de vapor intensificada por plasma indutivamente acoplado (ICP-PECVD), conforme descrito em Medjdoub et al.25.
- Limpe a corrediça com gás N2 para remover poeira e outras impurezas. Para qualquer A:Si depositado sob a máscara de sombra, submergir a borda até a marca de 2 mm em uma solução de hidróxido de potássio a 25% m/v para condicionar o A:Si.
- Fabricação de dispositivos de chip LiDEP
- Para formar o microcanal, obtenha fita dupla face (52 mm x 25 mm) e furos (diâmetro = 4 mm) a 5-6 mm de distância da borda da dimensão mais curta e centralizada entre os lados mais longos da fita. Use um bisturi para cortar duas linhas retas (separadas por 3 mm) nos orifícios. Certifique-se de que as folhas de proteção em ambas as faces da fita dupla face estejam ligadas durante toda a etapa de corte do microcanal.
- Faça dois furos de 3 mm de diâmetro na corrediça de vidro ITO superior. A fita pode ser alinhada em cima do vidro revestido com ITO, com a borda longa da fita alinhando-se com a borda longa do vidro. Marque a localização do furo com um marcador lavável. Certifique-se de que os orifícios perfurados estejam alinhados com os orifícios perfurados na fita dupla face. Esses dois orifícios atuarão como orifícios de entrada e saída do dispositivo microfluídico.
- Remova um lado da película protetora na fita dupla face, alinhe os orifícios na fita e a corrediça de vidro ITO superior e pressione-os juntos. Pressione suavemente para remover as bolsas de ar, especialmente perto do microcanal. As bolsas de ar podem permitir que o meio ou outras soluções se infiltrem sob a fita, o que pode danificar ou causar mofo no dispositivo microfluídico.
- Remova a outra película protetora da fita dupla face e pressione o lado de vidro ITO revestido de molibdênio e A:Si. Combine a borda da lâmina fotocondutora oposta ao lado de 2 mm de folga com a borda da fita dupla face que está em direção ao centro da lâmina de vidro ITO superior. Haverá ressaca da lâmina de vidro ITO superior e da lâmina de vidro ITO revestida de material fotocondutor.
- Pressione sobre uma superfície plana para garantir uma boa aderência. Um esquema do substrato de vidro e das camadas de fita dupla face é ilustrado na Figura 1A. Corte o excesso de fita na lateral.
- Aplique fita de cobre nas bordas da camada A e da camada C para conectar o gerador de funções. Faça isso enrolando a fita na lateral do ITO ou material fotocondutor, dependendo se for camada A ou camada C, da borda da fita dupla face até cerca de 3 cm no lado não revestido do substrato de vidro.
- Para garantir o sucesso da fabricação do dispositivo, use um multímetro para testar uma leitura de resistência entre as lâminas revestidas de ambos os substratos de vidro e a fita de cobre que foi anexada ao vidro.
- Preparação do buffer DEP
- Medir 4,25 g de sacarose e colocá-la em um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, medir 0,15 g de glicose e colocá-lo no mesmo tubo cônico de 50 mL.
- Encha o tubo cônico com 25 mL de água ultrapura, feche a tampa e misture. Uma vez dissolvida cerca de metade da sacarose e da glicose, encha o tubo cônico com água ultrapura até a linha de 50 mL. Misture vigorosamente até que toda a sacarose e glicose estejam dissolvidas. A solução tampão DEP contém 8,5% (p/v) de sacarose e 0,3% (p/v) de glicose.
- Obter 20 mL da solução preparada de sacarose e glicose e colocá-la em um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, medir 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA) e colocá-lo no tubo cônico de 50 mL contendo a solução de sacarose e glicose. Vórtice até que a BSA seja dissolvida. A solução tampão DEP final contém 0,5% (p/v) de BSA.
- Preparação celular
- Obter pelo menos 1 x 106 células (hMSCs ou HEK 293) suspensas em 1 mL de meio de cultura utilizando o protocolo de cultura celular descrito em estudos anteriores26,27. Colocar a suspensão celular num tubo de centrifugação de 10 ml.
- Centrifugar as células HEK 293 a 201 x g por 5 min e as hMSCs a 290 x g por 10 min. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de solução tampão DEP com BSA 0,5%. Certifique-se de não adicionar a solução tampão muito rápido porque bolhas podem se formar.
- Repita o processo de centrifugação mais duas vezes e, em seguida, ressuspenda as células no tampão DEP com BSA 0,5% para caracterização da LiDEP. O protocolo de preparação celular listado é suficiente para 10 corridas. Por exemplo, um teste de frequência requer pelo menos 15 execuções e, portanto, 2 mL de células em uma concentração de 1 x 106 células/mL precisam ser feitos.
2. Caracterização do LiDEP
- Arranjo experimental
- Montar os seguintes equipamentos para o arranjo experimental para quantificação das respostas celulares ao LiDEP: um laptop, um projetor, uma lente objetiva, um microscópio digital e um gerador de funções. Use o laptop para projetar as projeções de luz (estrela, diamante, três linhas e oval) e conecte-o ao projetor.
- Use o projetor como fonte de luz para exibir as projeções de luz na superfície fotocondutora (camada C) do chip LiDEP. Configure-o para que a luz da fonte de luz (projetor) viaje através de uma lente objetiva de 10x para a região microcanal do chip LiDEP. A lente objetiva de 10x fica em cima da lente do projetor. A Figura 1 suplementar mostra a integração do projetor no sistema LiDEP.
- Conecte o chip LiDEP ao gerador de funções para aplicar o campo elétrico CA. Observe as células que experimentam a força LiDEP usando o microscópio digital para geração de imagens e gravação de vídeo. A Figura 1B mostra um esquema do aparato experimental. Seguir protocolos padrão de cultura decélulas26,27 para todas as células testadas.
- Procedimentos experimentais
- Lave o microcanal com etanol a 70%, seguido de solução de BSA a 0,5%. Lave o microcanal novamente com solução BSA a 0,5% mais duas vezes para garantir que o etanol e as células anteriores sejam completamente lavados. As células que já foram expostas ao campo DEP responderão de forma diferente das células novas e podem interromper a coleta de dados.
- Remova a solução de BSA a 0,5% com uma pipeta e encaixe o dispositivo microfluídico no suporte do dispositivo.
- Conecte clipes de jacaré a cada uma das conexões de fita de cobre no dispositivo. Ajuste o gerador de função para a tensão desejada (tensão pico-a-pico, Vpp) e frequência (Hz). A faixa de frequência testada foi de 30 kHz a 20 MHz.
- Adicionar 70 μL de suspensão celular (células + solução tampão DEP com BSA 0,5%) no microcanal do dispositivo. Devido à finura do microcanal (~0,05 mm), pode ocorrer derramamento para fora dos orifícios de entrada e saída. Para ajudar a reduzir a quantidade de derramamento, use uma ponta de pipeta menor e incline a ponta ligeiramente no orifício em direção ao microcanal. Qualquer solução de acesso (BSA a 0,5% ou células em solução) pode ser limpa com toalhetes de papel de uso único e descartada em resíduos de risco biológico.
- Projete a geometria do eletrodo virtual desejado (aqui, círculos, diamantes, estrelas e/ou linhas paralelas) no chip LiDEP.
- No software do microscópio digital, defina a duração do vídeo para 3 min. Defina um temporizador de laboratório para 2 min 30 s. Uma vez que as células estão estacionárias no microcanal do chip LiDEP, pressione Iniciar no software do microscópio digital para iniciar o processo de gravação de vídeo.
- Aguarde 10 s, pressione o botão ON da saída do canal do gerador de função para aplicar o campo elétrico CA e pressione Start para o temporizador. Monitore o comportamento da DEP celular através do microscópio digital e evite tremores ou movimentos ao redor da configuração.
- Quando o temporizador disparar, pressione o botão ON da saída do canal do gerador de funções. Isso desliga a saída do canal gerador de função e o campo elétrico CA não é mais fornecido através dos eletrodos. Pare a gravação de vídeo em 3 minutos e salve no microscópio digital para análise futura.
- Pipetar as células para fora da extremidade de saída do chip LiDEP empurrando lentamente 60 μL de tampão DEP com BSA 0,5% para o microcanal e simultaneamente coletando na saída. Continue até que haja pouca ou nenhuma célula no microcanal.
- Repita os passos 2.2.3-2.2.9 até que todas as frequências tenham sido testadas.
Representative Results
Os testes de tensão e cor dos eletrodos foram realizados utilizando o procedimento acima, com uma pequena variação nos passos 2.2.3 e 2.2.10. Para o teste de tensão, a cor e a frequência dos eletrodos permaneceram constantes, sendo aplicados 5 V pp, 10 V pp e 20 Vpp. Para o teste de cor dos eletrodos, a tensão e a frequência aplicadas foram mantidas constantes em 30 kHz e 20 Vpp, e os eletrodos projetados azuis, vermelhos, brancos e amarelos (referenciados pelos códigos de cores HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF e #FFFF00, respectivamente) foram examinados. A viabilidade celular foi examinada pela coloração das células com azul de tripano e contagem do número de células vivas e mortas por meio de um hemocitômetro.
Com a configuração do LiDEP, foi possível manipular as hMSCs e gerar curvas de resposta da DEP em resposta à frequência de entrada, que é uma forma de caracterizar o comportamento elétrico das células. Uma série de experimentos foi conduzida para encontrar as condições ótimas de operação, manipulando parâmetros como a tensão aplicada e a cor projetada do eletrodo (isto é, formas com cores distintas criadas com um software editor gráfico) para observar o comportamento consistente da célula ao campo elétrico AC não uniforme gerado com os eletrodos virtuais. Os dados coletados para as respostas celulares usando LiDEP, DEP não tradicional, foram comparados com os resultados do analisador 3DEP, DEP tradicional.
O primeiro teste de otimização concentrou-se na resposta DEP positiva de hMSCs (ou seja, as células que se movem em direção ao eletrodo virtual) no chip LiDEP. As células que não exibiram uma resposta DEP positiva ou exibiram uma resposta DEP negativa ao se afastarem do eletrodo virtual, estavam estacionárias e girando, ou não responderam ao campo elétrico. A resposta das células foi quantificada rastreando-se suas velocidades (μm/s) no ImageJ durante um período de 2 min 30 s. Uma projeção oval amarela foi utilizada para o eletrodo virtual, e as tensões aplicadas de 5 V pp, 10 V pp e 20 Vpp foram examinadas em uma frequência definida de 30 kHz. Nós nos concentramos em células que estavam dentro de 50 μm do eletrodo virtual enquanto o campo elétrico AC estava ligado para consistência e para minimizar outliers. Os 20 V pp resultaram no movimento celular mais rápido das células HEK 293, com uma velocidade média de 0,035 μm/s, seguido por 0,032 μm/s a 10 V pp e 0,020 μm/s a 5 Vpp, o que significa que essas células representam um controle relativamente homogêneo. Tendência semelhante foi observada para as hMSCs, que apresentaram velocidade média de 0,051 μm/s a 20 V pp, 0,036 μm/s a 10 V pp e 0,025 μm/s a 5 V pp, como na Figura 2A (aqui, * indica p < 0,05). A 20 Vpp, observou-se que as hMSC apresentaram DEP positiva e negativa simultaneamente. Isso não foi observado em 10 V pp e 5 V pp. Os achados de viabilidade das hMSCs após experimentarem a força de DEP mostraram que tensões mais altas geralmente resultaram em menor viabilidade celular, com 66% das células viáveis a 5 V pp, 58% das células viáveis a 10 V pp e 57% das células viáveis a 20 V pp, como na Figura 2B (aqui, ** indica p < 0,01).
Devido ao LiDEP ser um sistema óptico, a intensidade da luz e a cor do eletrodo são parâmetros que podem ser facilmente ajustados para controlar o desempenho do chip LiDEP. Aqui, diferentes cores de eletrodos (branco, amarelo, vermelho e azul) geradas com base na forma projetada foram avaliadas para determinar o efeito sobre as respostas de DEP das células. Células HEK 293 e hMSCs foram avaliadas a 20 Vpp e 30 kHz. Eletrodos de cor branca, amarela, vermelha e azul foram escolhidos, mas a iluminação através do chip LiDEP foi afetada pela camada fotocondutora, que tinha uma cor vermelho-alaranjada. Assim, o eletrodo branco projetado apresentou-se amarelo com interior branco, o eletrodo vermelho apresentou-se alaranjado com contorno vermelho e o eletrodo azul apresentou-se verde-claro (Figura 3A-D). As potências para essas quatro cores foram as seguintes: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW, e 56,7 μW ± 0,9 μW para branco, amarelo, vermelho e azul, respectivamente. Isso sugere fortemente que amarelo e branco tiveram o campo DEP mais forte, enquanto azul e vermelho foram mais fracos, como na Figura 3E (aqui, *** indica p < 0,001 para células HEK 293 e ** indica p < 0,01 para hMSCs). Também foi observada rotação estacionária das células nas bordas dos eletrodos virtuais amarelo e branco durante a aplicação da força DEP. Para todas as variações de cor dos eletrodos, ocorreram respostas simultâneas negativas e positivas da DEP, correlacionando-se com o que foi mostrado a 20 Vpp para o teste de tensão. Além disso, enquanto a velocidade das células variou de acordo com a cor do eletrodo, quase todas as células dentro do limite de 50 μm responderam ao LiDEP. O tamanho das hMSCs foi medido como 19,2 μm ± 5,8 μm.
Para avaliar a capacidade da LiDEP em comparação com a DEP com eletrodos convencionais, avaliamos as diferenças entre o comportamento da DEP das células usando LiDEP e o das células analisadas pelo analisador 3DEP. A resposta DEP das hMSCs foi medida em uma solução tampão DEP de baixa condutividade com BSA 0,5% (~100 μS/cm). Para mimetizar o analisador 3DEP, um único eletrodo virtual amarelo oval foi projetado a 10 Vpp. O comportamento das hMSCs foi caracterizado de 30 kHz a 20 MHz. Nas frequências inferiores a 25 kHz, observou-se eletrólise, que resultou na geração de bolhas na superfície da camada metálica dentro do dispositivo microfluídico. Para o LiDEP, em frequências mais baixas, as hMSCs apresentaram força DEP positiva, como na Figura 4A, representada como a porcentagem de células atraídas para o eletrodo virtual. As células começaram com uma forte força DEP positiva, que enfraqueceu à medida que a frequência aumentou. As células experimentaram a força DEP positiva mais forte de 30 kHz a 97 kHz. Após a aplicação do campo elétrico AC nessas frequências, algumas células não responderam, enquanto outras apresentaram comportamento negativo da DEP. Essa tendência se desvia da resposta observada quantificada pelo analisador 3DEP; as células aumentaram em DEP positiva de 37 kHz para 255 kHz e diminuíram em DEP positiva de 1.772 kHz para 20 MHz, como na Figura 4B.
Figura 1: Configuração experimental do protocolo LiDEP descrito aqui para hMSCs. (A) Imagem esquemática e real do chip LiDEP com a camada fotocondutora e o arranjo experimental. (B) Imagens representativas das respostas positivas e negativas de DEP das células no analisador 3DEP (usando eletrodos DEP convencionais, superior) e representação esquemática das respostas DEP positivas e negativas das células usando LiDEP (usando projeções de luz como eletrodos virtuais, inferior). (C) Exemplos de diferentes formas que podem ser projetadas no dispositivo como eletrodos virtuais. Figura criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização das respostas (velocidade) de DEP de hMSCs e sua viabilidade sob as condições dadas. (A) As velocidades medidas das respostas DEP positivas das hMSCs para 5 V pp, 10 V pp e 20 V pp. As hMSCs se moveram a 0,051 μm/s a 20 V pp, 0,036 μm/s a 10 V pp e 0,025 μm/s a 5 Vpp. (B) A viabilidade das hMSCs após experimentar a força DEP positiva gerada com eletrodos virtuais. A viabilidade foi de 57%, 58% e 66% para 20 V pp, 10 V pp e 5 Vpp, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão (DP). Análise estatística concluída em conjuntos de dados agrupados usando testes t (*p < 0,05 e **p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação das respostas da DEP entre linhagens celulares homogêneas (HEK 293) e heterogêneas (hMSCs). Resposta DEP positiva das células hMSC aos eletrodos (A) branco, (B) amarelo, (C) vermelho e (D) azul a 20 Vpp e 30 kHz. (E) Respostas de velocidade de células HEK 293 e hMSCs aos diferentes eletrodos coloridos. As células HEK 293 exibiram as maiores velocidades com os eletrodos amarelo e vermelho a 0,035 μm/s e 0,033 μm/s, respectivamente. As células HEK 293 exibiram a menor velocidade com os eletrodos azuis a 0,027 μm/s. As hMSCs exibiram as maiores velocidades com os eletrodos amarelo e branco a 0,068 μm/s e 0,049 μm/s, respectivamente. As hMSCs experimentaram a menor velocidade com os eletrodos vermelhos a 0,039 μm/s. As barras de erro representam o SD. Análise estatística concluída em conjuntos de dados agrupados usando testes t (*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparando as respostas DEP de hMSCs usando LiDEP e 3DEP. As respostas DEP das hMSCs medidas com (A) LiDEP e (B) o analisador 3DEP a 10 Vpp. Com o LiDEP, houve um decaimento na resposta DEP positiva das hMSCs de 30 kHz a 20 MHz. A partir do analisador 3DEP, as células aumentaram em DEP positiva de 37 kHz para 255 kHz e diminuíram em DEP positiva de 1.772 kHz para 20 MHz. As barras de erro representam o SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Imagens representativas do arranjo LiDEP utilizado para os experimentos neste protocolo. Imagem ampliada do sistema LiDEP mostrando a integração do projetor. A luz viaja da fonte (projetor) através de uma lente objetiva de 10x para o microcanal do chip LiDEP. A objetiva de 10x fica em cima da lente do projetor. Cada componente é numerado nas imagens e listado na lateral. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 1: Vídeo representativo de hMSCs respondendo aos eletrodos virtuais branco, amarelo, vermelho e azul. As células são visualizadas como experimentando DEP positiva (movendo-se em direção ao eletrodo virtual), experimentando DEP negativa (afastando-se do eletrodo virtual), estacionárias e giratórias, ou não responsivas ao campo elétrico. As hMSCs foram testadas em 37 kHz e 20 Vpp, e o vídeo foi acelerado em 20x. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Examinar a heterogeneidade das hMSCs é importante para seu avanço na terapêutica. Este trabalho fornece um primeiro passo para o uso da LiDEP como uma ferramenta analítica para a avaliação de hMSCs. Examinamos a dependência de voltagem da resposta DEP positiva das células em LiDEP quantificando a velocidade. Espera-se que tensões mais altas produzam maior força de DEP positiva, e observamos esse padrão com as velocidades medidas. As tensões de 10 V pp e 20 Vpp foram suficientes para a manipulação de hMSCs usando LiDEP. Tensões mais baixas (i.e., 5 Vpp) resultaram em respostas celulares mais lentas; embora não seja ideal para hMSCs, isso pode ser vantajoso para outros tipos de células. Houve uma diminuição voltagem-dependente na viabilidade das hMSCs de aproximadamente 9%. Isso difere um pouco da literatura anterior6,12,28,29, na qual o uso da DEP e da LiDEP tradicionais no exame de células biológicas não diminuiu a viabilidade celular. No entanto, o objetivo experimental em cada estudo variou. Glasser e Fuhr monitoraram o crescimento de fibroblastos aderentes L929 em eletrodos metálicos em meio de cultura celular28. Por outro lado, Lu e col. examinaram a viabilidade de células-tronco neurais expostas a campos elétricos AC por diferentes períodos de tempo12. caracterizaram as propriedades dielétricas das hMSCs com eletrodos metálicos12 e Li e col. manipularam células leucêmicas com LiDEP29. A diferença entre esses estudos e o nosso foi o uso da SCQ, que pode ser a causa da diminuição da viabilidade observada. No entanto, a menor viabilidade global também pode ser devida ao tempo de exposição (2 min 30 s) utilizado no protocolo aqui estabelecido. Esse tempo foi escolhido para fornecer tempo suficiente para visualizar a manipulação celular durante a exposição ao campo elétrico AC não uniforme.
Os métodos de caracterização celular foram testados através da cor do eletrodo para determinar as capacidades e limitações do nosso sistema LiDEP construído conforme descrito no protocolo. Neste protocolo específico, a cor do eletrodo pode ser controlada com base na cor da forma que está sendo projetada através de um arquivo editor gráfico. Foram utilizadas quatro cores: branco, amarelo, vermelho e azul. A partir das leituras de potência para cada cor, os eletrodos projetados amarelo (#FFFF00) e branco (#FFFFFF) foram medidos para ter intensidades mais altas, o que foi a base do motivo pelo qual essas cores foram mais favoráveis ao uso nos experimentos subsequentes. Além disso, devido à estabelecida dependência da intensidade de luz dos materiais fotocondutores30,31, os resultados sugerem que o desempenho dos dispositivos LiDEP depende do A:Si fotocondutor e pode ser sintonizado pela escolha da cor do eletrodo projetado. Uma combinação de respostas DEP positivas e negativas de hMSCs também foi observada usando LiDEP, que é semelhante ao fenômeno visto em métodos tradicionais de DEP. Com cada cor do eletrodo, as hMSCs experimentaram força DEP negativa, força DEP positiva e rotação celular, indicando que a amostra celular era heterogênea em uma única frequência (Vídeo Suplementar 1). Isso concorda com os achados de Adams et al.6 de que as hMSC exibem comportamento negativo e positivo da DEP em uma única frequência. Essas condições (cor do eletrodo, forma do eletrodo e material fotocondutor) podem fornecer parâmetros adicionais para detectar o nível de heterogeneidade em amostras de hMSC.
Por fim, os resultados da avaliação da LiDEP foram comparados com os resultados do analisador 3DEP como referência do comportamento da DEP hMSC. Uma diferença na faixa de frequência da resposta DEP positiva das hMSCs foi observada, mas as tendências nos dados coletados via LiDEP e no analisador 3DEP foram semelhantes em geral (ou seja, a resposta DEP positiva diminuiu com o aumento da frequência). Quando o campo elétrico CA foi fornecido ao chip LiDEP e a luz foi projetada sobre ele, a condutância na área dentro da projeção de luz caiu, criando um campo elétrico não uniforme. Portanto, as características da fonte de luz (i.e., intensidade e comprimento de onda) influenciam a resposta esperada das células dentro do chip LiDEP, como visto a partir dos resultados dos testes de variação de tensão e cor do eletrodo. Outros parâmetros que podem ser modificados são o material da camada fotocondutora e a condutividade da solução tampão DEP. Como tal, as condições utilizadas para avaliar o comportamento DEP das células devem ser avaliadas com base na configuração do sistema LiDEP. Por outro lado, para o analisador 3DEP ou outros métodos que usam eletrodos metálicos para aplicar a força DEP, as características do eletrodo são constantes e não podem ser variadas instantaneamente para se adaptar ao que é necessário para as células sob investigação. Essa variação do comportamento positivo do DEP pode ser benéfica para pesquisas futuras sobre a caracterização de diferentes tipos celulares dentro de amostras de hMSC, análise de célula única ou classificação celular. Além disso, à medida que as células se afastam dos eletrodos virtuais, o campo elétrico AC torna-se mais fraco. No entanto, com o analisador 3DEP, ou outros modos DEP tradicionais que usam eletrodos metálicos, uma região de campo elétrico maior pode ser aplicada, o que permite que mais células sejam manipuladas. Portanto, menos células por experimento LiDEP experimentaram os efeitos do campo elétrico AC dentro do microcanal do chip LiDEP. Outras discrepâncias podem ser causadas por mudanças no desempenho do dispositivo ao longo do tempo (ou seja, 2 h ou 3 h), o que ainda está sendo investigado. O fluxo constante de água, etanol e solução tampão DEP pode quebrar a superfície da camada do microcanal (ou seja, o material fotocondutor) e precisa ser considerado. O desempenho do dispositivo ao longo do tempo para caracterização celular também precisa ser considerado para o uso prolongado de um chip LiDEP. Modificações nos parâmetros experimentais em tempo real levaram apenas alguns segundos a minutos. A cor e as geometrias dos eletrodos foram ajustadas instantaneamente usando configurações dentro do software editor gráfico.
Em resumo, este artigo demonstra as capacidades da LiDEP para manipular e caracterizar uma linhagem celular com populações celulares heterogêneas como hMSCs. Usando este setup e o protocolo descrito, conseguimos obter a caracterização bem sucedida das hMSCs sob as condições de 20 Vpp e eletrodos amarelos virtuais projetados. Estudos futuros devem se concentrar em ajustar o tempo de exposição das hMSCs ao campo elétrico AC criado via LiDEP, aumentar a intensidade de luz dos eletrodos virtuais e avaliar diferentes fontes de hMSCs (ou outras populações de células-tronco) para desenvolver um catálogo LiDEP das assinaturas elétricas de populações heterogêneas de células-tronco.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo prêmio CAREER da National Science Foundation (2048221) via CBET. Gostaríamos de agradecer a Mo Kebaili do Integrated Nanosystems Research Facility (INRF) da UCI. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Dr. Devin Keck por ajudar no desenvolvimento do sistema LiDEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 10x objective | AmScope | --- | |
| Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
| Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
| Dextrose (glucose) | Fisher | D16-1 | |
| Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
| Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
| Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | --- | |
| Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
| L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
| Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
| Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
| Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
| Molybdenum, 99.95% | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | Sputtering target |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
| Projector | Vecupoi | --- | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
| Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
| Trypsin Neutralizer | Gibco | R002100 | |
| Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |
References
- Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
- Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
- Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
- Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
- Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
- Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
- González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
- Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
- Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
- Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
- Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B.
- Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982 (2020).
- Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
- Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
- Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
- Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153 (2019).
- Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
- Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
- Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
- Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563 (2018).
- McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
- Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
- Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
- 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
- Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
- Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102 (2022).
- Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
- Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).
