Summary
Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll und Design, das angewendet werden könnte, um Spuren und Nebenbestandteile in den komplexen Naturstoffformulierungen (Matrixen) in der tibetischen Medizin zu identifizieren.
Abstract
Tibetische Arzneimittel sind komplex und enthalten zahlreiche unbekannte Verbindungen, so dass eine eingehende Erforschung ihrer molekularen Strukturen von entscheidender Bedeutung ist. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wird häufig zur Extraktion tibetischer Medizin verwendet. Viele unvorhersehbare unbekannte Verbindungen bleiben jedoch nach der Verwendung der Spectrum-Datenbank zurück. In der vorliegenden Arbeit wurde eine universelle Methode zur Identifizierung von Komponenten in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie (IT-MS) entwickelt. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbereitung, die MS-Einstellung, den LC-Prerun, die Methodenetablierung, die MS-Erfassung, den mehrstufigen MS-Betrieb und die manuelle Datenanalyse. Zwei repräsentative Verbindungen in den Samen der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot wurden mittels mehrstufiger Fragmentierung identifiziert, wobei typische Substanzstrukturen detailliert analysiert wurden. Darüber hinaus werden Aspekte wie die Auswahl des Ionenmodus, die mobile Phaseneinstellung, die Optimierung des Scanbereichs, die Kontrolle der Kollisionsenergie, die Umschaltung des Kollisionsmodus, die Fragmentierungsfaktoren und die Grenzen der Methode erörtert. Die entwickelte standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann auf unbekannte Verbindungen in der tibetischen Medizin angewendet werden.
Introduction
Die qualitative Analyse von Spurenelementen in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist zu einem entscheidenden Thema in der Forschung geworden. Aufgrund der hohen Anzahl von Verbindungen in der TCM ist es schwierig, sie für die Analyse von Kernspinresonanzspektrometern (NMR) oder Röntgendiffraktometern (XRD) zu isolieren, wodurch massenspektrometrische (MS) basierte Methoden, die nur geringe Probenvolumina erfordern, immer beliebter werden. Darüber hinaus wurde die Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit MS in den letzten Jahren in der TCM-Forschung zur verbesserten Trennung komplexer Proben und zur qualitativen Analyse chemischer Verbindungen eingesetzt1. Eine gängige Methode ist die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die in der qualitativen Forschung zur tibetischen Medizin weit verbreitet ist2. Bei dieser Methode werden komplexe Komponenten in einer LC-Säule angereichert und separiert, und das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) der Addukt-Ionen wird mit einem MS-Detektor beobachtet. Die Suche in Tandem-MS-DATENBANKEN (MS/MS oder MS2) ist derzeit der schnellste Ansatz für zuverlässige Verbindungsannotationen in der Analyse kleiner Moleküle unter Verwendung von Quadrupol-Flugzeit-MS (Q-TOF) MS und Orbitrap MS3. Die schlechte Qualität der Datenbanken und das Vorhandensein verschiedener Isomere erschweren jedoch die Identifizierung unbekannter Verbindungen. Darüber hinaus sind die von der MS/MS-Datenbank bereitgestellten Informationen begrenzt 4,5,6,7. Es ist wichtig, die chemischen Verbindungen in jeder TCM unter Verwendung eines allgemeinen Protokolls zu untersuchen, das auf andere TCM angewendet werden kann.
IT-MS fängt eine breite Palette von Ionen ein, indem unterschiedliche Hochfrequenzspannungen (HF) an die Ringelektroden8 angelegt werden. IT-MS kann mehrstufige MS-Scans in verschiedenen zeitlichen Reihenfolgen in Zeitreihen durchführen und eine mehrstufige MS (MS n)-Fragmentierung der Inhaltsstoffe ermöglichen, wobein die Anzahl der Produktionenstufen9 ist. Die lineare IT-MS gilt als die beste für die Strukturidentifikation, da sie für sequentielleMS-n-Experimente verwendet werden kann10. Gezielte Ionen können isoliert und in linearer IT-MS1 akkumuliert werden. Das MS n (n ≥ 3) in IT-MS liefert mehr Fragmentinformationen als MS/MS in Q-TOF-MS. Da IT-MS das Zielion und seine Fragmentionen nicht binden kann, ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen, einschließlich Isomeren1. DieMSN-Technologie wird in großem Umfang zur Strukturanalyse unbekannter Proteine, Peptide und Polysaccharide eingesetzt11,12. Die Häufigkeit von Fragmentionen in MSn liefert mehr molekulare Fragmentinformationen über Zielverbindungen in komplexen Proben als MS/MS in Q-TOF-MS. Daher ist die Anwendung derMSN-Technologie auf die Strukturidentifikation in der TCM unerlässlich.
Die tibetische Medizin ist ein bedeutender Bestandteil der TCM13, und diese Arzneimittel werden hauptsächlich aus Tieren, Pflanzen und Mineralien gewonnen, die im Plateaugebiet14 vorkommen. Die tibetische Medizin Abelmoschus manihot Samen (AMS) ist der Samen von Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS ist ein traditionelles pflanzliches Arzneimittel, das zur Behandlung von Erkrankungen wie Neurodermitis, Rheuma und Lepra eingesetzt wird. Es enthält Chalkon, das antibakterielle, antimykotische, krebshemmende, antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen besitzt15. In der vorliegenden Arbeit wurden dieMS-n-Verfahren verbessert und eine detaillierte Methode zur Identifizierung von Substanzstrukturen in der tibetischen Medizin AMS mittels IT-MS und MSn entwickelt. Bestimmte MS-Parameter, einschließlich des Ionenmodus, der Scanreichweite und des Kollisionsmodus, wurden optimiert, um Probleme bei der Identifizierung von Spurenverbindungen zu überwinden. Ziel dieser Studie ist es, die standardisierte Strukturidentifikation von Spurenstoffen in der TCM zu fördern.
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Protocol
1. Probenvorbereitung
- Wiegen Sie 1 g der AMS-Probe genau ab und geben Sie sie in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml 80%igem Methanol. Das Gemisch wird für 30 Minuten bei 25 °C in ein Ultraschallgerät überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 5 Minuten.
Anmerkungen: Die Frequenz des Ultraschall-Bad-Ultraschallgeräts beträgt 40 KHz. - Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen mikroporösen Membranfilter (0,22 μm, nur organisch) vor. Filtern Sie den Überstand in eine 2-ml-Probenflasche.
2. MS-Einstellung
- Schalten Sie den Schalter der Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie das Hauptventil des Argonzylinders und das Partialdruckventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 MPa ein. Öffnen Sie das Stickstoffventil.
Anmerkungen: Warten Sie mindestens 8 Stunden, um ein ausreichendes Vakuum für die Versuchsbedingungen zu gewährleisten. Überprüfen Sie vor der Analyse, ob der Gasdruck von Argon und Stickstoff hoch genug ist. - Starten Sie die MS-Steuerungssoftware. Klicken Sie im Software-Panel auf Beheizte SEI-Quelle und geben Sie die MS-Parameter ein, einschließlich der Heizertemperatur (350 °C), der Mantelgasdurchflussrate (35 Arb), der Hilfsgasdurchflussrate (15 Arb), der Sprühspannung (3,8 KV für den positiven Modus, -2,5 KV für den negativen Modus) und der Kapillartemperatur (275 °C). Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um die Ionenquelle zu aktivieren.
3. LC-Vorlauf, Methodenetablierung und MS-Erwerb
- Bereiten Sie die mobile Phase A und die mobile Phase B unter Verwendung einer wässrigen 0,1%igen Ameisensäurelösung bzw. reinem Acetonitril vor. Entgasen Sie sie mindestens 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät. Verbinden Sie die Lösungen mit den Flüssigkeitskanälen A bzw. B (Abbildung 1A). Bereiten Sie eine Methanol-Wasser-Lösung (1:9 v/v) vor und füllen Sie sie dann von Hand in die Reinigungsflüssigkeitsflaschen der Pumpe und des Injektors.
Anmerkungen: Die Frequenz des Ultraschall-Bad-Ultraschallgeräts beträgt 40 KHz. - Starten Sie die LC-MS-Steuerungssoftware.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Direct Control , um das LC-Bedienfeld zu öffnen. Öffnen Sie das Spülventil gegen den Uhrzeigersinn am Pumpenmodul (Abbildung 1B).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Weitere Optionen , um die Pumpeneinstellung zu öffnen, und stellen Sie die Spülparameter für 3 Minuten auf 5 mlmin−1 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen , um die Entfernung der Blase zu starten. Schließen Sie anschließend das Spülventil.
- Klicken Sie auf die Schaltflächen Spritze anzünden, Pufferschlaufe waschen und Nadel extern waschen, um die Spritze für drei Zyklen, die Schlaufe für einen Zyklus bzw. die Nadel für einen Zyklus zu spülen. Stellen Sie die Probenflasche in den Probenehmer (Abbildung 1C).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Instrument Setup , um das Fenster zur Methodenbearbeitung zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu , um eine neue LC-MS-Gerätemethode zu erstellen.
- Legen Sie eine Gesamtlaufzeit für die LC-Methode fest. Geben Sie als Nächstes Werte ein, um die Druckgrenze, die Gesamtdurchflussrate, den Durchflussgradienten, die Probentemperatur, die Säulentemperatur und das Bereitschaftstemperaturdelta im Methodenbearbeitungsfenster festzulegen.
HINWEIS: Die standardmäßige Gesamtflussrate der mobilen Phase ist konstant bei 0,3 ml/min mit 50 % A und 50 % B und ohne Säulentemperatur in Abwesenheit einer chromatographischen Säule. Die Standardwerte für die Probentemperatur und das Bereitschaftstemperaturdelta sind 15 °C bzw. 0,1 °C. Andere Einstellungen hängen von der Art der verwendeten Flüssigkeitschromatographiesäule ab. - Wählen Sie den Experimenttyp Allgemeines MS oder MSn für die MS-Methode aus. Geben Sie Werte ein, um die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Umlenkwerte und die Dauer des Umlenkwerts zu konfigurieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren.
HINWEIS: Die Standardeinstellungen ohne Chromatographiesäule lauten wie folgt: Erfassungszeit, 2 min; Polarität, positiv oder negativ; Massenbereich, 100 bis 1.200; Wert umleiten Nummer, 2; und Umlenkwertdauer, 1.99 min.
4. Betrieb der mehrstufigen Massenspektrometrie
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz einrichten , um die Sequenztabelle zu öffnen.
- Geben Sie in der Tabelle die folgenden Informationen ein: Probentyp, Dateiname, Pfad, Proben-ID, Gerätemethode, Position und Injektionsvolumen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenztabelle aufzuzeichnen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analyse starten, um die Einstellungen zu implementieren und die MS-Erfassung zu starten .
HINWEIS: Der Standard-Sample-Typ ist als unbekannt ausgewählt. Die Instrumentenmethode ist die Methode, die in Schritt 3.6 gespeichert wurde. Die Probenflasche wird an ihrem einzigartigen Platz im Probenraum platziert. RA1 ist z. B. die erste Position in der ersten Zeile des roten Bereichs im Probenraum. Das Standard-Injektionsvolumen beträgt in der Regel 2 μl, was von der Konzentration der Probe abhängt.
- Doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS-Daten in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Wählen Sie im Basis-Peak-Chromatogramm (BPI) den Bereich mit der maximalen Fläche unter der Kurve (AUC) aus, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen. Die entsprechenden MS-Spektren werden im selben Fenster angezeigt.
- Wählen Sie ein Zielion für die nächste MS/MS-Analyse aus.
- Öffnen Sie das Fenster zum Bearbeiten der Methode erneut. Legen Sie in der Tabelle MS n Setting (MS-n-Einstellung) das m/z des Zielions auf eine Dezimalstelle in der Spalte "Übergeordnete Masse" fest.
- Wählen Sie Kollisionsmodus und geben Sie den Wert für die Kollisionsenergie (CE) ein. Stellen Sie den MS/MS-Scanbereich ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die MS-Methode aufzuzeichnen, und geben Sie einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die MS/MS-Erfassung zu starten.
HINWEIS: Der MS/MS-Scanbereich betrug 40 % bis 130 % des Ziel-Elternions. Der Standard-CE-Wert im CID-Modus (Collision Induced Dissociation) beträgt 35 %.
- Doppelklicken Sie im Explorer auf die RAW-Datei, um die MS/MS-RAW-Datei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden.
- Identifizieren Sie das stärkste Fragmention im MS/MS-Spektrum und geben Sie seinen m/z-Wert in die MS-n-Methodenliste ein. Stellen Sie in der MS n-Einstellungstabelle die MS3-Parameter ein, einschließlich Kollisionsmodus, CE-Wert und Scanbereich.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die MS-Methode aufzuzeichnen, und geben Sie einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die MS3-Erfassung zu starten.
- Doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS3-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Wiederholen Sie Schritt 4.4, um das MS4-Spektrum zu erhalten.
- Beenden Sie das MSn-Experiment , wenn keine stabilen Fragmentionen im Spektrum beobachtet werden.
5. Manuelle MSn-Datenanalyse
- Doppelklicken Sie auf die Rohdateien, um alle Massenspektren von MS bis MSn zu öffnen. Berechnen Sie manuell die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion und den entsprechenden Fragmentionen.
HINWEIS: Zum Beispiel betrug der m/z-Differenzwert zwischen dem Ion (m/z 617,25) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 571,28) 45,97 in MS/MS, der m/z-Differenzwert zwischen dem Ion (m/z 571,28) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 525,38) betrug 45,90 in MS3 und die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion (m/z 525,38) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 344,93 und 273,16) betrug 180,45 und 252.22 in MS4. - Zeichnen Sie manuell die "Kern"-Struktur gemäß den Ergebnissen von MS4 (der letzten Ebene von MSn). Leiten Sie die ursprüngliche Struktur manuell ab, indem Sie funktionelle Gruppen oder Molekülsegmente basierend auf dem m/z-Differenzwert verwenden. Zeichnen Sie die molekularen Spaltpfade manuell entsprechend jeder Molekülstruktur in MSn. Beispiele für die manuelle molekulare Ableitung sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" aufgeführt.
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Representative Results
Cellobiose wurde als Modell verwendet, um die Machbarkeit von MSn im positiven Ionenmodus zu überprüfen. Wie in Abbildung 2A gezeigt, erzeugte die ESI-MS (positiver Ionenmodus) der Cellobiose [C 12 H22O11]+ das protonierte Molekül [M+H]+ bei m/z 365. Der Produktionenscan (CID-MS/MS) von [M+H]+ bei m/z 365 ergab das zweite Fragmention bei m/z 305 (Abbildung 2B), das mit MS3 und MS4 Analysen weiter analysiert wurde (Abbildung 2C,D). DieMS-3-Analyse ergab das dritte Fragment-Ion bei m/z 254 und dieMS-4-Analyse das vierte Fragment-Ion bei m/z 185. Die MS/MS-Analyse (Abbildung 2E) zeigte, dass das verlorene Fragmention bei m/z 60 eine Sequenz der Ionenfragmentierung bei m/z 365 anzeigte, nämlich Ringöffnungshydrolyse (blau markiert), C-C-Bindungsspaltung (rot markiert) und Dehydratisierung (grün markiert). In ähnlicher Weise zeigte die MS3-Analyse, dass das verlorene Fragmention bei m/z 60 die C-C-Bindungsspaltung (rot markiert) eines Ions bei m/z 305 anzeigte. Die MS4-Analyse zeigte, dass das verlorene Fragmention bei m/z 60 Hydrolyse (blau markiert) und Dehydratisierung (grün markiert) implizierte, was zur Spaltung des Ions mit m/z 245 in ein Ion mit m/z 185 führte. Die Stufenfraktur in derMSN-Analyse deutete darauf hin, dass diese Methode für die Untersuchung der Struktur von Kohlenhydraten geeignet ist.
Die vorläufige qualitative Analyse von AMS mittels LC-Q-TOF-MS ergab das Vorhandensein zahlreicher unbekannter Verbindungen. Eines davon, ein Ion bei m/z 617, wurde für die MSn-Analyse im negativen Modus ausgewählt. Der Produktionenscan (CID-MS/MS) des [M-H]− bei m/z 617 in AMS ergab ein zweites Fragmention bei m/z 571. DieMS-3-Analyse dieses Fragment-Ions ergab ein drittes Fragment-Ion bei m/z 525 und dieMS-4-Analyse lieferte vierte Fragment-Ionen bei m/z 345 und 273 (Abbildung 3A-D). Das MS3 von m/z 571 lieferte ein Fragmention bei m/z 525 durch den Verlust desCH2OH-Teilsals Methanol (−32 Da) und des OH-Teils (−18 Da) als Wasser. Diese MS4-Ergebnisse wurden für die manuelle Identifizierung der "Kern"-Struktur der Verbindung verwendet, und ihre ursprüngliche Struktur wurde durch Vergleich der m/z-Werte des Ions und seiner Fragmentionen bestimmt. Die molekulare Struktur der Verbindung bei m/z 617 und ihre Spaltwege in MSn sind in Abbildung 3E dargestellt. Eine weitere unbekannte Verbindung bei m/z 365 wurde im positiven Modus mit MSn analysiert. Der Produktionenscan (CID-MS/MS) des [M+H]+-Ions bei m/z 365 in AMS erzeugte zweite Fragmentionen bei m/z 299, m/z 329 und m/z 347. Die MS3-Analyse dieser Fragmentionen ergab ein drittes Fragmention bei m/z 231 (Abbildung 4A-C). Die molekulare Struktur und der Spaltmechanismus der Verbindung bei m/z 365 sind in Abbildung 4E dargestellt.
Abbildung 1: Identifizierung unbekannter Substanzstrukturen in der tibetischen Medizin mittels IT-MS und mehrstufiger Massenspektrometrie . (A) Die mobile Phase für die Flüssigkeitschromatographie. (B) Die Flüssigkeitschromatographiepumpe. (C) Der Probenraum. (D) Die Ionenquelle für MS. (E) Die interne Struktur des Ionenfallenmoduls in MS. (F) Das MS4-Spektrum . (G) Die molekularen Strukturinformationen aus den MS4-Ergebnissen . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mehrstufige Fragmentierung der Cellobiose mittels IT-MS im positiven Ionenmodus . (A) Ursprüngliches Massenspektrum der Cellobiose. (B) Fragmentionen im MS/MS-Spektrum. (C) Fragmentionen imMS3-Spektrum . (D) Fragmentionen imMS4-Spektrum . (E) Der Spaltmechanismus und die molekulare Struktur der Cellobiose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mehrstufige Fragmentierung und Strukturanalyse des unbekannten AMS-Verbindungsions bei m/z 617 mittels IT-MS im negativen Ionenmodus . (A) Partielles Massenspektrum von AMS. (B) Fragmentionen im MS/MS-Spektrum. (C) Fragmentionen imMS3-Spektrum . (D) Fragmentionen imMS4-Spektrum . (E) Der Spaltmechanismus und die molekulare Struktur des AMS-Verbindungsions bei m/z 617. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Mehrstufige Fragmentierungsstrukturanalyse des unbekannten AMS-Verbindungsions bei m/z 365 mittels IT-MS im positiven Ionenmodus . (A) Partielles Massenspektrum von AMS. (B) Fragmentionen im MS/MS-Spektrum. (C) Fragmentionen imMS3-Spektrum . (D) Der Spaltmechanismus und die molekulare Struktur des AMS-Verbindungsions bei m/z 365. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
IT-MS und seineMS-n-Technologie bieten einen neuen Ansatz zur Identifizierung der Struktur von TCM-Spurenverbindungen. Im Gegensatz zu Q-TOF-MS, das die Fragmentionen nicht tief identifizieren konnte, zeichnet sich die IT-MS mit MSn-Technologie durch ihre Fähigkeit aus, Ionen zu isolieren und zu akkumulieren. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung von Spurenstoffen in der tibetischen Medizin mit Hilfe der IT-MS- undMS-n-Technik . Die Methode verwendet den n-Wert in MSn , um die Menge der bereitgestellten Fragmentioneninformationen zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten bei dieser Methode gehören die Auswahl des geeigneten Scanbereichs und die Anpassung des CE-Wertes, die zur Identifizierung wertvoller Fragmente führen.
Im Allgemeinen wird dieMSN-Analyse von Sacchariden am besten im positiven Ionenmodus16 durchgeführt, während Phenolsäuren und Alkaloide am besten im negativen Ionenmodus analysiert werden. Das Ansprechverhalten der Verbindung in der ESI-Quelle kann verbessert werden, indem die mobile Phase mit Additiven wie Ameisensäure, Essigsäure und Ammoniumacetateingestellt wird 17. Eine chemische Ionisationsquelle mit Atmosphärendruck kann für Verbindungen mit schwacher Polarität in Betracht gezogen werden. Durch die Wahl eines geeigneten Scanbereichs kann die Intensität der Fragmentionen erhöht werden, was für die nächste Stufe von MS n aufgrund des unvermeidlichen Energiezerfalls in jedem MSn von Vorteil ist. Das m/z des Fragmentions sollte sich im zentralen Bereich des Scanbereichs befinden, um die beste entsprechende Intensität zu erhalten. Wenn ein Ion doppelt oder mehrfach geladen ist, können Fragmentionen mit höheren m/z-Werten erhalten werden, indem die Ladungszahl während der Fragmentierung verringert wird. In diesem Fall sollte das Ende m/z des Abtastbereichs größer eingestellt werden. Der CID-Modus eignet sich für die meisten Verbindungen in derMSN-Analyse 18. Wenn die Intensität des Fragmentions nicht ausreicht, kann der CE-Wert jeweils um 5 % erhöht werden. Wenn es mehrere, komplexe Fragmentionen in MSn gibt, ist ein niedrigerer CE-Wert erforderlich, um die Ionendissoziation zu kontrollieren. Der gepulste Q-Kollisions-induzierte Dissoziationsmodus, der für kleine Moleküle geeignet ist, liefert detailliertere Informationen über niedermolekulare Fragmentionen als der CID-Modus19. Das Modell der Elektronentransferdissoziation (ETD) ist bei der Identifizierung von Peptidbrüchen und Proteinen dominant, wird aber selten zur Identifizierung der TCM-Komponenten20 verwendet. Der ETD-Modus kann verwendet werden, um unbekannte Verbindungen, die Disulfidbindungen21 enthalten, zu untersuchen.
Obwohl dieMS-n-Methode im Vergleich zu anderen MS-Techniken viele Vorteile für die Strukturidentifikation hat, gibt es immer noch einige Einschränkungen. Erstens ist keiner der Kollisionsmodi für alle TCM-Mischungen geeignet. Eine vernünftige Wahl des Kollisionsmodus und eine manuelle Anpassung der Kollisionsenergie können die Fragmentionen verbessern. Darüber hinaus ist es mit derMSN-Methode schwierig, die Position funktioneller Gruppen in großen Molekülen mit komplexen Isomeren zu unterscheiden. Die Identifizierung der funktionellen Gruppenstellen ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die erfahrene Forscher erfordert. Manuelle Nachanalyse und langeMSN-Datenverarbeitungszeiten sind ebenfalls erhebliche Hindernisse, die Forscher davon abhalten, diese Technologie zu nutzen. Q-TOF-MS ist bei Forschern aufgrund seiner hohen Messgenauigkeit, Auflösung und Benutzerfreundlichkeit mit Datenbanken beliebt. IT-MS ist jedoch eine gute Lösung für nicht identifizierte Ionen und Spurenionen, da es in der Lage ist, Ionen zu isolieren und zu akkumulieren und mehrere Analysestufen durchzuführen. Die Integration von Q-TOF und IT-MS könnte eine optimale Lösung für die vollständige qualitative Analyse von TCM-Proben darstellen. DieMS-n-Technologie ist in Bereichen wie Lebensmittel, Umweltwissenschaften und Medizin weit verbreitet, und es wird erwartet, dass ihre Popularität und ihr Einsatz in verschiedenen Bereichen mit der Verbesserung der IT-MS-Instrumentierung zunehmen werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Xinglin Talent Program der Chengdu University of TCM (Nr. 030058191), die Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) und die National Natural Science Foundation of China (82204765) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
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