Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

Zusammenfassung

Wir demonstrieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung der Genfunktion in peritonealen Gewebe-residenten Makrophagen in vivo unter Verwendung lentiviraler Vektoren.

Zusammenfassung

Im Peritonealgewebe residente Makrophagen haben weitreichende Funktionen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und sind an Pathologien in lokalen und benachbarten Geweben beteiligt. Ihre Funktionen werden von Mikroumgebungsreizen diktiert; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten in einer physiologischen Nische in vivo zu untersuchen. Derzeit verwenden spezifische Peritonealmakrophagen-Targeting-Methoden transgene Modelle der ganzen Maus. Hier wird ein Protokoll zur effektiven in vivo Modulation der Expression von mRNA und kleinen RNA-Spezies (z.B. microRNA) in Peritonealmakrophagen unter Verwendung von Lentiviruspartikeln beschrieben. Lentivirus-Präparate wurden in HEK293T Zellen hergestellt und auf einer einzigen Saccharoseschicht gereinigt. Die In-vivo-Validierung der Wirksamkeit von Lentiviren nach intraperitonealer Injektion ergab eine vorherrschende Infektion von Makrophagen, die auf lokales Gewebe beschränkt waren. Das Targeting von Peritonealmakrophagen war während der Homöostase und der Thioglykolat-induzierten Peritonitis erfolgreich. Die Einschränkungen des Protokolls, einschließlich der durch die intraperitoneale Verabreichung von Lentiviren induzierten Entzündung auf niedrigem Niveau und der Zeitbeschränkungen für mögliche Experimente, werden diskutiert. Insgesamt stellt diese Studie ein schnelles und zugängliches Protokoll für die schnelle Beurteilung der Genfunktion in peritonealen Makrophagen in vivo dar.

Einleitung

Geweberesidente Makrophagen (Mφ) sind eine heterogene Population phagozytärer Immunzellen, die eindringende Krankheitserreger wahrnehmen und darauf reagieren ^1,2. Darüber hinaus spielen sie eine wesentliche Rolle bei der Gewebeentwicklung, dem Umbau und der Aufrechterhaltung der Homöostase ^1,3. Viele Gewebe-Mφ stammen während der Embryogenese von Dottersack-Vorläufern ab und verbleiben während des gesamten Lebens im Gewebe ^4,5. Der Phänotyp und die Funktionen dieser Zellen werden durch kollaborative und hierarchische Wechselwirkungen spezifischer Transkriptionsfaktoren und der lokalen Mikroumgebung bestimmt 6,7,8,9. Ein wachsendes Verständnis dieser Abhängigkeit erhöht den Bedarf an effektiven in vivo Methoden zur Genmanipulation von Mφ in ihrer physiologisch relevanten Nische.

Lentivirale Vektoren sind ein häufig eingesetztes Werkzeug zur Manipulation von Nukleinsäuren in spezifischen Zellpopulationen in vivo 10,11,12, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit, sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen zu infizieren und sich stabil in das Wirtsgenom zu integrieren ^13,14. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Lentivirus-Verabreichungstechnologie optimiert, und es wurden alternative Hüllkurven und synthetische Promotoren untersucht, um das linienspezifische Targeting zu erhöhen ^8,15. Aufgrund seines breiten Zelltropismus hat sich das vesikuläre Stomatitis-Virus-Hüllglykoprotein (VSV-G)^16,17 zum "Goldstandard" in der Lentivirus-Technologie entwickelt.

In diesem Protokoll¹⁸ werden VSV-G-pseudotypisierte lentivirale Partikel verwendet, um die gezielte und effektive Verabreichung von Short Hairpin-RNA (shRNA) und microRNA (miR) an peritoneale Mφ (pMφ) der Maus in vivo im Steady State¹⁹ zu demonstrieren. Die Transgenexpression wurde durch den Promotor des Milzfokusbildenden Virus (SFFV) gesteuert. Die produktive Infektion von Zellen wurde durch die Expression des von Lentiviren abgeleiteten verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) definiert. Die Verwendung dieses Ansatzes ermöglichte eine einfache Auslesung für in vivo Lentivirus-Experimente, um die optimale Dosis und den experimentellen Zeitrahmen zu definieren. Schließlich zeigte die in vivo lentivirale Provokation von Mäusen während einer Thioglykolat-induzierten Entzündung die natürliche Neigung zur selektiven pMφ-Infektion.

Protokoll

Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institution und des britischen Innenministeriums durchgeführt.

HINWEIS: Alle In-vivo-Studien mit Lentiviren sollten gemäß den lokalen und nationalen Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der Forschung sowie unter Einhaltung aller Vorschriften im Zusammenhang mit der Verwendung von infektiösem Material der Kategorie II durchgeführt werden. Auch der Tierschutz sollte in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften überwacht werden. In diesem Schritt des Protokolls ist bei der Arbeit mit lentiviralen Partikeln und scharfen Gegenständen äußerste Vorsicht geboten.

1. Vorbereitung der HEK293T Zellen für die Transfektion

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank für sterile Gewebekulturen durch.

1. Bereiten Sie das komplette Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) für HEK293T Zellen her, indem Sie die 450 ml DMEM mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum (50 ml) und einer Endkonzentration von 100 μl/ml Penicillin/Streptomycin kombinieren.
2. Tauen Sie HEK293T Zellen mindestens 1 Woche vor der geplanten Transfektion auf. Halten Sie gesunde Wachstumsbedingungen aufrecht und führen Sie alle 2-3 Tage eine Passage durch, indem Sie Trypsin + EDTA verwenden, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen.
3. Einen Tag vor der Transfektion das Wachstumsmedium vorsichtig aus den Zellen aspirieren und die Zellen vorsichtig mit sterilem DPBS waschen. 1-5 ml Trypsin in den Kolben geben und bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ -Inkubator für 2-5 min inkubieren.
4. Fügen Sie 5-10 mL cDMEM hinzu und drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 350 x g . Entfernen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL cDMEM. Zählen Sie die Zellen und den Samen 10-11 x 10⁶ lebensfähige HEK293T Zellen pro T175-Kolben in 20 ml cDMEM.
5. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator, damit die HEK293T Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen können.
6. Am nächsten Tag bestätigen Sie die Konfluenz der Zellen unter einem Lichtmikroskop.
7. Entfernen Sie das Medium mit einer serologischen 25-ml-Stripette aus dem Kolben, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
8. Fügen Sie vorsichtig 10 ml DPBS hinzu und schütteln Sie die Platte, um die Zellen zu waschen, wobei Sie darauf achten, die Zellmonoschicht nicht zu stören.
9. Entfernen Sie DPBS mit einer serologischen Stripette von 25 mL.
10. Geben Sie 15 mL neues cDMEM pro T175-Kolben an die Wand, um die Zellmonoschicht nicht zu stören, und stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C in den Inkubator ein.

2. Transfektion von HEK293T Zellen mit nicht-liposomalem Lipidtransfektionsreagenz

1. Bereiten Sie in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen die lentiviralen Komponenten vor: 2 μg lentivirales Plasmid, 1,5 μg pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) und 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) mit Puffer EC (Transfektionsreagenzkit) auf ein Endvolumen von 600 μl.
2. Fügen Sie 36 μl Enhancer-Lösung hinzu. Mischen Sie die Komponenten mit einer 1-ml-Pipette, indem Sie wiederholt einen Teil der Flüssigkeit aufsaugen und tropfenweise direkt auf die restliche Lösung zurückgeben. 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ziehen lassen.
3. 120 μl Transfektionsreagenz zugeben und wie oben etwa 20 Mal mischen. 10 Minuten bei RT inkubieren.
4. Fügen Sie 5,2 mL cDMEM hinzu und mischen Sie es wie oben mit einem 5 mL serologischen Stripette.
5. Mit einer Einweg-Transferpipette wird die Transfektionsmischung tropfenweise direkt auf die Monoschicht der HEK293T Zellen aufgetragen (wobei die Kolbenwände vermieden werden) und die Mischung an verschiedenen Stellen im Kolben verteilen.
6. Das Plasmid wird verteilt, indem der Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen geschwenkt wird. Vermeiden Sie es, dass Flüssigkeit in den Kolbendeckel gelangt.
7. Der Kolben wird bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator 48 h lang inkubiert. Bestätigen Sie die effektive Transfektion von HEK293T Zellen durch das Auftreten eines Fluoreszenzmarkers, hier GFP, innerhalb von 24 Stunden nach der Transfektion, die unter einem zellbildgebenden Fluoreszenzmikroskop überwacht wurde.
   HINWEIS: Bei Konstrukten ohne den Fluoreszenzmarker müssen HEK293T Zellen auf das Vorhandensein des verwendeten Markergens oder durch Expressionsänderung des interessierenden Gens/Proteins mit geeigneten Techniken, z. B. qPCR, getestet werden. Alternativ kann eine erfolgreiche Transfektion indirekt während der Erprobung der Lentivirus-Sammlung an Jurkat-Zellen in den späteren Stadien des Protokolls durch die oben genannten Techniken verifiziert werden.
   VORSICHT: Transfizierte HEK293T Zellen gelten als infektiös, und beim Umgang mit diesen Zellen sollten geeignete Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Es sollten lokale Vorschriften befolgt werden, zu denen in der Regel die Arbeit unter einer biologischen Sicherheitswerkbank der Kategorie II, die Verwendung von Doppelhandschuhen und eine geeignete Dekontaminationslösung zur Desinfektion gehören können, z. B. eine erhöhte Konzentration von Bleichabfällen (2.000 ppm) oder eine gleichwertige Lösung gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien. Alle Lösungen und Kunststoffe, die mit Lentiviruspräparaten in Berührung kommen, sollten gemäß den institutionellen Biosicherheitsverfahren desinfiziert werden.

3. Sammlung von lentiviralen Partikeln

1. Bereiten Sie eine Dekontaminationslösung, eine hochkonzentrierte (2.000 ppm) Bleichlösung (Natriumhypochlorit) oder ein gleichwertiges Mittel gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien in einem Eimer vor und legen Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank.
2. Bereiten Sie den Biologie-Sicherheitsschrank vor, indem Sie überschüssige Gegenstände wie leere Röhrchengestelle usw. entfernen.
3. Beschriften Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen pro T175-HEK293T-Kolben vor und entfernen Sie den Deckel vom Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Röhrchen in ein stabiles Gestell.
4. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und bestätigen Sie die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 488-nm-Laser (Abbildung 1A). Die Intensität des Signals hängt von der Transfektionseffizienz des Verfahrens und den verwendeten Konstrukten ab.
5. Sammeln Sie das Medium aus den Zellen in das vormarkierte 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Der T175 HEK293T Kolben mit durchtrennten Zellen wird so gekippt, dass sich das Medium in der unteren Ecke des Kolbens sammelt. Sammeln Sie das Medium mit einer serologischen Stripette von 25 ml, ohne die Zellmonoschicht zu stören. An dieser Stelle sind möglicherweise einige unverankerte Zellen sichtbar. Füllen Sie das Medium in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen und schließen Sie den Deckel.
   1. Mit einem serologischen Streifen von 25 ml werden 25 ml frisches, warmes cDMEM in den Kolben gegeben. Es ist darauf zu achten, dass der Medienstrom auf die Wände des Kolbens gerichtet ist, um die Zellmonoschicht nicht zu stören. Der Kolben mit den transfizierten HEK293T Zellen wird wieder in den Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) gestellt.
      HINWEIS: Eine zweite Entnahme von Lentiviren und eine weitere Reinigung können nach weiteren 24 Stunden gemäß dem in den obigen Schritten beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
6. Wenn die Lentivirus-Entnahme nach 24 Stunden oder 48 Stunden abgeschlossen ist, geben Sie Dekontaminationslösung zu den Zellen und stellen Sie sicher, dass sie die Zellmonoschicht bedeckt. Lassen Sie den Kolben für die nächsten 24 Stunden waagerecht und entsorgen Sie ihn dann gemäß den entsprechenden Vorschriften der Kategorie II.

4. Reinigung des Lentivirus

1. Filtern Sie das Sammelmedium aus Schritt 3.5.
   1. Entfernen Sie den Kolben von der 50-ml-Spritze und setzen Sie einen Sterilfilter mit geringer Proteinbindung aus Polyethersulfon oder Polyvinylidenfluorid 0,45 μm in das Spritzenende ein. Geben Sie mit einem serologischen 25-ml-Streifen das gesammelte Medium aus Schritt 3.5.1 in die Spritze und führen Sie den Kolben vorsichtig zurück.
   2. Schieben Sie den Stopfen langsam ein, um das Medium durch den Filter in ein frisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu leiten. Wenn der Durchfluss stark abnimmt, positionieren Sie die Spritze mit dem Filter nach oben und ziehen Sie den Kolben so weit heraus, dass das Medium aus dem Filter entfernt wird.
   3. Ersetzen Sie vorsichtig den Filter an der Spritze durch einen neuen und entsorgen Sie den gebrauchten Filter in der Dekontaminationslösung. Mittlere Filtration fortsetzen. Wenn Sie fertig sind, dekontaminieren Sie den Filter und die Spritze, indem Sie den Filter eintauchen und die Spritze mit der Dekontaminationslösung füllen.
2. Kühlen Sie die Ultrazentrifuge vor, indem Sie die Temperatur auf 4 °C einstellen und den Deckel schließen, damit sich die Temperatur akklimatisieren kann.
3. 3 ml 20%ige Saccharoselösung (20 % w/v in Reinstwasser, Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisiert) in den Boden des konischen Ultrazentrifugenröhrchens geben.
4. Mit einem serologischen Streifen von 25 mL das gefilterte Medium auf die Saccharoseschicht legen, wobei darauf zu achten ist, dass die Schichten nicht gestört werden.
   1. Verwenden Sie die niedrigste Geschwindigkeitseinstellung an der Pipette Junge. Das konische Ultrazentrifugenröhrchen um ca. 45° anwinkeln und das filtrierte lentivirushaltige Medium aus Schritt 4.1 langsam an die Röhrchenwand geben. Stellen Sie sicher, dass sich das Medium und die Saccharose nicht vermischen und eine klare Trennung der Schichten sichtbar ist (Abbildung 1B). Wenn das Volumen der mittleren Schicht zunimmt, kippen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen langsam wieder in eine aufrechte Position.
5. Wenn das Gesamtvolumen, einschließlich der Saccharose und des Mediums, im Ultrazentrifugenröhrchen weniger als 29 ml beträgt, füllen Sie es mit frischem cDMEM auf, um ein Zusammenfallen des Röhrchens während des Schleuderns zu vermeiden. Mischen Sie für mehrere T175-ml-Entnahmen die Präparate des gefilterten Mediums und verwenden Sie mehrere Ultrazentrifugenröhrchen. Füllen Sie das letzte Ultrazentrifugenröhrchen nach Bedarf mit dem Medium auf.
6. Stellen Sie sicher, dass die Ultrazentrifugeneimer sauber sind. Es gibt keine mittleren Rückstände auf dem Boden des Eimers oder den Deckeln. Bei Bedarf mit ~70 % Alkohol auswischen. Setzen Sie geeignete Röhrchenadapter in den Boden jedes Eimers ein (Abbildung 1C) und senken Sie die Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig in die Eimer ab.
7. Verschließen Sie die Schaufeln sicher und hängen Sie sie an die dafür vorgesehenen Stellen am Schleuderrotor.
8. Stellen Sie sicher, dass die Eimer mit dem gleichen Volumen an Saccharose und Medium ausbalanciert sind. Ein Spin-out-Rotor darf niemals ohne Schaufeln betrieben werden, obwohl gegenüberliegende Schaufeln leer bleiben können²⁰ (Abbildung 1D).
9. Setzen Sie den Rotor vorsichtig in die Ultrazentrifuge ein und schalten Sie das Vakuum ein. Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsrate der Ultrazentrifuge auf die niedrigste Einstellung ein und führen Sie die Lentivirus-Präparate 90 Minuten lang bei 4 °C bei 85.000 x g durch.
10. Warten Sie, bis die Ultrazentrifuge die erforderliche Drehzahl erreicht hat (ca. 3-5 Minuten), bevor Sie weggehen, um sicherzustellen, dass der Rotor richtig eingesetzt ist und die Drehung nicht endet.
11. Während die Ultrazentrifuge läuft, reinigen Sie den Arbeitsbereich gemäß den Sicherheitsanforderungen der Kategorie II und bereiten Sie den Raum für die nächsten Schritte vor.
12. Wenn das Schleudern beendet ist, deaktivieren Sie das Vakuum und entfernen Sie vorsichtig den Rotor, um die Proben nicht zu stören.
13. Untersuchen Sie die Ultrazentrifuge auf verschüttete Flüssigkeiten und vergewissern Sie sich, dass keine Lecks aus den Eimern vorhanden sind. Im Falle eines Verschüttens den Handschuh verdoppeln und die Zentrifuge und die Außenfläche der Eimer mit antiviralen Produkten dekontaminieren.
14. Nehmen Sie die Eimer aus der Ultrazentrifuge und transportieren Sie die Eimer vorsichtig in die Biologie-Sicherheitswerkbank der Kategorie II.
    HINWEIS: Lentivirus-Partikel sammeln sich am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens. Das Pellet ist mit bloßem Auge nicht sichtbar.
15. Gießen Sie die Saccharose und das Medium mit einer sanften Bewegung direkt in den Abfallbehälter mit der Dekontaminationslösung.
16. Halten Sie das Ultrazentrifugenröhrchen umgedreht, übertragen Sie es auf die doppelte Gewebeschicht und lassen Sie es 10 Minuten trocknen. Wischen Sie in der Zwischenzeit das Innere der Eimer mit einem wassergetränkten Tuch ab und trocknen Sie sie kopfüber an der Luft.
17. Trocknen Sie die verbleibende Flüssigkeit vom Rand des Ultrazentrifugenröhrchens vorsichtig mit einem Taschentuch ab, bevor Sie es aufrecht stellen. Desinfizieren Sie das Tuch und die darunter liegende Oberfläche.
18. Resuspendieren Sie das Viruspellet in 1 ml serumfreiem Medium oder einer Lösung, die für weitere Experimente erforderlich ist, indem Sie die Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren. Lassen Sie es für 15 Minuten bei RT in der Biologie-Sicherheitswerkbank der Kategorie II.
19. Mischen Sie die Lentivirus-Präparate vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette, bevor Sie sie in 1,5-ml-Schraubröhrchen (z. B. Kryoröhrchen) aliquotieren. Bereiten Sie die Aliquote für die in vivo-Arbeit (Multiplizität von 100 μl) und für den Lentivirus-Titer in Jurkat-T-Zellen (1 x 20 μl) vor (siehe Schritt 5).
20. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen; lentivirale Präparate können bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden, ohne dass sich dies negativ auf die Infektiosität auswirkt.

5. Titration der Lentivirusproduktion in Jurkat-T-Zellen

1. Bereiten Sie das komplette Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (cRPMI-1640) für Jurkat T-Zellen vor, indem Sie 500 ml RPMI-1640 mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum und einer Endkonzentration von 100 U/ml Penicillin/Streptomycin ergänzen.
2. Um eine gesunde Kultur von Jurkat-T-Zellen zu gewährleisten, halten Sie die Zellen bis zu 1 Woche vor der Infektion in Kultur.
3. Am Tag der Lentivirus-Titration werden lebensfähige Jurkat-T-Zellen in einer 24-Well-Platte mit 2 x 10⁵ Zellen/Well in 200 μl pro Well cRPMI-1640 ausplattiert.
4. Verwenden Sie frisch gesammelte Lentiviren oder tauen Sie das Lentivirus-Fläschchen mit 20 μl auf Eis auf und mischen Sie es vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren.
5. Unter Verwendung der seriellen Verdünnung in cRPMI-1640 infizieren Sie Jurkat-T-Zellen mit 0,25 μl, 0,5 μl, 1 μl, 2,5 μl, 5 μl und 10 μl Lentivirus-Stamm. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Lentivirus zu gewährleisten. Als Negativkontrolle dienen nicht infizierte Jurkat-T-Zellen.
6. Die Platte bei 37 °C inkubieren. Nach 4 Stunden füllen Sie jede Vertiefung mit cRPMI auf ein Gesamtvolumen von 400 μl auf. Stellen Sie die Platte wieder für 37 °C für 3 Tage in den Inkubator.
7. Nach 48 Stunden nach der Infektion ist die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzbildgebungssystem zu bestätigen.
8. Sammeln Sie 3 Tage nach der Infektion jede Vertiefung der 24-Well-Platte in separate 1,5-ml-Entnahmeröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g bei 4 °C für 5 Minuten.
9. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl 2 % Paraformaldehyd (PFA), aufbereitet auf 2 % (w/v) in DPBS und lassen Sie es 15 Minuten im Dunkeln auf Eis liegen.
10. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g bei 4 °C für 5 min und resuspendieren Sie das Pellet in Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (steriles DPBS + 4 % FCS + 1 mM steriles EDTA).
11. Analysieren Sie die GFP-Expressionsfrequenz und die mittlere Fluoreszenzintensität des infizierten Lentivirus und seiner Kontrollzellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).

6. In vivo Lentivirus-Infektion von geweberesidenten Peritonealmakrophagen

1. In einer biologischen Sicherheitswerkbank der Kategorie II sind Insulinnadeln mit einem Gesamtvolumen von 200 μl serumfreiem Medium zu bestücken, das die erforderliche Menge an Lentiviren enthält (verwenden Sie Einwegnadeln, 30 g für den Tierschutz und um Flüssigkeitsverlust in der Nadel zu vermeiden).
2. Setzen Sie die Nadelscheide mit der Einhand-Schöpftechnik wieder auf die Nadel. Halten Sie die Nadel auf Eis und injizieren Sie innerhalb von 30 Minuten.
3. In der Tierhaltung ist vor den Injektionen eine biologische Sicherheitswerkbank der Kategorie II einzurichten (Abbildung 1E).
   1. Lege ein Blatt sauberes Taschentuch aus. Lösen Sie die Schleuse an der Insulinnadel, die das Lentivirus enthält.
   2. Bereiten Sie eine Petrischale mit kleinen Gewebestücken und Desinfektionsmittel auf Chlorhexidingluconat-Basis, ein 50-ml-Röhrchen mit Dekontaminationslösung (2.000 ppm Bleichlösung) und einen scharfen, sicheren Behälter vor.
4. Halten Sie die Maus fest, indem Sie die Haut im Nacken fassen²¹. Eine ordnungsgemäß gesicherte Maus ist unbeweglich, und dies ist aus Sicherheitsgründen erforderlich.
5. Richten Sie den Kopf des Tieres mit dem Bauch nach oben leicht nach unten. Injizieren Sie das Lentivirus intraperitoneal in den unteren rechten Quadranten der Bauchhöhle. Dies dient dazu, eine Injektion in Organe der Bauchhöhle zu vermeiden.
6. Füllen Sie die Spritze vor dem Loslassen der Maus mit Dekontaminationslösung und entsorgen Sie sie sicher in der scharfen Safebox.
7. Wischen Sie die Injektionsstelle am Bauch der Maus mit einem mit Desinfektionsmittel getränkten Taschentuch ab und bringen Sie das Tier wieder in den Käfig zurück.
8. Halten Sie die mit Lentiviren injizierte Maus mindestens 72 Stunden nach der Injektion in Scantainer- oder individuell belüfteten Käfigen (IVC) der Kategorie II (isolierte Käfige mit hocheffizienter Luftfilterung). Platzieren Sie eine entsprechende Informationskarte an der Vorderseite des Käfigs.
9. Bewegen Sie die Maus 72 Stunden nach der Infektion in den neuen Käfig der Kategorie I, abhängig von den örtlichen Sicherheitszulassungen. Überwachen Sie die Mäuse täglich für insgesamt 3 Tage nach der Injektion.

7. Entnahme von Peritonealzellen aus Lentivirus-infizierten Mäusen

ACHTUNG: Bei Entnahmen innerhalb von 72 Stunden nach der Lentivirus-Injektion sind die Vorschriften für die biologische Sicherheit der institutionellen Kategorie II zu befolgen. Einstreu und Käfighaltung, in denen infizierte Tiere in den ersten 72 Stunden nach der Lentivirus-Injektion gehalten wurden, müssen gemäß den Vorschriften der institutionellen Kategorie II für die biologische Sicherheit dekontaminiert werden.

1. Euthanasieren Sie Mäuse nach institutionellen Vorschriften, z. B. durch Einatmen einer zunehmenden CO₂ -Konzentration, gefolgt von der Bestätigung des Todes durch Gebärmutterhalsluxation.
2. Reinigen Sie den Bauch der Maus mit 70% Isopropanol und schneiden Sie die Haut vorsichtig ein, um die Membran der Bauchhöhle freizulegen.
3. Spülen Sie die Bauchhöhle mit 6 mL eiskaltem FACS-Puffer unter Verwendung einer 10 mL Spritze und einer 23 g Nadel. Vermeiden Sie es, Organe zu punktieren.
4. Massieren Sie sanft das Bauchfell, um Zellen in den FACS-Puffer zu verdrängen.
5. Entnehmen Sie die Bauchfellflüssigkeit mit derselben Spritze und Nadel.
6. Entfernen Sie die Nadel und geben Sie die Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
7. Halten Sie die Peritonealspülungen auf Eis.
8. Sammeln Sie andere benötigte Organe und lagern Sie sie entsprechend der Studie.
9. Entsorgen Sie Tierkadaver gemäß den örtlichen Tier- und Sicherheitsrichtlinien.

8. Färbung und Analyse von Peritonealzellen

1. Die Peritonealspülung bei 350 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren, den Überstand in der Dekontaminationslösung verwerfen und die Zellen in 1 ml FACS-Puffer resuspendieren.
2. Zählen Sie die gesammelten Zellen und platieren Sie 4 x 10⁵ Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit V-Boden.
3. Führen Sie die Viabilitätsfärbung mit einem fixierbaren Reagenz (z. B. dem hier verwendeten Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
4. Wenn Zellen innerhalb der letzten 72 h infiziert wurden, fixieren Sie die Zellen in 2% PFA für 15 min auf Eis. Geben Sie das gleiche Volumen kaltes DPBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei 350 x g bei 4 °C für 5 min.
5. Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor: Mischen Sie 4 μg/ml 2,4G2-Antikörper in 10 % (v/v) Rattenserum in FACS-Puffer für die Oberflächenfärbung oder Permeabilisierungspuffer für die intrazelluläre Färbung.
6. Jede Vertiefung mit Zellpellet in 50 μl Blockierungspuffer resuspendieren und 15 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
7. Bereiten Sie eine Antikörpermischung in entweder 50 μl FACS-Puffer (für die Oberflächenfärbung) oder Permeabilisierungspuffer (für die intrazelluläre Färbung) pro Probe vor. Das endgültige Färbevolumen für jede Probe beträgt 100 μl, einschließlich 50 μl Blockierungspuffer. Berechnen Sie die Antikörperkonzentrationen entsprechend (Tabelle 1).
8. Geben Sie 50 μl Antikörpermischung in die Proben und 50 μl Isotypkontrollen und Kontrollpuffer in die Kontrollproben. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Fügen Sie bei Bedarf ungefärbte Zellen und Isotypkontrollen hinzu.
9. Jede Füllung mit 100-200 μL eiskaltem DPBS waschen und die Platte bei 350 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, um alle ungebundenen Antikörper abzuwaschen. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.

9. Extraktion von Zellen aus Organen

1. Bereiten Sie 1 ml Aufschlussmischung pro Organ vor: Mischen Sie Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS), 2 mg/ml Kollagenase Typ IV und 0,03 mg/ml DNase I (einschließlich 1,5 mg/ml Hyaluronidase für die Lungenverdauung).
2. Übertragen Sie das gesammelte Organ in 1 ml Verdauungsmischung und zerkleinern Sie es mit einer Schere.
3. Die Zellen durch ein 40 μm Sieb filtrieren und bei 350 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren.
4. Bei der Isolierung von Zellen aus der Lunge, Milz oder Leber lysieren Sie rote Blutkörperchen mit ACK-Lysepuffer (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Die Zellen durch ein 40 μm Sieb filtrieren und bei 350 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren.
5. Färben und analysieren Sie die Zellen wie in Abschnitt 8 beschrieben.

Ergebnisse

Bei vollständiger und korrekter Befolgung dieses Protokolls ergibt sich eine Gesamtmenge von 1,5 ml hochwertiger Lentivirus-Brühe pro Einzelpräparat, ausreichend für zwölf In-vivo-Injektionen mit dem in dieser Studie ermittelten optimalen Volumen¹⁸. Der Erfolg der Transfektion kann bereits zu Beginn des Protokolls beurteilt werden. Gesunde und konfluente HEK293T Zellen sollten, falls in den Plasmiden vorhanden, 48 Stunden nach der Plasmidtransfektion ein leicht nachweisbares Markersignal (z. B. das in dieser Studie verwendete GFP) aufweisen (Abbildung 1A). Die geringe Intensität des Signals, die übermäßige Zellablösung und die geringe Konfluenz in den frühen Schritten des Protokolls könnten auf Zelltod hinweisen und zu einer geringen Ausbeute des Lentivirus-Präparats führen. Ein Teil der Zellablösung vor der optionalen Entnahme II (Schritt 3.5.1.) ist sichtbar und zu erwarten.

In diesem Protokoll werden drei Plasmide zur Erzeugung von Lentivirus-Partikeln verwendet: pCMV-ΔR8.91 Verpackungsplasmid, das für das strukturelle HIV-1-Protein (Gag) kodiert, die akzessorischen Proteine Tat und Rev sowie die reverse Transkriptase-Polymerase (Pol)²²; pMD2.G-kodierende VSV-G-Hüllkurve unter CMV-Promotor¹³; und pHR'SIN-cPPT-SEW-Plasmid (kodiert für einen verstärkten GFP-Marker)¹⁹ , das entsprechend für die Expression von shRNA oder microRNA modifiziert wurde.

Lentivirus-Präparate werden aufgrund ihrer hohen Infektiosität in der Jurkat-T-Zelllinie titriert²³. Eine erfolgreiche Lentivirus-Vorbereitung erreicht eine Infektionsrate von über 95 % mit einer Dosis von nur 5 μl (Abbildung 2A). Die mittlere Fluoreszenzintensität der infizierten Zellen nimmt mit den höheren Dosen weiter zu (Abbildung 2B,C). Bei Bedarf können virale Titer mittels real-time PCR von integrierten viralen Komponenten, z.B. dem SFFV-Promotor, gemessen werden, der linear mit dem Prozentsatz der GFP-exprimierenden Zellen und logarithmisch mit dem GFP MFI korrelierte (Abbildung 2D). Abhängig vom Konstrukt, insbesondere solchen mit einem großen Insert²⁴, können einige Lentivirus-Präparate eine verminderte Infektiosität in Jurkat-T-Zellen aufweisen, wie für das in dieser Studie verwendete Cre-GFP-Konstrukt gezeigt wurde (Abbildung 2E, F). In einem solchen Fall könnten mehrere Präparate von Lentivirus-Partikeln kombiniert und in 1 ml resuspendiert werden. Wir empfehlen, die Immunantworten auf diese Präparate vor dem Experimentieren in vivo zu validieren. Naturgemäß können die hier verwendeten Lentivirus-Präparate mit alternativen Eintrittsrezeptoren zu VSV-G in der Jurkat-T-Zelllinie eine unterschiedliche Infektionseffizienz aufweisen, abhängig von der Rezeptorexpression auf den Zellen. Zelllinien, die für die Titration verwendet werden, sollten so ausgewählt werden, dass sie den Rezeptor exprimieren, der von den Lentivirus-Partikeln verwendet wird, um in die Zellen einzudringen, und dass sie bevorzugt keine oder nur eine sehr geringe Expression der Restriktionsfaktoren aufweisen²⁵.

Die erfolgreiche Produktion lentiviraler Partikel wird auch durch die Infektion von pMφ (definiert als CD11b⁺ F4/80⁺ und Tim4⁺ Population)¹⁸ belegt (Abbildung 3A). Wir stellten fest, dass die intraperitoneale Injektion eines 100 μl Lentiviruspräparats (bei einem Gesamtvolumen von 200 μl serumfreiem Medium) den höchsten Prozentsatz und die höchste Intensität des GFP-Signals in diesen Zellen ergibt (Abbildung 3B, C). Injektionen höherer Dosen (150 μl und 200 μl Lentiviruspräparat) hatten keinen positiven Einfluss auf die GFP-Expression im pMφ. Zeitverlaufsexperimente um 4 Stunden, 3 Tage, 7 Tage und 14 Tage nach intraperitonealer (i.p) Injektion mit 100 μl Lentivirus zeigten einen signifikanten Prozentsatz an GFP-exprimierenden residenten pMφ an den Tagen 3 und 7, gefolgt vom Verschwinden der infizierten Population an Tag 14 (Abbildung 3D, E). Interessanterweise verschwindet das GFP-exprimierende pMφ größtenteils am 14. Tag nach der Infektion, was zum Teil auf die Immunerkennung des GFP-Markers zurückzuführen ist. Tatsächlich verhindern Lentivirus-Experimente mit GFP-Markern in T-Reg-selektiven Foxp3-DTR-eGFP-Mäusen die Abstoßung von infiziertem residentem pMφ bis mindestens Tag 21 (Abbildung 3F). Bei Lentivirus-Präparaten mit verminderter Wirksamkeit in Jurkat-Zellen wäre eine höhere Menge erforderlich, um die erwartete Infektionsrate in vivo zu erreichen. Wie jedoch bei der Cre-GFP-Lentivirus-Präparation gezeigt wurde, kann je nach Konstruktdesign selbst eine Dosis von 300 μl 7 Tage nach der i.p-Injektion zu einem schlechten Ergebnis führen (Abbildung 3G). Wir haben bereits gezeigt, dass dieses Protokoll erfolgreich für die Überexpression und den Knockdown von Genen in vivo in pMφ der Maus eingesetzt wird, einschließlich des lentiviralen shRNA-vermittelten Map3k8- und Gata6-Knockdowns und der Gata6-Überexpression ¹⁹. Hier zeigen wir, dass dieses Protokoll auch erfolgreich für die Überexpression von muriner microRNA 146b (mmu-miR-146b) und für den Knockdown des interzellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM1, CD54) unter Verwendung lentiviraler abgeleiteter shRNA in residenten pMφ eingesetzt werden kann (Abbildung 3H,I).

Die Infektion von Primärzellen, wie z.B. Makrophagen, erfordert einen höheren Lentivirus-Input, vermutlich aufgrund des Vorhandenseins von Restriktionsfaktoren in diesen Zellen. Restriktionsfaktoren sind natürliche Schutzmechanismen von Zellen, die in die Lebenszyklusschritte von Viren eingreifen, wie z. B. die reverse Transkription oder Integration, was zu einer Hemmung der Genexpression aus den Konstrukten führt.

Darüber hinaus zeigte die In-vivo-Validierung des Protokolls keinen Einfluss der i.p. Lentivirus-Verabreichung auf die Lebensfähigkeit der peritonealen Immunzellen (Abbildung 4A) und eine ausgeprägte Infektiosität von residenten pMφ-Subpopulationen (definiert durch die Expression von CD73- und Tim4-Markern) (Abbildung 4B, C). Wichtig ist, dass die produktive Lentivirus-Infektion auf residentes Mφ an der Injektionsstelle beschränkt war, was durch das Fehlen einer signifikanten GFP-Expression im mesenterialen Lymphknoten (mLN), in der Lunge, in der Leber oder in der Milz Mφ nach 7 Tagen nach der Provokation belegt wurde (Abbildung 4D). In Anbetracht der Tatsache, dass in vielen Fällen ein genetisches Targeting von Mφ unter entzündlichen Bedingungen durchgeführt werden muss, untersuchten wir die Wirksamkeit dieses Protokolls bei Mäusen, die intraperitoneal mit 0,1 ml 4% Thioglykolat konfrontiert wurden. Die Injektion von Thioglycolaten löst einen Zustrom von entzündlichen Monozyten-abgeleiteten Mφ- und Monozytenzellen aus, die in 5 verschiedene Populationen unterteilt werden können (Abbildung 4E). Die durchflusszytometrische Analyse ergab einen refraktären Phänotyp von monozytären Zellen (Ly6C hi-Populationen 1 und 2) für eine Lentivirus-Infektion, was mit früheren Befunden in menschlichen Zellen übereinstimmt²⁶. Im Gegensatz dazu blieben residente Mφ und Monozyten (Gruppen 3-5) am anfälligsten für Infektionen (Abbildung 4F).

Eine detaillierte durchflusszytometrische Analyse detektierte die GFP-Expression überwiegend in residenten peritonealen Mφ und Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse II⁺ residenten pMφ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (bis zu 60 % am Tag 3 nach der Injektion) (Abbildung 5A). In anderen Peritonealzellpopulationen, einschließlich aus dem Knochenmark stammender peritonealer Mφs/DCs (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), B-Zellen (CD19⁺), T-Zellen (CD3⁺), Mastzellen (CD11b^-, FcεR1⁺), Eosinophilen (Siglec-F⁺), ^NK-Zellen (CD19-, NK1.1⁺) und Neutrophilen (Ly6G⁺) wurde wenig bis kein GFP-Signal nachgewiesen (Abbildung 5A,B). Die Langlebigkeit der GFP-Expression (Abbildung 5C) folgte in allen Populationen der des residenten peritonealen Mφ (Abbildung 1D). Ein vorübergehender Anstieg der Neutrophilenfrequenz wurde 4 Stunden nach der i.p. Injektion von 100 μl (in einem Gesamtvolumen von 200 μl serumfreien Medien) des Lentivirus festgestellt (Abbildung 5D), was auf eine frühe leichte Entzündung bei gefährdeten Tieren hinweist. Schließlich kam es bei residenten pMφ zu einem starken Rückgang der Häufigkeit zwischen Tag 7 und 14 nach der Infektion (Abbildung 5E), was auf das beste experimentelle Zeitfenster zwischen Tag 3 und 7 nach der Injektion hindeutet.

Abbildung 1: Lentivirus-Produktion in HEK293T Zellen. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von HEK293T Zellen 48h nach erfolgreicher Transfektion (Fluoreszenzmikroskop [488 nm Anregungspeak, 510 nm Emissionspeak], 20-fache Vergrößerung, Maßstabsbalken = 400 μm). (B) Foto eines konischen Ultrazentrifugenröhrchens, das eine Schicht aus 20 % Saccharose (unten, klar) und eine Schicht Medium enthält, das aus transfizierten HEK293T Zellen gewonnen wurde (oben, rot). (C) Foto des korrekten Einsetzens der konischen Ultrazentrifuge in den Eimer, einschließlich des Adapters. (D) Fotos, die das korrekte und falsche Auswuchten des Ultrazentrifugenrotors zeigen. (E) Foto des optimalen Aufbaus des Cat-II-Schranks und der Materialien für In-vivo-Injektionen für Rechtshänder. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ipseiz N et ^al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Lentivirus-Titration in Jurkat-T-Zellen. (A) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Jurkat-T-Zellen 72 h nach der Infektion mit steigenden Dosen von Lentivirus, die ein GFP-Plasmid enthalten, das den prozentualen Anteil der GFP⁺ -Zellen (GFP⁺), (B) die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der GFP⁺ -Zellen und (C) ein repräsentatives Histogramm der GFP-Expression zeigt. (D) Streudiagramm mit MFI (links Y) und dem Prozentsatz der Zellen, die mit einem GFP-exprimierenden Lentivirus infiziert sind (rechts Y) im Vergleich zur Kopienzahl des pro pg DNA nachgewiesenen Virus (x-Achse). (E) Ein repräsentatives Histogramm einer Jurkat-T-Zell-Infektion mit suboptimaler Vorbereitung und Kontrolle des Cre-GFP-Lentivirus (Cre-GFP LV) zur Vorbereitung und Kontrolle des GFP-Lentivirus (GFP LV) und (F) zusammenfassende Daten, die den Prozentsatz der mit Cre-GFP-Lentiviren infizierten Jurkat-T-Zellen (GFP⁺) zeigen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ipseiz N et ^al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Infektionseffizienz des residenten pMФ. (A) ^{Gating-Strategie} von residenten pMφ (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) und Tim4-, F4/80⁺ Zellen. Die Zellen wurden auf Singuletts fixiert, gefolgt von CD11b⁺. (B) Repräsentative Punktdiagramme und (C) eine Zusammenfassung der Infektionshäufigkeit (% GFP+-Zellen) und -intensität (MFI) von GFP⁺-Zellen, die 3 Tage nach der In-vivo-Infektion mit unterschiedlichen Mengen an GFP-Lentiviruspräparaten isoliert wurden. (D) Repräsentatives Punktdiagramm und (E) eine Zusammenfassung der Infektionshäufigkeit (% GFP+-Zellen) und -intensität (MFI) von GFP+-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer In-vivo-Infektion mit 100 μl Lentivirus in einem Gesamtvolumen von 200 μl serumfreiem Medienmedium isoliert wurden. (F) Eine Zusammenfassung der Zellzahlen an den Tagen 7, 14 und 21 nach intraperitonealer Verabreichung von GFP-exprimierenden Lentiviren in Foxp3-DTR-eGFP-Mäusen, die die Anzahl der GFP-exprimierenden pMφ und inflammatorischen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigt (InfMØs/DCs [F480^niedrig]). (n= 1-2 pro Gruppe). (G) Repräsentatives Dot Plot der suboptimalen in vivo Infektion von Gata6-KO ^{mye 19} resident pMφ mit 300 μl Cre-GFP Lentivirus 7 Tage nach i.p. Injektion. (H) RT-qPCR-Quantifizierung der mmu-miR-146b-5p-Expression von residentem peritonealem Mφ in vivo mit 100 μL Lentivirus, das für murine microRNA-146b (miR-146b) kodiert, oder Kontrolle (C). Residente pMφ (weiße Kreise) und Tim4^-, F4/80⁺ Zellen (graue Kreise). (I) Ein repräsentativer Dot Plot der erfolgreichen Herunterregulierung von ICAM1 auf pMφ bei weiblichen 129S6-Mäusen, 7 Tage nach i.p-Injektion von Lentivirus, die auf shRNA abzielen. Die Kontroll-shRNA ist dargestellt. Das Overlay zeigt die Isotypsteuerung. Die Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SEM, n≥2 Mäuse. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ipseiz N et ^al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Infektionseffizienz der residenten pMφ-Subpopulationen. (A) Prozentsatz der Gesamtzahl der Einzelzellen und des residenten Mφ, die 7 Tage nach 100 μl serumfreiem Medium (-) oder GFP-Lentivirus (+) i.p. Injektion lebensfähig sind. (B) Gating-Strategie, die vier Hauptpopulationen von pMφ zeigt, die in vivo gefunden wurden: CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4^-, CD73⁺Tim4^-, CD73-Tim4⁺, und (C) die entsprechende Infektionshäufigkeit (% GFP+-Zellen) und Intensität (MFI von GFP+-Zellen) dieser Populationen. (D) Prozentsatz der GFP+-Zellen in mehreren Organen 7 Tage nach 100 μl Lentivirus-i.p-Injektion. Abkürzungen: mLN, mesenterialer Lymphknoten. (E) Mäuse wurden 5 Tage lang mit 0,1 ml 4 % Thioglykolat i.p. injiziert, gefolgt von einer i.p. Injektion mit Lentivirus. Gating-Strategie von pMφ und Monozyten nach 3 Tagen nach der Lentivirus-i.p-Injektion. (F) Analyse der Infektionshäufigkeit, MFI und Zellzahl von GFP+-Monozyten (Ly6C⁺) und Mφ (Ly6C^-). Die Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SEM, n≥3 Mäuse. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ipseiz N et ^al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Einfluss der Lentivirus-Injektion auf die Bauchfellentzündung. Mäusen wurde in vivo i.p GFP-exprimierendes Lentivirus injiziert. (A) Infektionshäufigkeit von Zellpopulationen in der Peritonealhöhle nach verschiedenen Mengen von Lentivirus-Injektionen (50 μL, 100 μL, 150 μL oder 200 μL). (B) Intensität der GFP-Expression in produktiv infizierten Zellpopulationen 7 Tage nach der i.p-Injektion. (C) Infektionshäufigkeit von Zellpopulationen in der Peritonealhöhle zu verschiedenen Zeitpunkten nach der i.p. Injektion. (D) und (E) Prozentsatz der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der i.p-Injektion. Alle Lentivirus-Injektionen wurden mit dem gleichen Gesamtvolumen von 200 μl durchgeführt, ergänzt durch serumfreies Medienmedium. Sofern nicht anders angegeben, wurde eine Lentivirus-Dosis von 100 μl verwendet. Kontrollmäuse ("C") erhielten 200 μl sauberes, serumfreies Medienmedium. Die Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SEM, n≥3 Mäuse. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ipseiz N et ^al.18 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antikörper-Ziel	Fluorophor	Klonen	Verwendete Verdünnung	Endkonzentration [μg/ml]
HIV-1-Kernantigen	RD1	Nr. FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5	1A8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17A2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500A2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	Nr. N418	1/800	0.25
CD11c	BV605	Nr. N418	1/400	0.5
Nr. CD226	Nr. AF647	10 E 5	1/400	1.25
Tim4	Nr. AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	APC	GK1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70	1/400	0.5
F4/80	Pazifisches Blau	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	2.5
CD19	V450	1D3	1/400	0.5
CD19	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	Nr. E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	APC/Cy7	PK136	1/400	0.5
FceR1	eFluor450	1. MÄRZ	1/400	0.5
ICAM1	PE	Nr. 1A29	1/100	2
Ratte IgG1, κ Isotyp-Kontrolle	PE		1/100	2

Tabelle 1: Liste der Antikörper

Diskussion

Geweberesidente Makrophagen erfüllen eine Reihe von homöostatischen und entzündlichen gewebespezifischen Funktionen ^1,2, die von ihrer physiologischen Umgebung diktiert^werden 6,7,8,9. In diesem Protokoll wurde ein wirksames Verfahren¹⁸ zur Manipulation von peritonealen residenten Makrophagen in vivo unter Verwendung von Lentiviruspartikeln eingeführt, um die Funktion von Makrophagen in ihrer biologischen Mikroumgebung zu untersuchen.

Für den Erfolg des Protokolls ist es unerlässlich, gesunde HEK293T Zellen zu verwenden. Es empfiehlt sich, die Zellen mindestens eine Woche vor Beginn dieses Protokolls aufzutauen, um eine Zellregeneration und eine gute Anzahl zu gewährleisten. Die Zellen sollten einen Tag vor der geplanten Transfektion in einem geeigneten Volumen des Mediums ausgesät werden und am Tag der Transfektion eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Unter- oder überkonfluente Zellpräparate führen zu einer verringerten Lentivirus-Ausbeute. Wir empfehlen, HEK293T Zellen mit dem Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers zu transfizieren, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Zu den wesentlichen Schritten der Transfektion gehören das geeignete Mischen der Plasmide und Reagenzien und die tropfenweise Zugabe der Mischung direkt in die HEK293T Zellmonoschicht. Die Calciumphosphat-Transfektion von HEK293T Zellen^27,28 könnte in diesem Protokoll eingesetzt werden. Der Benutzer sollte sich jedoch darüber im Klaren sein, dass die Wirksamkeit dieser Methode variieren kann und zu einer verminderten Transfektionseffizienz führen kann.

Sicherheitsvorkehrungen sollten ab dem Tag der HEK293T Zelltransfektion im Protokoll berücksichtigt werden. Dazu gehören das Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank der Kategorie II, das Tragen von Doppelhandschuhen beim Umgang mit kontaminiertem Material und das sachgerechte Bleichen des kontaminierten Materials (mit Dekontaminationslösung, z. B. 2.000 ppm Bleichlösung) für mindestens 4 h. Die Nutzer sollten sich auf ihre institutionellen Vorschriften für die Arbeit mit Krankheitserregern und Abfällen der Kategorie II beziehen.

Bei diesem Protokoll wird das Lentivirus-Präparat zunächst mit einem 0,45-μm-Filter aufgereinigt, um HEK293T Zelltrümmer zu entfernen. Die Verwendung kleinerer Filter (0,22 μm) und Celluloseester-Membranen sollte vermieden werden, da dies zum Verlust von Lentivirus-Partikeln führt. Es wird empfohlen, Polyethersulfon- oder Polyvinylidenfluoridfilter mit geringer Proteinbindung^{zu verwenden 29}. Der zweite Reinigungsschritt wird an der einzelnen 20%igen Saccharoseschicht in einer Ultrazentrifuge durchgeführt, um verbleibende Verunreinigungen zu entfernen, was besonders wichtig für die anschließende In-vivo-Verabreichung des Lentivirus-Präparats ist. In den Einrichtungen, in denen keine Ultrazentrifuge zur Verfügung steht, haben^{andere 30} die Lentivirus-Aufreinigung auf Saccharosebasis mit einer Standard-Laborzentrifuge beschrieben. Dies könnte in diesem Protokoll als Alternative implementiert werden. Die Lentiviruspräparation wird in Jurkat-T-Zellen anhand der Expression des Markersignals titriert (z. B. GFP, das in diesem Protokoll verwendet wird). Für Konstrukte ohne Marker könnten physikalische Lentiviruspartikel durch Quantifizierung des HIV-1 p24gag-Proteins mittels ELISA-Kit³¹, durchflusszytometrische Analyse des HIV-1-Kernantigens¹⁸ oder Messung der Veränderungen am Zielgen (vorzugsweise unter Verwendung von Methoden, die die Messung von Veränderungen in einzelnen Zellen ermöglichen, z. B. Durchflusszytometrie oder Mikroskopie) evaluiert werden. Wenn sich die Titration von Kontroll- und Lentivirus-Zellen in Jurkat-T-Zellen signifikant unterscheidet, können die für die In-vivo-Studien verwendeten Volumina angepasst werden, um die am besten vergleichbare Infektion zwischen Lentivirus-Präparaten zu erreichen.

Die Haupteinschränkung des Protokolls ist das beobachtete Verschwinden von GFP⁺ -residentem peritonealem Mφ innerhalb von 14 Tagen nach der Injektion des i.p. Lentivirus. Für Langzeitstudien sollten Mauslinien mit stabiler genetischer Veränderung in einem bestimmten Zelltyp oder Gewebe in Betracht gezogen werden³². Da Peritonealmakrophagen beispielsweise Foxp3 (ein T-Reg-Protein) nicht exprimieren, verwendeten wir Foxp3-DTR-eGFP-Mäuse³³ und bestätigten, dass die Expression von GFP in peritonealem Mφ 21 Tage nach der Infektion aufrechterhalten wird (Abbildung 3F). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Lentiviren andere fremde Bestandteile enthalten, und diese Verlängerung der Persistenz infizierter Zellen in den Foxp3-DTR-GFP-Mäusen ist möglicherweise nicht dauerhaft. Eine weitere Schwäche dieser Methode ist ein geringes Entzündungsniveau, das in der Peritonealhöhle nach der Lentivirus-Injektion beobachtet werden kann, wie der Zustrom von Neutrophilen 4 h nach der Injektion bezeugt wird (Abbildung 5D), was bedeuten kann, dass wiederholte Infektionen den entzündungsassoziierten Verlust von GFP-exprimierendem residentem peritonealem Mφ beschleunigen würden. Obwohl wir keine Typ-I-Interferone (IFNs) in der Peritonealhöhle nachgewiesen haben, wurde zuvor gezeigt, dass VSV-G-pseudotypisierte Lentiviruspartikel einige der IFN-stimulierten Gene in humanem Mφ in Abwesenheit von nachweisbaren IFNs induzieren³⁴. Dies sollte bei der Verwendung dieses Protokolls für Experimente zur Untersuchung antiviraler Immunreaktionen berücksichtigt werden. Das Auftreten einer akuten und anhaltenden Entzündung nach i.p. Injektion eines Lentiviruspräparats kann auf eine Kontamination des Präparats hinweisen.

Zu den Bereichen der Fehlerbehebung gehören: 1) bei niedrigem Lentivirus-Titer die Gesundheit der HEK293T Zellen und eine effektive Transfektion sicherstellen (z. B. Markerexpression, falls vorhanden, in HEK293T Zellen). Wenn die Infektionsrate niedrig bleibt, sollten Sie die Größe des Konstrukts berücksichtigen. Konstrukte mit größeren Inserts oder komplexeren Sekundärstrukturen können den endgültigen Lentivirus-Titer und die Infektiosität beeinflussen²⁴. Daher sollte jedes Konstrukt unabhängig und parallel zu seinem jeweiligen Kontrollvektor getestet werden; 2) Wenn eine hohe Menge des Lentivirus benötigt wird, wird empfohlen, mehrere T175-Flaschen mit HEK293T Zellen herzustellen und die Produktion entsprechend zu erhöhen. Um Variationen bei den Lentivirus-Präparaten zu vermeiden, empfiehlt es sich, die endgültigen Entnahmen vor der Aliquotierung und Lagerung zusammenzuführen. Für eine solche größere Produktion sollte die Plasmidmischung (Abschnitt 2) in 50-ml-Röhrchen hergestellt werden, um ein effektives Mischen der Komponenten zu gewährleisten.

Trotz ihres breiten Tropismus zielen VSV-G-pseudotypisierte lentivirale Partikel überwiegend auf Gewebemakrophagen ab, wie zuvor für Alveoläre³⁵ und hier¹⁸ für pMФ gezeigt wurde, wenn sie auf den jeweiligen Wegen verabreicht werden. Veränderungen der Hülle auf Lentiviruspartikeln können in einigen Fällen zu einer verminderten Transduktion von Makrophagen in vivo^{führen 36} und sind für dieses Protokoll nicht erforderlich. Im Vergleich zu anderen viralen Ansätzen zur in vivo Genmanipulation in Makrophagen (überprüft in³⁷) bietet die Verwendung lentiviraler Vektoren eine stabile Integration des Transgens in Gewebemakrophagen³⁵, eine effiziente Transgenexpression und die größte Vektorgrößengrenze (ca. 8 Kb).

Peritoneale Mφ spielen eine wichtige Rolle bei der Prävention, dem Beginn, dem Fortschreiten und der Heilung verschiedener Krankheiten, einschließlich Bauchkrebs, Pankreatitis und Peritonitis³⁸. Dieses Protokoll beschreibt ein effektives Werkzeug zur Genmodifikation in murinen pMφ, das es ermöglicht, die biologischen Prozesse hinter diesen Pathologien in einer physiologisch relevanten Mikroumgebung zu untersuchen. Während lentivirale Vektoren selbst aufgrund der Herkunft aus dem Immundefizienzvirus und einer stabilen Genomintegration zu einem interessanten Werkzeug für klinische Interventionen³⁹ werden, behindern Sicherheitsbedenken ihre therapeutische Umsetzung. Ein besseres Verständnis der Makrophagenreaktionen auf lentivirale Genmodulation könnte die Anwendung dieses hochwirksamen Werkzeugs im klinischen Umfeld vorantreiben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L oder 0,02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
; m steriler Millex GP Filter	Merck	SLGS033SS
0,45 μ m steriler Millex GP Filter	Merck	SLHP033RS
0,5 mL U-100 Insulinspritze mit Nadel, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
1 Liter Behälter für scharfe Gegenstände	N/A	N/A
2,4G2 Antikörper (TruStain FcX Anti-Maus CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m Sieb	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV Medium (Forschungsqualität), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blockierungspuffer	im Haus
Brewer Thioglycolat Medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% Stammlösung in Wasser hergestellt, autoklaviert und gefroren aufbewahrt.
CD11b	Biolegend	101222	die Verdünnung und Konzentration
CD11b	BD	550993	die Verdünnung und Konzentration
CD11c	Biolegend	117317	Für die Verdünnung und Konzentration
CD11c	Biolegend	117333	die Verdünnung und Konzentration CD19 BD Siehe Tabelle 1 Für die Verdünnung und Konzentration
CD19	BD	560375	die Verdünnung und Konzentration
CD19	Biolegend	152410	Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
CD226	Biolegend	128808	Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
CD3e	BD	560527	Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
CD3e	Biolegend	152313	Verdünnung und Konzentration
CD4	Biolegend	100412	Verdünnung und Konzentration CD73 Verdünnung und Konzentration
CD73		und	1 siehe Tabelle 1 Verdünnung und Konzentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Verdünnung und Konzentration
Zellkulturkolben (T175 Flasche, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One 658175
Zentrifugenröhrchen, Röhrchen mit konischem Boden 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Zentrifugen	Beckman Coulter		Ultrazentrifuge und TC Zentrifuge
Kollagenase Typ IV	Sigma-Aldrich	C5138
Konische Zentrifugenröhrchen (15 mL und 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Kryoröhrchen	Greiner Bio One	123277	oder Kryoröhrchen
DMEM Medium (1x) + 4,5g/L D-Glukose, 400 & Mikro; M L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene Transfektionsreagenz	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1
F4/80	Biolegend	123133	Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1
F4/80	Biolegend	123147	Verdünnung und Konzentration
von FceR1	eBioscience	48-5898-80	Verdünnung und Konzentration
fötalem Kälberserum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	hitzeinaktiviert für 30 min bei 56 °; C und steril filtriert durch 0,22 μ m Filter
Durchflusszytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Durchflusszytometrie (FACS) Puffer	wird im eigenen Haus
Fluoreszierendes Gewebekulturmikroskop	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Pinzette	N/A	N/A	Benutzerpräferenz
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T Zelllinie			mindestens eine Woche vor der Transfektion angebaut. Mykoplasmenfrei
HIV-1 Core Antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex chirurgisches Peeling, Chlorhexidingluconat 4% w/v Hautreiniger	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration
der Jurkat-T-Zelllinie			, die mindestens eine Woche vor der Anwendung gezüchtet wurde. Mykoplasmen-frei
LEBEND/TOT fixierbar Nah-IR-Färbekit für tote Zellen	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration
Hier verwendete Mäuse			C57BL/6 Weibchen im Alter von 8-12 Wochen (Charles Rivers), sofern nicht anders angegeben
Mikrokapillarpipetten (Volumenbereich 0,5-1.000 μ L)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
von Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148-500G	hergestellt auf 2 % w/v in PBS
pCMV-& Delta; R8.91 Verpackungsplasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	kodiert für das Gag-Pol HIV-Protein, das vom Cytomegalievirus-Promotor angetrieben wird. Ampicilin-Resistenz.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10.000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petrischale	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW Plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modifiziert für shRNA- und miR-Expressionsstudien. Kodiert den EGFP-Marker, den stromabwärts gelegenen SFFV-Promotor und stromaufwärts des hepatitiven Woodchuck-Virusverstärkers. Ampicilin-Resistenz.
Das pMD2.G-Plasmid		Naldini, L. et al. 1996	kodiert für das vesikuläre Stomatisvirus-Glykoprotein (VSV-G)-Hüllkurve. Ampicilin-Resistenz.
Ratten-IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle	Becton Dickinson	550617	Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration
Rattenserum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Rotes Blut ACK Lysepuffer	hergestellt im Haus
RPMI 1640 Medium (1x) + 400 μM L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	die Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1
Natriumhypochlorit-Tabletten (Bleichmittel, 2.000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-Well-Zellkulturplatte	Greiner Bio One	662160
Steril Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ und Ca2+ - frei	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR Einweg-Transferpipetten (23,0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Saccharose	Thermo Fisher Scientific	15503022
chirurgische Schere	N/A	N/A	Spritzen mit Benutzerpräferenz
(50 mL und 1 0 mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration
96-Well-Zellkulturplatte	Greiner Bio One	650180