Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

يمكن أن تكون نماذج الماوس أدوات مفيدة للتحقيق في بيولوجيا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE). لقد ثبت أن الفئران يمكن أن تطور مجموعة من أمراض RPE. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتوضيح وقياس أمراض RPE في الفئران باستخدام الضوء وإلكترون الانتقال والمجهر متحد البؤر.

Abstract

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو اضطراب شبكي موهن لدى السكان المسنين. من المعتقد على نطاق واسع أن الخلل الوظيفي في ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي رئيسي في AMD. لفهم الآليات التي تؤدي إلى خلل وظيفي في RPE ، يمكن للباحثين استخدام نماذج الماوس. لقد ثبت من خلال الدراسات السابقة أن الفئران يمكن أن تصاب بأمراض RPE ، والتي لوحظ بعضها في عيون الأفراد الذين تم تشخيص إصابتهم ب AMD. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE في الفئران. يتضمن هذا البروتوكول تحضير وتقييم المقاطع العرضية للشبكية باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني النافذ ، بالإضافة إلى حوامل RPE المسطحة بواسطة المجهر متحد البؤر. نقوم بتفصيل الأنواع الشائعة من أمراض RPE الفئران التي لوحظتها هذه التقنيات وطرق تحديدها من خلال طرق غير متحيزة للاختبار الإحصائي. كدليل على المفهوم ، نستخدم بروتوكول التنميط الظاهري RPE هذا لتحديد أمراض RPE التي لوحظت في الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين عبر الغشاء 135 (Tmem135) والفئران البرية القديمة من النوع C57BL / 6J. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقديم طرق التنميط الظاهري RPE القياسية مع تقييمات كمية غير متحيزة للعلماء الذين يستخدمون نماذج الفئران من AMD.

Introduction

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو مرض شائع يصيب السكان الذين تزيد أعمارهم عن 55عاما 1. يعتقد العديد من الباحثين أن الخلل الوظيفي داخل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) هو حدث بيولوجي مرضي مبكر وحاسم في AMD2. RPE عبارة عن طبقة أحادية من الخلايا المستقطبة المكلفة بالحفاظ على توازن المستقبلات الضوئية المجاورة والأوعية الدموية المشيمية3. توجد مجموعة متنوعة من النماذج للتحقيق في الآليات المرتبطة بالمرض داخل RPE ، بما في ذلك نماذج زراعة الخلايا4،5 والفئران6،7،8. وقد وصف تقرير حديث البروتوكولات الموحدة ومعايير مراقبة الجودة لنماذج زراعة الخلاياRPE 4 ، ومع ذلك لم يحاول أي تقرير توحيد التنميط الظاهري ل RPE في نماذج الماوس. في الواقع ، تفتقر العديد من المنشورات حول نماذج الماوس من AMD إلى وصف كامل ل RPE أو القياس الكمي لأمراض RPE فيها. الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم طرق التنميط الظاهري RPE القياسية مع تقييمات كمية غير متحيزة للعلماء الذين يستخدمون نماذج الفئران AMD.

لاحظت المنشورات السابقة وجود العديد من أمراض RPE في الفئران من خلال ثلاث تقنيات تصوير. على سبيل المثال ، يسمح الفحص المجهري الضوئي للباحثين بعرض التشكل الإجمالي لشبكية الفئران (الشكل 1 أ) واكتشاف أمراض RPE مثل ترقق RPE والفراغ والهجرة. يتجلى ترقق RPE في نموذج ماوس AMD من خلال انحراف في ارتفاع RPE عن عناصر التحكم الخاصة بكل منها (الشكل 1B). يمكن تقسيم فراغ RPE إلى فئتين منفصلتين: الفراغ الدقيق (الشكل 1C) والفراغ الكبير (الشكل 1D). يتم تلخيص الفراغ الدقيق RPE من خلال وجود فجوات في RPE لا تؤثر على ارتفاعه الكلي ، في حين يشار إلى الفراغ الكبير من خلال وجود فجوات تبرز في الأجزاء الخارجية من المستقبلات الضوئية. تتميز هجرة RPE بالمجموع البؤري للصبغة فوق الطبقة الأحادية RPE في مقطع عرضي للشبكية (الشكل 1E). وتجدر الإشارة إلى أن خلايا RPE المهاجرة في عيون المتبرعين بالتنكس البقعي المرتبط بالعمر تظهر تفاعلا مناعيا مع علامات الخلايا المناعية ، مثل مجموعة التمايز 68 (CD68) 9 ، ويمكن أن تمثل الخلايا المناعية التي تبتلع حطام RPE أو RPE التي تخضع للتمايز9. يمكن أن تسمح تقنية تصوير أخرى تسمى المجهر الإلكتروني النافذ للباحثين بتصور البنية التحتية ل RPE وغشاءها القاعدي (الشكل 2 أ). يمكن لهذه التقنية تحديد رواسب RPE الفرعية السائدة في الفئران ، والمعروفة باسم الرواسب الصفحية القاعدية (BLamD) (الشكل 2B)10. أخيرا ، يمكن أن يكشف الفحص المجهري متحد البؤر عن بنية خلايا RPE من خلال تصوير حوامل مسطحة RPE (الشكل 3 أ). يمكن لهذه الطريقة الكشف عن تشوه RPE ، وهو انحراف RPE عن شكل قرص العسل الكلاسيكي (الشكل 3B). يمكنه أيضا اكتشاف تعدد نوى RPE ، وجود ثلاث نوى أو أكثر داخل خلية RPE (الشكل 3C). للحصول على ملخص لأنواع أمراض RPE الموجودة في نماذج الماوس AMD الحالية ، نحيل الباحثين إلى هذه المراجعات من الأدبيات 6,7.

يجب أن يكون الباحثون الذين يدرسون AMD على دراية بمزايا وعيوب استخدام الفئران للتحقيق في أمراض RPE قبل بروتوكول التنميط الظاهري. الفئران مفيدة بسبب عمرها القصير نسبيا وفعاليتها من حيث التكلفة ، فضلا عن قابليتها للتلاعب الجيني والدوائي. تظهر الفئران أيضا تغيرات تنكسية RPE ، بما في ذلك هجرة RPE ، وخلل التشوه ، وتعدد النوى ، والتي لوحظت في عيون المتبرعين AMD 11،12،13،14،15،16،17 ؛ هذا يشير إلى أن آليات مماثلة قد تكمن وراء تطور أمراض RPE هذه في الفئران والبشر. ومع ذلك ، هناك اختلافات رئيسية تحد من قابلية ترجمة دراسات الفئران إلى AMD البشري. أولا ، لا تحتوي الفئران على بقعة ، وهي منطقة متميزة تشريحيا من شبكية العين البشرية ضرورية لحدة البصر التي تتأثر بشكل تفضيلي في AMD. ثانيا ، لا تظهر بعض أمراض RPE في الفئران ، مثل ترقق RPE والفراغ ، عادة في عيون المتبرعين ب AMD18. ثالثا ، لا تصاب الفئران بدروسين ، وهي السمة المميزة لعلم الأمراض المرتبط بالعمر19. Drusen عبارة عن رواسب تحتوي على الدهون والبروتين مع عدد قليل جدا من بروتينات الغشاء القاعدي التي تتشكل بين الصفيحة القاعدية RPE وطبقة الكولاجين الداخلية لغشاء Bruch (BrM) 19. يختلف Drusen عن BLamD ، وهو الرواسب الفرعية الشائعة في الفئران ، في كل من تكوينها وموقعها التشريحي. BLamDs هي تشوهات غنية بالمصفوفة خارج الخلية تعتمد على العمر والإجهاد والتي تتشكل بين الصفيحة القاعدية RPE ل BrM والطيات القاعدية ل RPE20. ومن المثير للاهتمام ، أن BLamDs لها تركيبة ومظهر بروتين مماثل في كل من الفئران والبشر6،10،21. تشير الأعمال الحديثة إلى أن BLamDs قد تعمل في البيولوجيا المرضية ل AMD من خلال التأثير على تقدم AMD إلى مراحله اللاحقة18,22 ؛ وبالتالي ، قد تمثل هذه الرواسب RPE المريضة في شبكية الفأر. تعد معرفة هذه الفوائد والقيود أمرا بالغ الأهمية للباحثين المهتمين بترجمة النتائج من دراسات الفئران إلى AMD.

في هذا البروتوكول ، نناقش طرق تحضير العيون للضوء ، وإلكترون الإرسال ، والمجهر متحد البؤر لتصور أمراض RPE. كما وصفنا كيفية قياس أمراض RPE بطريقة غير متحيزة للاختبار الإحصائي. كدليل على المفهوم ، نستخدم بروتوكول التنميط الظاهري RPE للتحقيق في أمراض RPE الهيكلية التي لوحظت في البروتين عبر الغشاء 135- (Tmem135) الفئران المفرطة التعبير والفئران من النوع البري (WT) C57BL / 6J. باختصار ، نهدف إلى وصف منهجية التنميط الظاهري لتوصيف RPE في نماذج الماوس AMD ، حيث لا توجد حاليا بروتوكولات قياسية متاحة. قد لا يجد الباحثون المهتمون بفحص وقياس أمراض المستقبلات الضوئية أو المشيمية ، والتي تتأثر أيضا في نماذج الفئران AMD ، هذا البروتوكول مفيدا لدراساتهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ويسكونسن ماديسون ، وهي متوافقة مع بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. تقييم RPE الماوس بواسطة المجهر الضوئي

  1. اصنع عازلا مثبتا يحتوي على تركيز نهائي قدره 2٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوتارالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) في زجاجة زجاجية.
    ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول ، على الأكثر ، 14 مل من المخزن المؤقت المثبت لكل ماوس.
    تنبيه: بارافورمالدهيد والجلوتارالدهيد من المواد الخطرة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع هذه المواد.
  2. قم بإعداد نظام تروية تغذية بالجاذبية على وسادة سفلية ماصة للتروية القلبية في غطاء الدخان (الشكل التكميلي 1 أ).
    1. ضع 40 مل من المخزن المؤقت المثبت في برميل المحقنة لنظام التروية (الشكل التكميلي 1 ب).
    2. أدر الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر خط الأنبوب (الشكل التكميلي 1C). اغسل الخط بمخزن مؤقت حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من الخط.
    3. أدر الصمام حتى يصبح عموديا على خط الأنبوب لمنع المخزن المؤقت من التدفق إلى خط الأنبوب (الشكل التكميلي 1 د).
      ملاحظة: نظام التروية جاهز الآن للاستخدام.
  3. القتل الرحيم للفأر عن طريق وضعه في غرفة ثاني أكسيد الكربون (CO2) والسماحلثاني أكسيد الكربون بالتدفق إلى الغرفة بمعدل تدفق 30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بمجرد توقف الماوس عن التنفس ، اسمح لثاني أكسيد الكربون2 بالتدفق إلى الغرفة لمدة 1 دقيقة على الأقل. تحقق من نفاد الماوس قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن استخدام القتل الرحيم من خلال حقن العوامل الدوائية في هذا البروتوكول كبديل لاستنشاق CO2 .
  4. أداء نضح القلب على الفأر القتل الرحيم.
    1. انقل الماوس إلى صينية ضحلة بالقرب من نظام التروية مع توجيه بطنه لأعلى. رش البطن مع 70 ٪ من الإيثانول (EtOH).
    2. قم بعمل أربعة شقوق لكشف تجويف البطن (الشكل التكميلي 2 أ).
      1. قم بعمل قطع أدنى بمقدار 5 سم باستخدام مقص منحني وملقط عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيسر الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري مباشرة.
      2. المضي قدما في إجراء قطع وسطي 3 سم من خلال الجلد وجدار البطن من الماوس الذي يبدأ في الجزء العلوي من قطع أدنى.
      3. قم بعمل قطع آخر أدنى بمقدار 5 سم في نهاية الشق الإنسي عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيمن الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري مباشرة.
      4. قم بعمل شق وسطي آخر بطول 3 سم لإزالة رفرف جلد البطن بالملقط المنحني.
    3. قطع الحجاب الحاجز والقص لكشف القلب (الشكل التكميلي 2B).
      ملاحظة: احرص على تجنب وخز القلب والشرايين والأوردة. سيؤدي التخلص منها إلى نضح قلبي غير فعال.
    4. أدخل إبرة القياس في البطين الأيسر للقلب. أدر الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب. اقطع الأذين الأيمن بمقص منحني للسماح للدم والمثبت بالخروج من القلب (الشكل التكميلي 2C).
    5. اترك 10 مل من المخزن المؤقت المثبت لاختراق الماوس لمدة 1-2 دقيقة على الأقل ، أو حتى يصبح الكبد شاحبا في اللون ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن. بمجرد اكتمال التروية ، أدر الصمام حتى يصبح عموديا على خط الأنبوب لإيقاف تدفق المخزن المؤقت.
  5. استئصال العينين من الماوس بعد نضح القلب.
    1. أخرج الماوس من الدرج الضحل وضع الماوس على الوسادة السفلية الماصة في غطاء الدخان. قم بتوجيه رأس الماوس بحيث تكون العين اليسرى في مواجهة المجرب والعين اليمنى بعيدة عن الأنظار. قم بالتعليق على الجانب العلوي من العين باستخدام صبغة وسم الأنسجة.
    2. ادفع برفق لأسفل بالإبهام والسبابة حول محجر العين لإحداث بروز العين من محجر العين (الشكل التكميلي 3 أ).
    3. خذ مقصا منحنيا وأمسكه بالشفرة بزاوية 30 درجة من مقبس العين. استمر في القطع حول العين بالمقص المنحني بزاوية 30 درجة (الشكل التكميلي 3 ب).
      ملاحظة: لا بأس من قطع الأنسجة الزائدة من محجر العين للحفاظ على سلامة مقلة العين.
    4. أخرج مقلة العين من الرأس بالملقط المنحني وضعها على وسادة سفلية ماصة. قم بشق القرنية بشفرة مشرط رقم 11 وضع العين بالملقط المنحني في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من المخزن المؤقت المثبت. قم بتسمية الأنبوب الدقيق سعة 2 مل مع تحديد الماوس و "اليسار" للإشارة إلى العين اليسرى.
      ملاحظة: يسمح الشق الموجود في القرنية للمثبت باختراق العين بسهولة للحفاظ عليها بشكل أفضل.
    5. كرر الخطوات 1.5.1-1.5.4 للعين اليمنى.
  6. اسمح للعينين بالاحتضان في مخزن مؤقت مثبت طوال الليل على شاكر في غرفة 4 درجات مئوية (C) ، بسرعة 75 دورة في الدقيقة (rpm).
  7. استبدل المخزن المؤقت المثبت ب 2 مل من محلول ملحي عازل فوسفات 1x (PBS). احتضان العينين في 1x PBS لمدة 10 دقائق على شاكر في RT و 75 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  8. تنظيف وتشريح العينين لتوليد شرائح خلفية.
    ملاحظة: الجزء الخلفي هو مقلة عين الفأر مع شبكية العين العصبية ، RPE ، المشيمية ، والصلبة بدون القرنية ، القزحية ، والعدسة.
    1. ضع العين في طبق بتري مملوء ب 1x PBS تحت مجهر تشريح (الشكل التكميلي 4 أ).
    2. ارفع أي دهون وعضلات برفق بعيدا عن مقلة العين باستخدام ملقط رفيع الرأس. قم بقص الدهون والعضلات بعناية باستخدام مقص تشريح دقيق في اتجاه مواز لمقلة العين حتى يكون لمقلة العين لون أسود مزرق موحد (الشكل التكميلي 4 ب).
      ملاحظة: لا تقطع في اتجاه عمودي ، لأن هذا يضر مقلة العين. أيضا ، إذا خرجت صبغة وضع علامة على الأنسجة أثناء المعالجة ، فقم بإعادة التعليق على الجانب العلوي من مقلة العين على الفور.
    3. ضع ملقط ذو رؤوس دقيقة في موقع ثقب القرنية. قطع حول محيط القرنية ، بدءا من موقع البزل ، بمقص تشريح دقيق ، لإزالة القرنية والقزحية من مقلة العين (الشكل التكميلي 4C).
    4. خذ ملقط ذو رؤوس دقيقة وقم بإزالة العدسة برفق من مقلة العين للحصول على الجزء الخلفي (الشكل التكميلي 4D).
    5. ضع الجزء الخلفي مرة أخرى في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من 1x PBS. قم بتخزين الجزء الخلفي في ثلاجة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن تبقى الأجزاء الخلفية في 1x PBS عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل المعالجة الإضافية.
  9. كرر الخطوات 1.3-1.8 لإعداد العيون من الفئران الأخرى في الدراسة.
  10. معالجة وتضمين أحد الأجزاء الخلفية من كل ماوس في البارافين للتقسيم. تأكد من أن الجانب العلوي من الجزء الخلفي في الأعلى.
    ملاحظة: يعتمد المؤلفون على مختبر مبادرات البحوث الانتقالية في علم الأمراض (TRIP) بجامعة ويسكونسن ماديسون (UW) لأداء هذه المهام. فيما يلي بروتوكولات منشورة باستخدام طريقة مماثلة لمعالجة البارافين وتضمينه23,24.
  11. قم بقص وتقسيم كل كتلة بارافين للحصول على قسم شبكية بسمك 5 ميكرومتر يتضمن رأس العصب البصري ، بالإضافة إلى أربعة أقسام شبكية إضافية بسمك 5 ميكرومتر تفصل بينها 250 ميكرومتر. قم بتسمية الشرائح بتعريف الماوس ورقم المقطع التسلسلي (على سبيل المثال ، 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5). قم بتخزين الشرائح في مربع شرائح.
    ملاحظة: يعتمد المؤلفون على مختبر UW TRIP لخدماتهم في تقسيم البارافين. فيما يلي بروتوكولات منشورة باستخدام طريقة تقسيم البارافينالمماثلة 25,26.
  12. تلطيخ الشرائح التي تحتوي على أقسام الشبكية مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). يمكن العثور على بروتوكول تلطيخ H& E في الشكل التكميلي 5.
    ملاحظة: يجب إكمال جميع خطوات إجراء تلطيخ H& E في غطاء الدخان.
  13. اجمع صورا مخيطة لأقسام شبكية العين الملطخة ب H& E باستخدام شريط مقياس باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 20x.
  14. تحديد سمك RPE في صور الشبكية التي تحتوي على رأس العصب البصري لكل عينة.
    1. قم بتنزيل وفتح برنامج Fiji ImageJ. اسحب جميع صور الشبكية المخيطة التي تحتوي على رأس العصب البصري إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة مقياس الصورة بالميكرومتر وليس بالبكسل.
      ملاحظة: يوجد مقياس الصورة في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة التي تحتوي على صورة شبكية في برنامج Fiji ImageJ. إذا تم ضبط المقياس بالبكسل ، فيرجى الرجوع إلى دليل التعليمات الخاص ببرنامج Fiji ImageJ لتحويل وحدات البكسل إلى ميكرومتر.
    2. ضع علامة على كل فاصل زمني قدره 300 ميكرومتر في كل صورة من حافة رأس العصب البصري إلى نهاية الشبكية (ora serrata). انقر على أيقونة مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر واسحب خطا من حافة رأس العصب البصري باتجاه ora serrata الذي يبلغ طوله 300 ميكرومتر. انقر فوق أداة Paintbrush في شريط مهام Fiji ImageJ وانقر فوق نهاية خط 300 ميكرومتر لتمييزه.
    3. قم بقياس سمك RPE في كل فترة زمنية محددة. انقر على أيقونة مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر فوق خط واسحبه من أعلى إلى أسفل RPE (الشكل التكميلي 6). انقر فوق تحليل > قياس في شريط قوائم Fiji ImageJ للحصول على سمك RPE.
    4. انقل قياسات سمك RPE إلى جدول بيانات وقم بتسمية العمود الذي يحتوي على القياسات بتعريف الماوس. قم بتسمية عمود إضافي ب "الفاصل الزمني المحدد" وأدخل المسافة بعيدا عن قيم العصب البصري (أي 300 ، 600 ، 900 ، إلخ.)
      ملاحظة: الفاصل الزمني الأول المقاس يتوافق مع 300 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري ، والفاصل الزمني الثاني المقاس يتوافق مع 600 ميكرومتر ، وهكذا.
  15. تحديد معدلات حدوث أمراض RPE بناء على صور الشبكية لكل عينة.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ.
    2. افتح تطبيق عداد الخلية داخل برنامج Fiji ImageJ. انقر فوق المكونات الإضافية > تحليل عداد الخلايا > في شريط قوائم Fiji ImageJ. اسحب صورة شبكية العين إلى شريط مهام Fiji ImageJ وانقر فوق تهيئة في نافذة عداد الخلايا .
    3. احسب عدد أمراض RPE لكل قسم شبكية باستخدام تطبيق عداد الخلايا . انقر فوق النوع 1 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث الفراغ الدقيق في الصورة. انقر فوق النوع 2 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث macrovacuolization في الصورة. انقر فوق النوع 3 ضمن العدادات ثم انقر فوق جميع أحداث الترحيل الفردية في الصورة.
    4. نقل أرقام أمراض RPE إلى جدول بيانات. قم بتسمية الصفوف إما بالفراغ الدقيق أو الفراغ الكبير أو الترحيل والعمود بتعريف الماوس.
    5. كرر الخطوات 1.15.2-1.15.4 للصور الأخرى للعينة. متوسط عدد أمراض RPE لكل عينة واقسم على خمسة لحساب معدل حدوث كل أمراض RPE للعينة في جدول البيانات.
  16. إجراء تحليل إحصائي على سمك RPE في كل فترة ومعدلات حدوث أمراض RPE لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في الدراسة.

2. تقييم RPE للفأر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ

  1. قطع الأجزاء الخلفية الأخرى الناتجة بعد الخطوات 1.5-1.9 إلى النصف من خلال العلامة العليا إلى قسمين بشفرة حلاقة. أعد التعليق على الجانب العلوي من الأجزاء الخلفية المجزأة بصبغة وسم الأنسجة. افصل الأجزاء الخلفية المجزأة إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 2 مل تحتوي على 2 مل من 1x PBS وتحديد الماوس.
    ملاحظة: الجزء الخلفي للفأر كبير جدا بحيث لا يمكن معالجته في قطعة واحدة ويجب قطعه إلى النصف لمعالجة المجهر الإلكتروني النافذ.
  2. شطف الأنسجة مع 2 مل من 0.1 M كاكوديلات العازلة ، ودرجة الحموضة 7.2. احتضان لمدة 10 دقائق في RT على سطح الطاولة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  3. استبدل المخزن المؤقت للكاكوديلات 0.1 M ب 2 مل من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ (OsO4) المخفف في محلول كاكوديلات 0.1 M. احتضان لمدة 1.5 ساعة في RT في غطاء الدخان.
    تنبيه: OsO4 مادة سامة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع OsO4.
  4. اشطف المناديل ب 2 مل من محلول كاكوديلات 0.1 متر لمدة 10 دقائق في RT في غطاء الدخان. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  5. قم بتجفيف الأنسجة بتخفيفات EtOH متدرجة تتراوح من 50٪ إلى 100٪ عند RT في غطاء الدخان. يمكن العثور على بروتوكول لإجراء الجفاف في الشكل التكميلي 7.
  6. إزالة 100٪ EtOH من الأنسجة وإضافة 2 مل من أكسيد البروبيلين إلى الأنسجة. احتضان في RT في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة أكسيد البروبيلين من الأنسجة وأضف 2 مل من أكسيد البروبيلين الطازج إلى الأنسجة. احتضان في RT في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة.
    تنبيه: أكسيد البروبيلين مادة سامة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع أكسيد البروبيلين.
  7. أزل أكسيد البروبيلين من الأنسجة وأضف 2 مل من خليط 1: 1 من أكسيد البروبيلين والراتنج إلى الأنسجة. اتركيه طوال الليل تحت فراغ في غطاء الدخان في RT.
    تنبيه: الراتنج مادة خطرة على البشر. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية للمختبر عند العمل مع الراتنج.
  8. استبدل خليط 1: 1 من أكسيد البروبيلين والراتنج من الأنسجة ب 2 مل من الراتنج النقي. اتركيه طوال الليل تحت فراغ في غطاء الدخان في RT .
  9. تضمين الأنسجة في الراتنج. ضع ملصقا مع تعريف الماوس بالقلم الرصاص وقطرة من الراتنج في القالب . ضع الأنسجة على قطرة من الراتنج. املأ القالب بالراتنج وضعه تحت فراغ لمدة 1 ساعة في RT في غطاء الدخان.
  10. أعد وضع الملصقات والعينات باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة ، مع وضع الجانب الخلفي من قسم فنجان العين الخلفي في الأعلى. اترك القالب طوال الليل على حرارة 65 درجة مئوية في فرن في شفاط الدخان.
  11. أخرج القوالب من الفرن. اترك القوالب لتبرد إلى RT على سطح الطاولة. إزالة الكتل من القوالب.
    ملاحظة: الكتل جاهزة الآن للتشذيب.
  12. قم بتشكيل كتل الراتنج بشفرة حلاقة لتشكيل شبه منحرف. قم بقص كتل الراتنج باستخدام ميكروتوم حتى يصبح رأس العصب البصري مرئيا. تابع استخدام سكين الماس لقطع المقاطع شبه الرقيقة من كتل الراتنج بسمك 0.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: هنا بروتوكول منشور على قسم microtome27. إذا رغبت في ذلك ، يمكن جمع مقاطع شبه رقيقة بسمك 0.5 ميكرومتر من كتل الراتنج وتلوينها لتقييم سلامة العينة.
  13. قم بقص مقطع فائق النحافة بسمك 70 نانومتر من كل كتلة مشذبة باستخدام microtome ultra. اجمع مقطعا فائق النحافة بسمك 70 نانومتر على شبكة نحاسية رفيعة القضيب 400 شبكة. ضع الشبكة في صندوق تخزين شبكي وقم بتسمية الفتحة بتعريف الماوس.
    ملاحظة: هنا بروتوكول منشور حول قسم ultramicrotome28.
  14. قم بتلطيخ الشبكات بأسيتات يورانيل 2٪ لمدة 5 دقائق ثم بمحلول سترات الرصاص 3.5٪ لمدة 5 دقائق في RT في غطاء الدخان.
    تنبيه: أسيتات اليورانيل وسترات الرصاص من المواد الخطرة. يرجى اتباع إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع هذه المواد.
  15. احصل على صور لكل عينة باستخدام مجهر إلكتروني نافذ بتكبير 15000x ، حيث تتقاطع خطوط الشبكة النحاسية مع RPE و BrM.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 20 إلى 35 صورة لكل قسم و 40 إلى 70 صورة لكل عينة.
  16. تحديد ارتفاعات BLamD في الصور للعينات في الدراسة.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ. اسحب كل الصور من قسم العينة إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة الصور بالميكرومتر وليس بالبكسل.
    2. قم بقياس ارتفاع BLamD في الصور. انقر فوق الرمز مستقيم في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر واسحب خطا من الصفيحة المرنة ل BrM إلى أعلى أطول إيداع في الصورة (الشكل التكميلي 8). انقر تحليل > قياس في شريط قوائم فيجي ImageJ للحصول على ارتفاع BLamD في الصورة.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك BLamDs في الصورة ، فقم برسم خط من الصفيحة المرنة ل BrM إلى الصفيحة القاعدية ل RPE.
    3. انقل ارتفاعات BLamD إلى جدول بيانات وتسمية مع تحديد الماوس.
  17. احسب الترددات التراكمية لارتفاعات BLamD لكل نمط جيني ومتوسطات ارتفاعات BLamD لكل ماوس في جدول البيانات. إجراء تحليل إحصائي على متوسطات ارتفاعات BLamD لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في الدراسة.

3. تقييم RPE الماوس من خلال المجهر متحد البؤر

  1. جمع عيون من الفئران. القتل الرحيم للفئران وفقا للإجراء الموضح في الخطوة 1.3. قم باستئصال العينين باستخدام الخطوة 1.5. ضع العينين باستخدام ملقط منحني في أنبوب دقيق سعة 2 مل مع 2 مل من 1x PBS وتحديد الماوس.
    ملاحظة: لا تتكيف مع الفئران بشكل مظلم ، لأن الرقمنة بين المستقبلات الضوئية والعمليات القمية RPE تسمح بتصور أفضل ل RPE من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.
  2. نظف وتشريح عيون الفأر على الفور لتوليد أكواب العين الخلفية للفأر.
    ملاحظة: يختلف فنجان العين الخلفي عن الجزء الخلفي لأنه لا يحتوي على شبكية العين العصبية.
    1. انقل العين إلى طبق بتري يحتوي على 1x PBS تحت مجهر تشريح (الشكل التكميلي 9 أ).
    2. قم بإزالة الدهون والعضلات من مقلة العين ، كما هو موضح في الخطوة 1.8.2 (الشكل التكميلي 9B).
    3. قرنية مقلة العين بشفرة مشرط رقم 11. إزالة القرنية والقزحية ، كما هو مفصل في الخطوة 1.8.3 (الشكل التكميلي 9C).
    4. اسحب العدسة بملقط رفيع الرأس. خذ ملقطين رفيعي الرأس وافصل الشبكية العصبية برفق عن الجزء الخلفي.
    5. قطع بعناية شبكية العين العصبية في رأس العصب البصري لإزالتها من فنجان العين الخلفي (الشكل التكميلي 9D).
    6. ضع فنجان العين الخلفي في أنبوب دقيق جديد سعة 2 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 1x PBS مع تحديد الماوس.
  3. ثبت أكواب العين الخلفية بالميثانول (MeOH) (الشكل التكميلي 10).
    ملاحظة: تستغرق الخطوة 3.3 حوالي 2 ساعة و 40 دقيقة لإكمالها.
    1. أضف 500 ميكرولتر من MeOH إلى الأنسجة. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    2. قم بإزالة 500 ميكرولتر من المحلول من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من MeOH. احتضان لمدة 5 دقائق على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    3. قم بإزالة المحلول بالكامل من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من MeOH. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
      ملاحظة: كبديل للخطوة 3.3.3 ، يمكن تحضين فنجان العين الخلفي طوال الليل في MeOH على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة في غرفة 4 درجات مئوية.
    4. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنسجة. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    5. قم بإزالة 500 ميكرولتر من المحلول من الأنسجة وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    6. قم بإزالة المحلول بالكامل من الأنسجة واستبدله ب 500 ميكرولتر من 1x PBS.
      ملاحظة: يتم إصلاح الأنسجة بالكامل بواسطة MeOH ويمكن الاحتفاظ بها في ثلاجة 4 °C لمدة 1 شهر على الأقل.
  4. إجراء تلطيخ مناعي لأكواب العين الخلفية لتصور الوصلات الضيقة ونوى RPE (الشكل التكميلي 11).
    1. قم بإزالة 500 ميكرولتر من 1x PBS من العينات وأضف 100 ميكرولتر من مصل الحمير العادي المخفف بنسبة 10٪ في محلول 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. قم بإزالة محلول مصل الحمير الطبيعي المخفف بنسبة 10٪ من العينات وأضف 100 ميكرولتر من تخفيف 1:50 من الجسم المضاد للأرانب متعدد النسيلة المضاد ل Zonula Occludens-1 (ZO-1) في 1x PBS. انقل العينات إلى غرفة 4 درجات مئوية واحتضانها طوال الليل على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة.
    3. قم بإزالة تخفيف الأجسام المضادة من العينات وأضف 2 مل من 1x PBS. احتضان على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
    4. قم بإزالة 1x PBS من العينات. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف 1: 250 من الجسم المضاد IgG المضاد للحمار مع علامة 488 مترافقة بالفلوروفور وتخفيف 1: 250 من 4 '، 6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) في 1x PBS إلى العينات. قم بتغطية العينات بورق الألمنيوم واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في RT.
      ملاحظة: يجب تغطية العينات بالكامل بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي.
    5. قم بإزالة الجسم المضاد وتخفيفات DAPI من العينات. أضف 2 مل من 1x PBS إلى العينات ، وأعد تغطيتها بورق الألمنيوم ، واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى.
      ملاحظة: يتم الآن تمييز الوصلات الضيقة ونوى RPE بالكامل وتلوينها ، على التوالي.
  5. قم بتركيب أكواب العين الخلفية على شرائح المجهر.
    1. قم بتسمية شريحة مجهر بتعريف الماوس. انقل فنجان العين الخلفي إلى شريحة مجهرية تحت مجهر تشريح مع توجيه الجانب المشيمي لأسفل. أضف قطرة من 1x PBS إلى فنجان العين الخلفي لمنعه من الجفاف (الشكل التكميلي 12).
    2. اقطع فنجان العين الخلفي باستخدام شفرة مشرط رقم 11 في أربع نقاط ستنتج أربعة أرباع تتوافق مع الاتجاهات الأساسية (أي الشمال والشرق والجنوب والغرب). ربت الزائد 1x PBS مع الأنسجة من محيط فنجان العين الخلفي. قم بتسطيح فنجان العين الخلفي برفق باستخدام فرشاة شعر الجمل والملقط ذي الرؤوس الدقيقة (الشكل التكميلي 12).
      ملاحظة: يعرف المنتج الناتج الآن باسم حامل مسطح RPE.
    3. أضف قطرة من وسيط التثبيت إلى الحامل المسطح RPE وضع غطاء فوقه. ضع طلاء أظافر شفاف لإغلاق غطاء الغطاء واتركه يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT في درج مغلق. ضع الشرائح في صندوق حامل منزلق واحتفظ بالصندوق في ثلاجة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: كن حذرا لتجنب إدخال فقاعات على حامل RPE المسطح. يمكن تصوير حوامل RPE المسطحة في غضون إطار زمني مدته 2 أسبوع.
  6. احصل على صورة لكل من الأرباع الأربعة المحيطة بالعصب البصري للحامل المسطح RPE على مجهر متحد البؤر عند تكبير 20x لكل عينة. يمكن العثور على مثال لصورة التثبيت المسطح RPE في الشكل التكميلي 13A.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري إجراء تصوير مكدس z للحوامل المسطحة RPE حيث يتم التقاط صور متعددة وتكديسها للتعويض عن اختلافات الأبعاد للحامل المسطح RPE.
  7. تتبع التقاطعات الضيقة لخلايا RPE داخل كل صورة تحميل مسطحة RPE. يمكن العثور على مثال لصورة التثبيت المسطح RPE التي تم تتبعها في الشكل التكميلي 13B.
    1. افتح برنامج فيجي ImageJ. اسحب صورة تحميل مسطحة RPE إلى شريط مهام Fiji ImageJ. تحقق من معايرة الصورة بالميكرومتر وليس بالبكسل.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة أداة فرشاة التراكب في شريط مهام Fiji ImageJ لضبط عرض الفرشاة على 3 والشفافية على 0 واللون على الأحمر. انقر زر إغلاق في نافذة أداة فرشاة التراكب .
    3. انقر على أيقونة أداة فرشاة التراكب . انقر واسحب على التقاطعات الضيقة لجميع خلايا RPE الموجودة بالكامل داخل الصورة.
      ملاحظة: في حالة حدوث خطأ في التتبع ، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز أداة فرشاة التراكب وانقر فوق المربع تراجع في نافذة أداة فرشاة التراكب لإزالة خطأ التتبع من الصورة.
    4. انقر فوق رمز المستطيل في شريط مهام Fiji ImageJ. انقر على الصورة واسحب حول محيط الصورة. انقر فوق تحرير > مسح على شريط قوائم Fiji ImageJ للاحتفاظ بالخطوط المتعقبة وإزالة أي ألوان زرقاء وخضراء من الصورة.
    5. احفظ صورة التتبع في موقع مناسب مع تعريف الماوس والموقع الرباعي (أي الشمال أو الجنوب أو الشرق أو الغرب) وتسمية لاحقة CP.
      ملاحظة: لا تقم بحفظ صورة تتبع RPE قبل إكمال الخطوة 3.7.4.
  8. احسب مساحات خلايا RPE لكل عينة.
    1. قم بتعيين موقع لحفظ الملفات من تحليل منطقة RPE عن طريق إنشاء مجلد على شاشة سطح مكتب الكمبيوتر. قم بإنشاء مجلدات فرعية لكل صورة تتبع RPE وقم بتسمية المجلدات الفرعية بتعريف الماوس بالإضافة إلى الموقع الرباعي (أي الشمال أو الجنوب أو الشرق أو الغرب).
    2. قم بتثبيت وفتح برنامج Cell Profiler29. قم بتنزيل ملف مشروع Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (ملف الترميز التكميلي 1). افتح الملف Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj بالنقر فوق ملف > فتح المشروع في شريط قوائم برنامج منشئ ملفات تعريف الخلايا.
    3. اسحب صورة تتبع RPE واحدة إلى الصورة > مربع إسقاط الملفات والمجلدات هنا في نافذة برنامج منشئ ملفات التعريف الخلوية.
    4. أدخل موقع المجلد في برنامج منشئ ملفات تعريف الخلية الذي يتوافق مع صورة تتبع RPE. انقر فوق الزر "إعدادات الإخراج" في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة برنامج Cell Profiler وأدخل موقع المجلد في مربعات نص مجلد الإدخال الافتراضي ومجلد الإخراج الافتراضي.
    5. انقر فوق الزر "تحليل الصور " في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة برنامج Cell Profiler. بعد اكتمال التحليل، ستظهر نافذة اكتمال التحليل على الشاشة. انقر فوق الزر "موافق " في نافذة اكتمال التحليل .
      ملاحظة: سيؤدي هذا الإجراء إلى إنشاء ملف csv وصورة jpeg. سيحتوي ملف csv على مناطق لخلايا RPE داخل صورة التتبع. ستتوافق صورة jpeg مع صورة تتبع RPE ، حيث سيتم تسمية كل خلية RPE برقم (الشكل التكميلي 13C).
    6. انقل مناطق RPE من ملف csv إلى جدول بيانات. قم بتسمية جدول البيانات بتعريف الماوس.
    7. قم بإجراء مسح لمراقبة الجودة للبيانات من خلال التأكد من أن كل منطقة RPE في ملف csv ترتبط بخلية RPE تم تتبعها بالكامل في صورة jpeg. قم بإزالة أية قيم من جدول البيانات لا تتوافق مع خلايا RPE التي تم تتبعها بالكامل.
    8. ارجع إلى برنامج منشئ ملفات تعريف الخلية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم صورة تتبع RPE في مربع إسقاط الملفات والمجلدات هنا وحدد مسح القائمة لإزالة الصورة من برنامج Cell Profiler.
    9. كرر الخطوات 3.8.3-3.8.8 لحساب أحجام RPE لصور تتبع RPE الثلاثة المتبقية للعينة.
  9. حدد متوسطات حجم خلية RPE لكل عينة في جدول البيانات.
  10. حدد كثافات خلايا RPE لكل عينة في جدول البيانات. لحساب كثافة خلايا RPE ، قسم العدد الإجمالي لخلايا RPE لكل ربع على المساحة الإجمالية لخلايا RPE لكل ربع تم اكتشافه بواسطة برنامج Cell Profiler. أوجد متوسط كثافة خلايا RPE من الأرباع الأربعة لكل عينة.
  11. حدد عدد خلايا RPE متعددة النوى لكل حامل مسطح RPE لكل عينة. استخدم تطبيق عداد الخلايا ضمن برنامج Fiji ImageJ ، كما هو موضح في الخطوات 1.15.1-1.15.3 ، لحساب عدد خلايا RPE التي تحتوي على أكثر من ثلاث نوى في أربعة أرباع من العينة.
  12. إجراء تحليل إحصائي على حجم خلية RPE ومتوسطات الكثافة، بالإضافة إلى عدد خلايا RPE متعددة النوى لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات كبيرة بين المجموعات في الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر إكمال بروتوكول التنميط الظاهري RPE الموضح في هذه المقالة تحليلا كميا لتشوهات RPE الهيكلية التي لوحظت بشكل شائع في نماذج الماوس من AMD. لتأكيد فعالية هذا البروتوكول ، استخدمناه في الفئران المعروفة بعرض أمراض RPE ، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن WT Tmem135 مدفوعة بمروج الدجاج بيتا أكتين (Tmem135 TG) 30 والفئران C57BL / 6J 31,32. الهدف من هذه التجارب هو إظهار نتائج تمثيلية يمكن الحصول عليها باستخدام الطرق الموضحة في هذا البروتوكول للباحثين الجدد في نماذج الفئران.

لقد التزمنا بالطرق الواردة في الخطوة 1 من البروتوكول لمعالجة وتقييم العيون من الفئران WT و Tmem135 TG لتقييم أمراض RPE باستخدام المجهر الضوئي. وجدنا أن الفئران Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر لديها انخفاض كبير في سمك RPE على فترتين مقاستين بالنسبة إلى WT المطابق للعمر من خلال ANOVA مع اختبار Tukey اللاحق (الشكل 4). تشير هذه النتائج إلى أن RPE أرق في الفئران Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر مقارنة بفئران WT المتطابقة مع العمر عند 600 و 900 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري.

بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام طرق الخطوة 1 من البروتوكول ، قمنا بحساب حدوث أمراض RPE ، بما في ذلك الفراغ الدقيق ، والفراغ الكبير ، وهجرة ثلاثة فئران WT و Tmem135 TG عمرها 25 يوما (الشكل 5 أ). كان متوسط تواتر أمراض الفراغ الدقيق RPE لكل شريحة في الفئران WT 0.67 ± 0.31 وفي الفئران Tmem135 TG كان 7.07 ± 0.61 (الشكل 5B). لم يكن هناك فراغ كبير RPE في الفئران WT ، ولكن كان هناك ، في المتوسط ، 5.33 ± 2.02 أحداث الفراغ الكبير في الفئران Tmem135 TG (الشكل 5C). أخيرا ، كانت معدلات خلايا RPE المهاجرة لكل شريحة صفرا في الفئران WT و 0.4 ± 0.35 في الفئران Tmem135 TG (الشكل 5D). بعد إجراء اختبار t للطالب ، كان حدوث الفراغ الدقيق RPE والفراغ الدقيق مختلفا بشكل كبير بين الفئران WT و Tmem135 TG . ومع ذلك ، فإن ارتفاع معدل الإصابة بالخلايا المهاجرة RPE في الفئران Tmem135 TG لم يكن مختلفا بشكل كبير مقارنة ب WT (p = 0.1161). تظهر هذه البيانات أن الفراغ الدقيق RPE والفراغ الكبير ، ولكن ليس الهجرة ، أعلى بكثير في Tmem135 TG البالغ من العمر 25 يوما من الفئران WT.

باتباع طرق البروتوكول المضمنة في الخطوة 2 ، قمنا بإعداد أقسام شبكية العين من الفئران WT C57BL / 6J البالغة من العمر شهرين و 24 شهرا للفحص المجهري الإلكتروني لتحليل وجود وارتفاعات BLamDs. وجدنا BLamDs موجودة في شبكية WT البالغة من العمر 24 شهرا والتي كانت غائبة بشكل ملحوظ في شبكية WT البالغة من العمر شهرين (الشكل 6A). قدمنا ارتفاعات BLamDs في شبكية العين WT البالغة من العمر 24 شهرا من خلال حساب وتخطيط الترددات التراكمية لحدوثها. تم رسم الترددات التراكمية لارتفاعات BLamD مقابل ارتفاع الرواسب لتوضيح توزيع ارتفاعات الودائع. هناك تحول إلى يمين الخط لارتفاعات WT BLamD البالغة من العمر 24 شهرا مقارنة بارتفاعات WT BLamD البالغة من العمر شهرين ، مما يدل على زيادة الرواسب في فئران WT البالغة من العمر 24 شهرا (الشكل 6B). يدعم هذا الرسم البياني متوسط أكبر لارتفاعات BLamD في شبكية العين WT البالغة من العمر 24 شهرا (1.01 ميكرومتر ± 0.43 ميكرومتر) من شبكية WT البالغة من العمر شهرين (0.23 ميكرومتر ± 0.017 ميكرومتر) ، والتي كانت مختلفة بشكل كبير عن طريق اختبار t للطالب (الشكل 6C). باختصار ، نستنتج أن فئران WT البالغة من العمر 24 شهرا لديها BLamDs كبيرة في مساحة RPE الفرعية لشبكية العين مقارنة بفئران WT البالغة من العمر شهرين.

طبقنا طرق تحضير العيون من الفئران WT و Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر في الخطوة 3 لإنشاء حوامل مسطحة RPE لاكتشاف وتحليل خلل التشوه RPE وتعدد النوى. في هذا البروتوكول ، حددنا تشوه RPE من خلال التغييرات في حجم خلية RPE وكثافتها في نموذج ماوس AMD بالنسبة إلى عناصر التحكم الخاصة بهم. وجدنا أن RPE في الفئران Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر مشوهة (الشكل 7 أ). RPE في شبكية Tmem135 TG أكبر (806.89 ميكرومتر 2 ± 252.67 مقابل 291.69 ميكرومتر 2 ± 26.31) وأقل كثافة (0.0014 خلية / ميكرومتر 2 ± 0.00039 مقابل 0.0033 خلية / ميكرومتر 2 ± 0.00024) من شبكية WT المتطابقة مع العمر (الشكل 7B ، C). علاوة على ذلك ، كان هناك المزيد من خلايا RPE متعددة النوى في شبكية Tmem135 TG مقارنة بعناصر التحكم WT (8.04 خلية ± 5.54 مقابل 0.33 خلية ± 0.29) (الشكل 7D). وصلت كل هذه المعلمات إلى دلالة إحصائية مع اختبار t للطالب. معا ، تمتلك فئران Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر خلايا RPE مشوهة ومتعددة النوى أكثر من فئران WT البالغة من العمر 4 أشهر.

Figure 1
الشكل 1: أمراض RPE المكتشفة بواسطة المجهر الضوئي. صور تمثيلية ل RPE العادي في WT (A) و RPE غير الطبيعي في الفئران Tmem135 TG (B-E). تشمل أمراض RPE التي لوحظت في الفئران Tmem135 TG ترقق RPE (B) ، والفراغ الكبير (C) ، والفراغ الدقيق (D) ، والهجرة (E). يتم توضيح كل علم الأمراض بواسطة سهم أسود. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. التكبير = 20x. الاختصارات: RGC = طبقة خلية العقدة الشبكية ، IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ، INL = الطبقة النووية الداخلية ، OPL = طبقة الضفيرة الخارجية ، ONL = الطبقة النووية الخارجية ، IS = الأجزاء الداخلية للمستقبلات الضوئية ، OS = الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية ، RPE = ظهارة مصطبغة في شبكية العين ، Cho = المشيمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أمراض RPE المكتشفة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. صور تمثيلية ل (A) RPE في فئران CFH-H / H و (B) البالغة من العمر 2 عاما والتي تحتوي على رواسب رقائقية قاعدية وفيرة (BLamDs). يتم تتبع BLamDs بنقاط صفراء في الصورة. شريط المقياس = 800 نانومتر. التكبير = 15000x. الاختصارات: N = نواة ، M = الميتوكوندريون ، P = حبيبات الصباغ ، BI = الطيات القاعدية ، EL = الصفيحة المرنة ، RPE = ظهارة مصطبغة في شبكية العين ، BrM = غشاء Bruch ، Cho = المشيمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أمراض RPE المكتشفة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. صور تمثيلية ل (A) RPE العادي ل WT البالغ من العمر 8 أشهر و (B) RPE غير الطبيعي لفئران Tmem135 TG البالغة من العمر 8 أشهر والتي تظهر تشوه RPE. يتم تكبير المربع الأبيض (C) لتصوير خلية RPE متعددة النوى بثلاث نوى. اللون الأخضر هو تقاطعات ضيقة مرتبطة ب RPE مضادة ل ZO1 ، واللون الأزرق هو تلطيخ DAPI لنوى RPE. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. التكبير = 20x. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: سمك RPE في الفئران البرية من النوع البري (WT) و Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر. (أ) صور تمثيلية لشبكية العين من الفئران WT و Tmem135 TG (TG) البالغة من العمر 4 أشهر. التكبير = 20x. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) الرسوم البيانية الخطية لقياسات سمك RPE في الفئران WT (السوداء) و Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر (الخضراء) حتى 3000 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري. تشير الأرقام بعد النمط الوراثي إلى عدد الفئران المستخدمة في هذه الدراسة. * p < 0.05 ، ANOVA مع اختبار Tukey اللاحق. جميع البيانات تعني ± sd. يرجى الاطلاع على وسيلة إيضاح الشكل 1 لمعرفة اختصارات طبقات الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أمراض RPE في الفئران Tmem135 TG البالغة من العمر 25 يوما. (أ) صور تمثيلية للفراغ المجهري RPE ، والفراغ الكبير ، والهجرة في ثلاثة فئران Tmem135 TG (TG) عمرها 25 يوما. يتم تمييز أمراض RPE بواسطة أسهم سوداء في كل صورة. التكبير = 40x. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (B-D) القياس الكمي للفراغ الدقيق والكبير RPE وكذلك خلايا RPE المهاجرة في الفئران WT و Tmem135 TG البالغة من العمر 25 يوما. تشير الأرقام الموجودة بين قوسين إلى عدد الفئران المستخدمة في هذه الدراسة. * p < 0.05 و **** p < 0.0001 ، اختبار t للطالب. جميع البيانات تعني ± sd. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحليل البنيوي ل BLamDs في شبكية العين WT الصغيرة والمسنين . (أ) صور مجهرية إلكترونية تمثيلية ل WT RPE بعمر شهرين و 24 شهرا. التكبير = 15000x. شريط المقياس = 800 نانومتر. مثال على الرواسب الصفحية القاعدية (BLamD) مخطط بقوس. (ب) الترددات التراكمية لارتفاعات BLamD. (ج) متوسطات ارتفاع BLamD. تشير الأرقام الموجودة بين قوسين إلى العدد الإجمالي للفئران لكل نمط وراثي مستخدم في هذه الدراسة. ** P < 0.01 ، اختبار t للطالب. جميع البيانات تعني ± sd. يرجى الاطلاع على وسيلة إيضاح الشكل 2 لمعرفة اختصارات طبقات الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تكشف حوامل RPE المسطحة عن أمراض RPE في الفئران Tmem135 TG. (أ) صور تمثيلية لحوامل مسطحة WT و Tmem135 TG (TG) RPE تبلغ من العمر 4 أشهر مع مضاد ZO-1 باللون الأخضر و DAPI باللون الأزرق. التكبير = 20x. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) حجم خلية RPE ، (ج) كثافة خلايا RPE ، و (د) تعدد نوى RPE في الفئران WT و Tmem135 TG البالغة من العمر 4 أشهر. يشير الرقم الموجود بين قوسين إلى عدد الفئران المستخدمة في الدراسة. * p < 0.05 و ** p < 0.01 و **** p < 0.0001 ، اختبار t للطالب. جميع البيانات تعني ± sd. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: رسم تخطيطي لإعداد نضح القلب واستخدامه. أ: نظام التروية بالتغذية بالجاذبية. (ب) برميل حقنة من نظام التروية للمخزن المؤقت المثبت. (ج) تدوير الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر خط الأنبوب. د: تدوير الصمام حتى يصبح عموديا على خط الأنبوب لمنع المخزن المؤقت من التدفق إلى خط الأنبوب. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: رسم تخطيطي لإجراء التروية القلبية للفأر. أ: أربع شقوق لكشف تجويف البطن. ب: قطع يتم إجراؤه من خلال الحجاب الحاجز والقص لكشف القلب. ج: إبرة قياس تدخل في البطين الأيسر للقلب. يتم تشغيل الصمام حتى يصبح موازيا لخط الأنبوب. يتم قطع الأذين الأيمن بمقص منحني للسماح للدم والمثبت بالخروج. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: رسم تخطيطي لإجراء استئصال العينين من الفأر. (أ) ادفع برفق لأسفل بالإبهام والسبابة حول محجر العين لإحداث بروز العين من محجر العين. (ب) خذ مقصا منحنيا وأمسكه بالشفرة بزاوية 30 درجة من محجر العين. استمر في القطع حول العين بالمقص المنحني بزاوية 30 درجة. تمثل النقاط الملونة وضع الإصبع على الماوس أو المقص المنحني. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: صور تشريح عين الفأر للحصول على الجزء الخلفي للفأر. أ: نقل العين إلى مجهر تشريح. ب: إزالة الدهون والعضلات من مقلة العين. ج: إزالة القرنية والقزحية من مقلة العين. د: إزالة العدسة من مقلة العين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H&E). رسم تخطيطي يصور إجراء H&E لتلطيخ أقسام الشبكية المضمنة في البارافين. تشير الأسهم إلى النقل بين الخطوات. يتم إعطاء وقت كل خطوة بخط أحمر. يتم توفير الكواشف للتلطيخ بخط أسود داخل حاويات تلطيخ الزجاج. يجب أن يكون هناك حاوية تلطيخ زجاجية معدة لكل كاشف مدرج في الرسم البياني أعلاه. يجب إكمال جميع الخطوات في غطاء الدخان. عند إضافة غطاء إلى شريحة ، احرص على عدم إدخال فقاعات إلى الشريحة. بعد الانتهاء من الإجراء ، يمكن تخزين الشرائح في مربع شرائح. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: مثال على قياس سمك RPE. يصور السهم الأسود خطا أحمر من أعلى RPE إلى أسفله. يمكن قياس هذا الخط لتحديد سمك RPE. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. التكبير = 20x. يتم تصغير المنطقة المحاصرة لتسهيل عرض RPE. يرجى الاطلاع على وسيلة إيضاح الشكل 1 لمعرفة اختصارات طبقات الشبكية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: إجراء تجفيف EtOH للأجزاء الخلفية للفأر لمعالجة TEM. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8: مثال على قياس ارتفاع BLamD. يصور الخط الأحمر أكبر BLamD في هذه الصورة. تحدد النقاط الصفراء BLamDs في الصورة. يمكن قياس هذا الخط الأحمر لتحديد ارتفاع BLamD في هذه الصورة. شريط المقياس = 800 نانومتر. التكبير = 15000x. يرجى الاطلاع على وسيلة إيضاح الشكل 2 لمعرفة اختصارات طبقات الشبكية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 9: تشريح عين الماوس للتركيب المسطح RPE. (أ) العين المنقولة إلى طبق بتري يحتوي على 1x PBS تحت المجهر تشريح. ب: إزالة الدهون والعضلات من مقلة العين. ج: إزالة القرنية والقزحية من مقلة العين. د: إزالة العدسة والشبكية من مقلة العين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 10: إجراء تثبيت الميثانول (MeOH) لأكواب العين الخلفية للفأر. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 11: إجراء التألق المناعي لتسمية الوصلات الضيقة ونوى خلايا RPE. رسم تخطيطي يوضح خطوات تقنية التألق المناعي من هذا البروتوكول. لاحظ أن هذه التقنية تستغرق 2 أيام لإكمالها. تحدث جميع الخطوات في RT وعلى شاكر بسرعة 75 دورة في الدقيقة ، ما لم يذكر على وجه التحديد في الرسم التخطيطي. كان الجسم المضاد الأساسي (1 درجة) المستخدم في هذه الدراسة هو أرنب متعدد النسيلة مضاد ل ZO1 ، وكان الجسم المضاد الثانوي (2 درجة) المستخدم في هذه الدراسة هو 488 حمار مترافق بالفلوروفور مضاد للأرانب IgG. بمجرد إضافة الجسم المضاد الثانوي و DAPI إلى العينات ، يجب لف العينات بورق الألمنيوم للحماية من التبييض الضوئي للعينة. صورة تم إنشاؤها في Biorender. الاختصارات: NDS = مصل حمار عادي ، Ab = جسم مضاد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 12: تصوير القطع للحصول على أربعة أرباع من التركيب المسطح RPE للماوس. N = الشمال ، E = الشرق ، S = الجنوب ، W = الغرب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 13: أمثلة على نقاط نهاية تحليل التركيب المسطح RPE. ( أ) صورة التركيب المسطح RPE. (ب) صورة تتبع حدود RPE. (ج) صورة تحليل منشئ ملفات تعريف الخلايا RPE. التكبير = 20x. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: حاسبة منطقة Ikeda RPE.cpproj الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكول التنميط الظاهري لتقييم أمراض RPE الهيكلية لنماذج الماوس. وصفنا الخطوات المطلوبة لمعالجة العيون لتقنيات التصوير المختلفة بما في ذلك الضوء وإلكترون الإرسال والمجهر متحد البؤر ، بالإضافة إلى تحديد كمية الأمراض النموذجية التي لوحظت عبر طرق التصوير هذه. لقد أثبتنا فعالية بروتوكول التنميط الظاهري RPE الخاص بنا من خلال فحص Tmem135 TG والفئران WT البالغة من العمر 24 شهرا ، لأن هذه الفئران تظهر أمراض RPE30،31،32. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي فأر معدل وراثيا أو معالج دوائيا قد يؤوي أمراض RPE مثل ترقق RPE ، والفراغ ، والهجرة ، وخلل التشوه ، بالإضافة إلى BLamDs 6,7. على الرغم من أن أمراض RPE التي لوحظت في Tmem135 TG وفئران WT البالغة من العمر 24 شهرا موجودة في نماذج ماوس AMD الأخرى 7,30 ، فمن المهم أن يتعرف الباحث على نموذج الماوس AMD الذي تم اختياره لدراساتهم ، حيث قد يختلف عمر ظهور وشدة أمراض RPE لنموذج الماوس AMD الخاص بهم عن Tmem135 TG والفئران WT البالغة من العمر 24 شهرا. قد يحتاج الباحثون إلى استخدام المزيد من الفئران لدراساتهم أكثر من عدد الفئران المستخدمة لإنتاج النتائج التمثيلية الموضحة في هذه المقالة ، إذا كان عرض أمراض RPE متغيرا في نموذج الفئران AMD الخاص بهم. علاوة على ذلك ، تتوفر العديد من نماذج الفئران AMD حاليا لباحثي AMD ، ولكن ليس لديهم أوصاف كاملة لأمراض RPE الخاصة بهم ، مما قد يتطلب من الباحثين إجراء دراسات أولية للحصول على هذه المعلومات.

على الرغم من أنه يمكن إجراء تعديلات في كيفية معالجة عيون الماوس لطرق التصوير المختلفة ، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على التقييم الكمي لتشوهات RPE الهيكلية كما هو موضح في البروتوكول. على سبيل المثال ، تم إعداد خمسة أقسام شبكية ملطخة ب H& E لحساب عدد أحداث الفراغ المجهري RPE ، والفراغ الكبير ، والهجرة ، مما يسمح للباحثين بتقييم أمراض RPE في مواقع متعددة في شبكية الفأر. مثال آخر هو استخدام شبكة مجهر إلكتروني نحاسي رفيع القضيب 400 شبكي لتقييم تشوهات البنية التحتية ل RPE. توفر شبكة المجهر الإلكتروني إطارا لتقييم عينة الشبكية بشكل منهجي وغير متحيز عن طريق التصوير المجهري الإلكتروني النافذ ، وكذلك الحصول على 40 إلى 70 صورة لكل قسم شبكية لفحص وجود BLamDs. لا يمكن تحقيق ذلك باستخدام شبكة فتحة المجهر الإلكتروني ، ونقترح عدم استخدامها مع هذا البروتوكول. أخيرا ، يتيح التقاط صور تكبير 20x من الأرباع الأربعة لحامل مسطح RPE للباحثين التحقيق في مساحات كبيرة من RPE الفئران بحثا عن خلل التشوه وتعدد النوى. الباحثون أحرار في التوسع في هذا البروتوكول وفحص أقسام شبكية إضافية لأمراض RPE في دراساتهم. معا ، تسمح هذه الطرق للباحثين بجمع بيانات وافرة للتوصل إلى استنتاجات حول أمراض RPE الهيكلية التي قد تكون موجودة في نماذج الماوس AMD الخاصة بهم.

ميزة رئيسية أخرى لهذا البروتوكول هي اتساق طرق التنميط الظاهري RPE. على سبيل المثال ، تم توجيه جميع العيون المستخدمة للضوء والمجهر الإلكتروني للانتقال بواسطة الجانب العلوي من شبكية العين للفأر للتقسيم. من المهم الحفاظ على اتجاه عين الفأر طوال معالجتها للضوء والمجهر الإلكتروني النافذ لأن عين الفأر لها توزيع طبوغرافي لخلايا الشبكية33,34. لم يتم الحفاظ على الاتجاه التشريحي لعين الفأر لإعداد التثبيت المسطح RPE ، حيث لم يتم ملاحظة التغيرات الطبوغرافية المتفوقة على التغييرات الطبوغرافية السفلية لخلية RPE للماوس. في الواقع ، يعرض RPE في شبكية العين البشرية التغيرات الطبوغرافية التي تشع بعيدا عن رأس العصب البصري35 ، مما يشير إلى أن هذا قد يكون هو الحال بالنسبة ل RPE للفأر. أخيرا ، يعتمد الحصول على الصورة الموصوف في هذا البروتوكول على الوضع التشريحي للعصب البصري. سيساعد إدراج هذه الجوانب المنهجية على إعادة إنتاج نتائج أمراض RPE للباحثين أثناء عملهم مع نماذج الماوس AMD الخاصة بهم.

قد يرغب الباحثون في إضافة المزيد من الميزات التحليلية إلى بروتوكول التنميط الظاهري RPE. بعض نتائج النمط الظاهري غير الواردة في هذا البروتوكول هي فحص سمك BrM ، والزغابات الدقيقة القمية RPE ، ومكونات البنية التحتية الأخرى RPE. تشمل هذه المكونات الميتوكوندريا والحبيبات الصبغية والعضيات الأخرى مثل الجسيمات. يمكن للباحثين تحديد حجم وعدد هذه المكونات في الصور المجهرية الإلكترونية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول باستخدام برنامج Fiji ImageJ. على وجه الخصوص ، قد تكون حالة الميتوكوندريا نتيجة مظهرية مهمة يجب مراعاتها ، لأن استهداف الميتوكوندريا في RPE هو استراتيجية علاجية مهمة ل AMD36. نتيجة النمط الظاهري الأخرى هي قياسات إضافية لتشوه RPE على حوامل RPE المسطحة. يمكن فحص صور التثبيت المسطح RPE التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول بحثا عن الشكل السداسي RPE وعدد خلايا RPE المجاورة والخصائص الأخرى باستخدام برنامج REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. نتيجة أخرى محتملة للنمط الظاهري هي ما إذا كانت أمراض RPE تحدث في المناطق المركزية أو الطرفية من شبكية الفأر. ستعمل اعتبارات النمط الظاهري الإضافية هذه على زيادة تعزيز بروتوكول التنميط الظاهري RPE الموصوف في هذه المقالة.

هناك بعض القيود على بروتوكول التنميط الظاهري RPE هذا. أحد قيود هذه الطريقة هو الحاجة إلى التضحية بالفئران لحصاد أعينهم من أجل التنميط الظاهري RPE. كبديل ، تسمح التطورات الجديدة في التصوير المقطعي للتماسك البصري للمجال الطيفي (SD-OCT) بالقياس الكمي لسمك RPE والأمراض في الفئران الحية37-39. قد يكون هذا مفيدا للباحثين الذين يرغبون في إجراء دراسات طولية على مجموعات نموذج الماوس AMD الخاصة بهم. ومن القيود الأخرى لهذه الطريقة عدم وجود تقييمات وظيفية لقواعد الإجراءات والمقاومة الذاتية في الفئران. إذا كان الباحثون مهتمين بتقييم وظيفي ل RPE في الفئران ، فإننا نوصي بإجراء تخطيط كهربية الشبكية وقياس مكون الموجة c ، حيث أن الموجة c تدل على الدور الوظيفي ل RPE في النقل الضوئي40. ومن القيود الأخرى لهذه الطريقة عدم وجود قياسات كيميائية حيوية لعلامات RPE في الفئران. إذا رغب الباحثون في التحقيق في مستويات علامات RPE ، مثل البروتين الخلوي المرتبط بالشبكية (CRABLP) ، أو بروتين 65 كيلو دالتون الخاص بظهارة الشبكية (RPE65) ، أو الفصيلة الفرعية للقناة المصححة للبوتاسيوم داخليا J Member 13 (KCNJ13) ، أو bestrophin 1 (BEST1) ، نوصي بحصاد العيون للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، أو تحليل اللطخة الغربية.

في الختام ، يمكن أن يكون بروتوكول التنميط الظاهري RPE هذا موردا مهما للباحثين الذين يستخدمون نماذج الفئران التي تلخص الجوانب المرضية ل AMD. يعمل هذا البروتوكول أيضا على توحيد كيفية تقييم RPE في نماذج الماوس AMD ، والتي لم يتم وصفها مسبقا في الأدبيات. سيكون توحيد التنميط الظاهري RPE أمرا بالغ الأهمية في ترجمة النتائج من الفئران إلى نماذج أخرى من AMD ، بما في ذلك نماذج زراعة الخلاياRPE 4 ونماذج الكائنات الحية العليا بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية. كما أنه سيساعد في فهمنا للآليات البيولوجية المرضية الكامنة وراء تطوير AMD وربما تطوير علاجات جديدة لهذا المرض المسبب للعمى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى مؤلفي هذا البروتوكول أي إفصاحات وتضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا ساتوشي كينوشيتا ومبادرات البحوث الانتقالية في مختبر علم الأمراض بجامعة ويسكونسن (UW) لإعداد أنسجتنا للفحص المجهري الضوئي. يتم دعم هذا النواة من قبل قسم علم الأمراض والطب المخبري بجامعة ويسكونسن ، ومركز سرطان الكاربون بجامعة ويسكونسن (P30 CA014520) ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (S10OD023526). تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر في UW Biochemistry Optical Core ، والذي تم إنشاؤه بدعم من قسم UW للكيمياء الحيوية. تم دعم هذا العمل أيضا بمنح من المعهد الوطني للعيون (R01EY022086 إلى A. Ikeda; R01EY031748 إلى سي باوز ريكمان ؛ P30EY016665 إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية في UW ؛ P30EY005722 إلى مركز ديوك للعيون ؛ المعاهد الوطنية للصحة T32EY027721 إلى م. لاندوفسكي ؛ F32EY032766 إلى M. Landowski) ، رئاسة تيموثي ويليام تراوت (A. Ikeda) ، جائزة FFB Free Family AMD (C. Bowes Rickman) ؛ ومنحة غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (مركز ديوك للعيون).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ،
بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter