Summary
هنا ، نصف بروتوكولا عاما وتصميما يمكن تطبيقه لتحديد الكميات النزرة والمكونات الثانوية في تركيبات المنتجات الطبيعية المعقدة (المصفوفات) في الطب التبتي.
Abstract
الأدوية التبتية معقدة وتحتوي على العديد من المركبات غير المعروفة ، مما يجعل البحث المتعمق حول هياكلها الجزيئية أمرا بالغ الأهمية. يستخدم الكروماتوغرافيا السائلة - التأين الكهربائي لقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-ESI-TOF-MS) بشكل شائع لاستخراج الطب التبتي. ومع ذلك ، لا يزال هناك العديد من المركبات غير المعروفة التي لا يمكن التنبؤ بها بعد استخدام قاعدة بيانات الطيف. طورت هذه المقالة طريقة عالمية لتحديد المكونات في الطب التبتي باستخدام قياس الطيف الكتلي لمصيدة الأيونات (IT-MS). تتضمن الطريقة بروتوكولات موحدة ومبرمجة لإعداد العينات ، وإعداد MS ، والتشغيل المسبق ل LC ، وإنشاء الطريقة ، واكتساب MS ، وتشغيل MS متعدد المراحل ، وتحليل البيانات اليدوي. تم تحديد مركبين تمثيليين في الطب التبتي بذور مانيهوت Abelmoschus باستخدام تجزئة متعددة المراحل ، مع تحليل مفصل للهياكل المركبة النموذجية. بالإضافة إلى ذلك ، تناقش المقالة جوانب مثل اختيار الوضع الأيوني ، وتعديل الطور المحمول ، وتحسين نطاق المسح ، والتحكم في طاقة الاصطدام ، وتبديل وضع الاصطدام ، وعوامل التجزئة ، وقيود الطريقة. طريقة التحليل الموحدة المطورة عالمية ويمكن تطبيقها على مركبات غير معروفة في الطب التبتي.
Introduction
أصبح التحليل النوعي للمكونات النزرة في الطب الصيني التقليدي (TCM) موضوعا حاسما في البحث. نظرا للأعداد الكبيرة من المركبات في الطب الصيني التقليدي ، من الصعب عزلها لتحليل مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو مقياس حيود الأشعة السينية (XRD) ، مما يجعل الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) التي تتطلب فقط أحجام عينات منخفضة شائعة بشكل متزايد. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام اللوني السائل (LC) إلى جانب مرض التصلب العصبي المتعدد على نطاق واسع في أبحاث الطب الصيني التقليدي في السنوات الأخيرة لتحسين فصل العينات المعقدة والتحليل النوعي للمركبات الكيميائية1. إحدى الطرق الشائعة هي قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة - التأين الكهربائي لوقت الرحلة (LC-ESI-TOF-MS) ، والذي يستخدم على نطاق واسع في البحث النوعي في الطب التبتي2. باستخدام هذه الطريقة ، يتم إثراء المكونات المعقدة وفصلها في عمود LC ، ويتم ملاحظة نسبة الكتلة إلى الشحنة (m / z) للأيونات المقربة باستخدام كاشف MS. يعد البحث في قواعد بيانات MS (MS / MS أو MS2) حاليا أسرع نهج للتعليقات التوضيحية المركبة الموثوقة في تحليل الجزيئات الصغيرة باستخدام وقت الرحلة الرباعي (Q-TOF) MS و OrbitrapMS 3. ومع ذلك ، فإن الجودة الرديئة لقواعد البيانات ووجود أيزومرات مختلفة تعيق تحديد المركبات غير المعروفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المعلومات المقدمة من قاعدة بيانات MS / MS محدودة4،5،6،7. من المهم التحقيق في المركبات الكيميائية في كل الطب الصيني التقليدي باستخدام بروتوكول عام يمكن تطبيقه على نطاق واسع على الطب الصيني التقليدي الآخر.
يلتقط IT-MS مجموعة واسعة من الأيونات من خلال تطبيق جهد تردد لاسلكي مختلف (RF) على أقطاب الحلقة8. يمكن ل IT-MS إجراء عمليات مسح MS متعددة المراحل للسلاسل الزمنية بترتيب زمني متنوع ، مما يوفر تجزئة MS متعددة المراحل للمكونات (MS n) ، حيثn هو عدد مراحل أيون المنتج9. يعتبر Linear IT-MS الأفضل لتحديد الهيكل حيث يمكن استخدامه لتجارب MSn المتسلسلة10. يمكن عزل الأيونات المستهدفة وتجميعها في IT-MS1 الخطية. يوفر MS n (n ≥ 3) في IT-MS معلومات مجزأة أكثر من MS / MS في Q-TOF-MS. نظرا لأن IT-MS لا يمكنه قفل الأيون المستهدف وأيوناته الشظية ، فهو أداة قوية لتوضيح بنية المركبات غير المعروفة ، بما في ذلك الأيزومرات1. تم تطبيق تقنية MSn على نطاق واسع على التحليل الهيكلي للبروتينات والببتيدات والسكريات غير المعروفة11،12. يوفر مستوى وفرة أيونات الشظايا في MSn معلومات أكثر عن الأجزاء الجزيئية حول المركبات المستهدفة في العينات المعقدة من MS / MS في Q-TOF-MS. ومن ثم ، فإن تطبيق تقنية MSn على التحديد الهيكلي في الطب الصيني التقليدي أمر ضروري.
الطب التبتي هو عنصر مهم في الطب الصيني التقليدي13 ، وهذه الأدوية مشتقة في المقام الأول من الحيوانات والنباتات والمعادن الموجودة في منطقة الهضبة14. الطب التبتي بذور مانيهوت أبيلموسكوس (AMS) هو بذرة أبيلموسكوس مانيهوت (لين.) ميديكوس. AMS هو دواء عشبي تقليدي يستخدم لعلاج حالات مثل التهاب الجلد التأتبي والروماتيزم والجذام. يحتوي على الكالكون ، الذي يمتلك تأثيرات مضادة للبكتيريا والفطريات ومضادة للسرطان ومضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات15. في الدراسة الحالية ، تم تحسين إجراءات MS n ، وتم تطوير طريقة مفصلة لتحديد الهياكل المركبة في الطب التبتي AMS باستخدام IT-MS و MSn. تم تحسين بعض معلمات MS ، بما في ذلك الوضع الأيوني ونطاق المسح ووضع التصادم ، للتغلب على المشكلات في تحديد المركبات النزرة. تهدف هذه الدراسة إلى تعزيز تحديد البنية الموحدة للمركبات النزرة في الطب الصيني التقليدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة
- قم بوزن 1 جم من عينة AMS بدقة ، وضعها في دورق مخروطي مع 30 مل من 80٪ ميثانول. انقل الخليط إلى جهاز صوتي حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة من الاستخراج عند 25 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي العينة عند 14000 × جم لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تردد صوتنة حمام الموجات فوق الصوتية هو 40 كيلو هرتز. - تحضير حقنة حقن ومرشح غشاء صغير يسهل اختراقه (0.22 ميكرومتر ، عضوي فقط). قم بتصفية المادة الطافية في زجاجة عينة سعة 2 مل.
2. إعداد مرض التصلب العصبي المتعدد
- قم بتشغيل مفتاح مضخة التفريغ. افتح الصمام الرئيسي لأسطوانة الأرجون وصمام الضغط الجزئي ، واضبط الضغط على 0.3 ميجا باسكال تقريبا. افتح صمام النيتروجين.
ملاحظة: انتظر لمدة 8 ساعات على الأقل لضمان درجة فراغ كافية للظروف التجريبية. تأكد من أن ضغط غاز الأرجون والنيتروجين مرتفع بدرجة كافية قبل التحليل. - قم بتشغيل برنامج التحكم MS. انقر فوق مصدر SEI المسخن في لوحة البرنامج ، وأدخل معلمات MS ، بما في ذلك درجة حرارة السخان (350 درجة مئوية) ، ومعدل تدفق غاز الغمد (35 أرب) ، ومعدل تدفق غاز aux (15 أرب) ، وجهد الرش (3.8 كيلو فولت للوضع الإيجابي ، -2.5 كيلو فولت للوضع السلبي) ، ودرجة حرارة الشعيرات الدموية (275 درجة مئوية). انقر فوق الزر "تطبيق" لتنشيط مصدر الأيون.
3. التشغيل المسبق ل LC ، وإنشاء الطريقة ، واكتساب MS
- تحضير المرحلة المتنقلة A والمرحلة المتنقلة B باستخدام محلول مائي لحمض الفورميك بنسبة 0.1٪ والأسيتونيتريل النقي ، على التوالي. قم بتفريغها في جهاز صوتي حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة على الأقل. قم بتوصيل الحلول بممرات السوائل A و B ، على التوالي (الشكل 1 أ). قم بإعداد محلول ماء الميثانول (1: 9 فولت / فولت) ، ثم املأه في زجاجات سائل التنظيف للمضخة والحاقن يدويا.
ملاحظة: تردد صوتنة حمام الموجات فوق الصوتية هو 40 كيلو هرتز. - قم بتشغيل برنامج التحكم LC-MS.
- انقر فوق زر التحكم المباشر لفتح لوحة تحكم LC. افتح صمام التطهير في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة على وحدة المضخة (الشكل 1 ب).
- انقر فوق الزر "خيار أكثر " لفتح إعداد المضخة ، واضبط معلمات التطهير على 5 mLmin−1 لمدة 3 دقائق. انقر فوق الزر "تطهير " لبدء إزالة الفقاعة. بعد ذلك ، أغلق صمام التطهير.
- انقر فوق المحقنة الرئيسية ، وحلقة الغسيل العازلة ، وأزرار إبرة الغسيل خارجيا لشطف المحقنة لمدة ثلاث دورات ، والحلقة لدورة واحدة ، والإبرة لدورة واحدة ، على التوالي. ضع زجاجة العينة في جهاز أخذ العينات (الشكل 1C).
- انقر فوق الزر "إعداد الأداة " لفتح نافذة تحرير الطريقة. انقر فوق الزر "جديد" لإنشاء طريقة أداة LC-MS جديدة.
- إنشاء وقت تشغيل إجمالي لأسلوب LC. بعد ذلك ، أدخل قيما لتعيين حد الضغط ومعدل التدفق الكلي وتدرج التدفق ودرجة حرارة العينة ودرجة حرارة العمود ودلتا درجة الحرارة الجاهزة في نافذة تحرير الطريقة.
ملاحظة: معدل التدفق الكلي الافتراضي للطور المتحرك ثابت عند 0.3 مل / دقيقة مع 50٪ A و 50٪ B وبدون درجة حرارة العمود في حالة عدم وجود عمود كروماتوغرافي. القيم الافتراضية لدرجة حرارة العينة ودلتا درجة الحرارة الجاهزة هي 15 درجة مئوية و 0.1 درجة مئوية على التوالي. تعتمد الإعدادات الأخرى على نوع عمود الكروماتوغرافيا السائل المستخدم. - حدد نوع تجربة MS أو MS n العام لطريقة MS. أدخل قيما لتكوين وقت الاستحواذ والقطبية ونطاق الكتلة ورقم قيمة التحويل ومدة قيمة التحويل. انقر فوق الزر حفظ لتكوين الإعدادات كطريقة أداة.
ملاحظة: الإعدادات الافتراضية بدون عمود كروماتوغرافي هي كما يلي: وقت الاستحواذ ، 2 دقيقة ؛ قطبية ، إيجابية أو سلبية ؛ نطاق الكتلة ، من 100 إلى 1200 ؛ رقم قيمة التحويل ، 2 ؛ ومدة تحويل القيمة، 1.99 دقيقة.
4. تشغيل قياس الطيف الكتلي متعدد المراحل
- انقر فوق الزر إعداد التسلسل لفتح جدول التسلسل .
- في الجدول، أدخل المعلومات التالية: نوع العينة واسم الملف والمسار ومعرف العينة وطريقة الأداة والموضع وحجم الحقن.
- انقر فوق الزر حفظ لتسجيل جدول التسلسل ، ثم انقر فوق الزر "بدء التحليل" لتنفيذ الإعدادات وبدء اكتساب MS.
ملاحظة: يتم تحديد نوع العينة الافتراضي غير معروف. طريقة الأداة هي الطريقة المحفوظة في الخطوة 3.6. يتم وضع زجاجة العينة في موقعها الفريد في غرفة العينة. على سبيل المثال ، RA1 هو الموقع الأول في الصف الأول من المنطقة الحمراء في غرفة العينة. عادة ما يكون حجم الحقن الافتراضي 2 ميكرولتر ، والذي يعتمد على تركيز العينة.
- انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في المستكشف لتحميل بيانات MS في برنامج معالجة البيانات. في مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسي (BPI) ، حدد المنطقة ذات المساحة القصوى أسفل المنحنى (AUC) بالنقر فوق الماوس وسحبه. سيتم عرض أطياف MS المقابلة في نفس النافذة.
- حدد أيون مستهدف لتحليل MS/MS التالي.
- أعد فتح نافذة تحرير الطريقة. في جدول إعداد MSn ، قم بتعيين m / z للأيون المستهدف إلى منزلة عشرية واحدة في عمود الكتلة الأصلية .
- حدد وضع الاصطدام ، وأدخل قيمة طاقة التصادم (CE). اضبط نطاق فحص MS / MS. انقر فوق الزر حفظ لتسجيل طريقة MS ، وأدخل اسم ملف جديد في جدول التسلسل. انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء اكتساب MS / MS.
ملاحظة: كان نطاق مسح MS / MS 40٪ -130٪ من الأيونات الأصلية المستهدفة. قيمة CE الافتراضية في وضع التفكك الناجم عن الاصطدام (CID) هي 35٪.
- انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في المستكشف لتحميل ملف MS / MS raw في برنامج معالجة البيانات.
- حدد أقوى أيون شظية في طيف MS / MS ، وأدخل قيمة m / z الخاصة به في قائمة طريقة MSn. في جدول إعداد MSn ، قم بتعيين معلمات MS3 ، بما في ذلك وضع التصادم وقيمة CE ونطاق المسح.
- انقر فوق الزر حفظ لتسجيل طريقة MS ، وأدخل اسم ملف جديد في جدول التسلسل. انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء عملية الاستحواذ على MS3 .
- انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في المستكشف لتحميل ملف MS3 raw في برنامج معالجة البيانات. كرر الخطوة 4.4 للحصول على طيف MS4 .
- أكمل تجربة MSn عند ملاحظة عدم ملاحظة أيونات شظايا مستقرة في الطيف.
5. دليل تحليل بيانات MSn
- انقر نقرا مزدوجا فوق الملفات الأولية لفتح جميع أطياف الكتلة من MS إلى MSn. احسب يدويا قيم الفرق m / z بين الأيون وأيونات الشظايا المقابلة.
ملاحظة: على سبيل المثال، كانت قيمة الفرق m/z بين الأيون (m/z 617.25) والأيونات الشظية المقابلة (m/z 571.28) 45.97 في MS/MS، وكانت قيمة الفرق m/z بين الأيون (m/z 571.28) والأيونات الشظية المقابلة (m/z 525.38) 45.90 في MS3، وكانت قيم الفرق m/z بين الأيون (m/z 525.38) والأيونات الشظية المقابلة (m/z 344.93 و273.16) 180.45 و 252.22 في MS4 ، على التوالي. - ارسم الهيكل "الأساسي" يدويا وفقا لنتائج MS4 (المستوى الأخير من MSn). اشتق الهيكل الأصلي يدويا باستخدام مجموعات وظيفية أو مقاطع جزيئية بناء على قيمة الفرق m / z. ارسم مسارات الانقسام الجزيئي يدويا وفقا لكل بنية جزيئية في MSn. أمثلة على الاشتقاق الجزيئي اليدوي مفصلة في قسم النتائج التمثيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام Cellobiose كنموذج للتحقق من جدوى MSn في وضع الأيونات الموجبة. كما هو موضح في الشكل 2A ، أنتج ESI-MS (وضع الأيونات الموجبة) للسيلوبيوز [C 12 H22O11] + جزيء البروتون [M + H] + عند m / z 365. أدى المسح الأيوني للمنتج (CID-MS / MS) ل [M + H] + عند m / z 365 إلى أيون الشظية الثاني عند m / z 305 (الشكل 2B) ، والذي تم تحليله بشكل أكبر باستخدام تحليلات MS3 و MS4 (الشكل 2C ، D). نتج عن تحليل MS3 أيون الشظية الثالث عند m / z 254 ، وأسفر تحليل MS4 عن أيون الشظية الرابع عند m / z 185. كشف تحليل MS / MS (الشكل 2E) أن أيون الشظية المفقود عند m / z 60 يشير إلى سلسلة من تجزئة الأيونات عند m / z 365 ، أي التحلل المائي لفتح الحلقة (محدد باللون الأزرق) ، وانقسام رابطة C-C (ملحوظ باللون الأحمر) ، والجفاف (ملحوظ باللون الأخضر). وبالمثل ، كشف تحليل MS3 أن أيون الشظية المفقود عند m / z 60 يشير إلى انقسام رابطة C-C (المميز باللون الأحمر) للأيون عند m / z 305. أظهر تحليل MS4 أن أيون الشظية المفقود عند m / z 60 يعني التحلل المائي (المميز باللون الأزرق) والجفاف (المميز باللون الأخضر) ، مما يؤدي إلى انقسام الأيون مع m / z 245 إلى أيون مع m / z 185. أشار كسر الخطوة في تحليل MSn إلى أن هذه الطريقة كانت مجدية للتحقيق في بنية الكربوهيدرات.
كشف التحليل النوعي الأولي ل AMS باستخدام LC-Q-TOF-MS عن وجود العديد من المركبات غير المعروفة. تم اختيار أحد هذه ، وهو أيون عند m / z 617 ، لتحليل MSn في الوضع السلبي. أنتج المسح الأيوني المنتج (CID-MS / MS) ل [M-H] - عند m / z 617 في AMS أيون شظية ثان عند m / z 571. أنتج تحليل MS3 لأيون الشظية هذا أيون شظية ثالث عند m / z 525 ، وأنتج تحليل MS4 أيونات شظايا رابعة عند m / z 345 و 273 (الشكل 3A-D). قدم MS3 من m / z 571 أيون شظية عند m / z 525 عن طريق فقدان جزء CH2OH كميثانول (−32 Da) وجزء OH (-18 Da) كماء. تم استخدام نتائج MS4 هذه للتحديد اليدوي للبنية "الأساسية" للمركب ، وتم تحديد هيكلها الأصلي من خلال مقارنة قيم m / z للأيون وأيونات الشظايا. يوضح الشكل 3E التركيب الجزيئي للمركب عند m / z 617 ومسارات انقسامه في MSn. تم تحليل مركب آخر غير معروف عند m / z 365 في الوضع الإيجابي باستخدام MSn. أنتج المسح الأيوني الناتج (CID-MS / MS) لأيون [M + H] + عند m / z 365 في AMS أيونات شظايا ثانية عند m / z 299 و m / z 329 و m / z 347. أنتج تحليل MS3 لهذه الأيونات الشظوية أيون شظية ثالث عند m / z 231 (الشكل 4A-C). يوضح الشكل 4E التركيب الجزيئي وآلية الانقسام للمركب عند m / z 365.
الشكل 1: تحديد التراكيب المركبة غير المعروفة في الطب التبتي باستخدام IT-MS وتحليل قياس الطيف الكتلي متعدد المراحل. أ: الطور المتحرك للكروماتوغرافيا السائلة. ب: مضخة الكروماتوغرافيا السائلة. ج: غرفة العينة. (د) مصدر الأيونات ل MS. (ه) الهيكل الداخلي لوحدة مصيدة الأيونات في MS. (F) طيف MS4. (ز) معلومات التركيب الجزيئي من نتائج MS4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجزئة متعددة المراحل للسيلوبيوز عبر IT-MS في وضع الأيونات الموجبة. أ: الطيف الكتلي الأصلي للسيلوبيوز. (ب) الأيونات المتشظية في طيف MS/MS. ج: الأيونات المتشظية في طيف MS3. د: الأيونات المتشظية في طيف MS4. ه: آلية الانقسام والتركيب الجزيئي للسيلوبيوز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجزئة متعددة المراحل وتحليل هيكلي لأيون مركب AMS غير معروف عند m / z 617 عبر IT-MS في وضع الأيونات السالبة . (أ) الطيف الكتلي الجزئي ل AMS. (ب) الأيونات المتشظية في طيف MS/MS. ج: الأيونات المتشظية في طيف MS3 . د: الأيونات المتشظية في طيف MS4 . ه: آلية الانقسام والتركيب الجزيئي لأيون مركب AMS عند m/z 617. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحليل الهيكلي للتجزئة متعدد المراحل لأيون مركب AMS غير المعروف عند m / z 365 عبر IT-MS في وضع الأيونات الموجبة . (أ) الطيف الكتلي الجزئي ل AMS. (ب) الأيونات المتشظية في طيف MS/MS. ج: الأيونات المتشظية في طيف MS3 . د: آلية الانقسام والتركيب الجزيئي لأيون مركب AMS عند m/z 365. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم IT-MS وتقنية MSn الخاصة بها نهجا جديدا لتحديد بنية مركبات TCM النزرة. على عكس Q-TOF-MS ، التي لم تستطع تحديد أيونات الشظايا بعمق ، يتفوق IT-MS مع تقنية MSn نظرا لقدرته على عزل الأيونات وتجميعها. توضح هذه المقالة طريقة لتحديد المركبات النزرة في الطب التبتي باستخدام تقنية IT-MS و MSn . تستخدم الطريقة قيمة n في MSn لتحديد مقدار معلومات أيون الشظايا المقدمة. تتضمن الخطوات الحاسمة في هذه الطريقة اختيار نطاق المسح المناسب وضبط قيمة CE ، مما يؤدي إلى تحديد الأجزاء القيمة.
بشكل عام ، من الأفضل إجراء تحليل MSn للسكريات في وضع الأيونات الموجبة16 ، بينما يتم تحليل الأحماض الفينولية والقلويات بشكل أفضل في وضع الأيونات السالبة. يمكن تحسين استجابة المركب في مصدر ESI عن طريق ضبط الطور المتحرك بإضافات مثل حمض الفورميك وحمض الأسيتيك وخلات الأمونيوم17. يمكن اعتبار مصدر التأين الكيميائي للضغط الجوي للمركبات ذات القطبية الضعيفة. يمكن أن يؤدي اختيار نطاق مسح مناسب إلى زيادة شدة أيونات الشظايا ، وهو أمر مفيد للمرحلة التالية من MS n بسبب اضمحلال الطاقة الحتمي في كل MSn. يجب أن يكون m / z لأيون الشظية موجودا في المنطقة الوسطى من نطاق المسح للحصول على أفضل كثافة مقابلة. إذا كان للأيون شحنات مزدوجة أو متعددة ، فيمكن الحصول على أيونات الشظايا ذات قيم m / z الأعلى عن طريق تقليل رقم الشحنة أثناء التجزئة. في هذه الحالة ، يجب ضبط نهاية m / z لنطاق المسح لتكون أكبر. وضع CID مناسب لمعظم المركبات في تحليل MSn 18. إذا كانت شدة أيون الشظية غير كافية ، فيمكن زيادة قيمة CE بنسبة 5٪ في المرة الواحدة. عندما يكون هناك أيونات شظايا متعددة ومعقدة في MSn ، هناك حاجة إلى قيمة CE أقل للتحكم في تفكك الأيون. يوفر وضع التفكك الناجم عن الاصطدام النبضي Q ، وهو مناسب للجزيئات الصغيرة ، معلومات أكثر تفصيلا حول أيونات الشظايا منخفضة الوزن الجزيئي من وضع CID19. نموذج تفكك نقل الإلكترون (ETD) هو المهيمن في كسر الببتيد وتحديد البروتين ولكن نادرا ما يستخدم لتحديد مكونات TCM20. يمكن استخدام وضع ETD للتحقيق في المركبات غير المعروفة التي تحتوي على روابط ثاني كبريتيد21.
على الرغم من أن طريقة MSn لها العديد من المزايا لتحديد الهوية الهيكلية مقارنة بتقنيات MS الأخرى ، إلا أنه لا تزال هناك بعض القيود. أولا ، لا يعد أي من أوضاع التصادم مناسبا لجميع مركبات TCM. يمكن أن يؤدي الاختيار المعقول لوضع الاصطدام والضبط اليدوي لطاقة الاصطدام إلى تحسين أيونات الشظايا. بالإضافة إلى ذلك ، مع طريقة MSn ، من الصعب التمييز بين موضع المجموعات الوظيفية في الجزيئات الكبيرة ذات الأيزومرات المعقدة. يعد تحديد مواقع المجموعات الوظيفية مهمة صعبة تتطلب باحثين ذوي خبرة. يعد التحليل اللاحق اليدوي ووقتمعالجة بيانات MS n الطويل أيضا حواجز كبيرة تثني الباحثين عن استخدام هذه التكنولوجيا. تحظى Q-TOF-MS بشعبية بين الباحثين نظرا لدقة القياس العالية والدقة وسهولة الاستخدام مع قواعد البيانات. ومع ذلك ، يعد IT-MS حلا جيدا للأيونات غير المحددة والأيونات النزرة نظرا لقدرته على عزل الأيونات وتجميعها وإجراء مراحل متعددة من التحليل. يمكن أن يوفر تكامل Q-TOF و IT-MS حلا مثاليا للتحليل النوعي الكامل لعينات الطب الصيني التقليدي. تستخدم تقنية MSn على نطاق واسع في مجالات مثل الغذاء والعلوم البيئية والطب ، ومن المتوقع أن تزداد شعبيتها واستخدامها في مختلف المجالات مع تحسين أجهزة IT-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج Xinglin Talent التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم 030058191) ، ومؤسسة علوم الطبيعة في سيتشوان (2022NSFSC1470) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
- Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
- Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
- Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
- Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
- Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
- Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
- Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
- Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
- Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
- Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
- Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
- Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X.
- Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
- Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
- Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
- Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
- Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
- Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
- Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
- Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).
