Methodenartikel

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

DOI:

10.3791/65086

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18. August 2023

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1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3CelVivo ApS

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Zusammenfassung

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Wir stellen ein Protokoll vor, das die Eigenschaften und Vorteile der Verwendung eines eigenständigen Klinostistinkubators für die Züchtung, Behandlung und Überwachung von 3D-Zellkulturen beschreibt. Der Klinostat ahmt eine Umgebung nach, in der sich Zellen als hochreproduzierbare Sphäroide mit geringen Scherkräften und aktiver Nährstoffdiffusion zusammensetzen können. Wir zeigen, dass sowohl Krebs- als auch Nicht-Krebs-Hepatozyten (HepG2/C3A- und THLE-3-Zelllinien) 3 Wochen Wachstum benötigen, bevor sie Funktionalitäten erreichen, die mit denen von Leberzellen vergleichbar sind. Dieses Protokoll unterstreicht die Bequemlichkeit der Verwendung von Inkubatoren für 3D-Zellen mit Kameras, die das Zellwachstum überwachen, da Schnappschüsse gemacht werden können, um Sphäroide nach der Behandlung zu zählen und zu messen. Wir beschreiben den Vergleich von THLE-3- und HepG2/C3A-Zelllinien und zeigen, wie nicht-krebsartige Zelllinien gezüchtet und immortalisierte Krebszellen gezüchtet werden können. Wir demonstrieren und veranschaulichen, wie Proteomik-Experimente aus wenigen Sphäroiden durchgeführt werden können, die ohne Störung der Zellsignalisierung gesammelt werden können, d.h. keine Trypsinisierung erforderlich ist. Wir zeigen, dass die Proteomik-Analyse verwendet werden kann, um den typischen Leberphänotyp des Atmungskettenstoffwechsels und die Produktion von Proteinen zu überwachen, die an der Metallentgiftung beteiligt sind, und beschreiben ein halbautomatisches System zur Zählung und Messung der Fläche des Sphäroides. Insgesamt stellt das Protokoll eine Toolbox dar, die eine phänotypische Charakterisierung mittels Bildaufnahme und eine Proteomik-Pipeline zum Experimentieren mit 3D-Zellkulturmodellen umfasst.

Einleitung

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In-vitro-Zellkulturen haben sich als notwendig und von unschätzbarem Wert erwiesen, um grundlegendes Wissen in der Biologie zu erlangen. Ein Großteil des wissenschaftlichen Verständnisses in der Biologie und insbesondere in der Krebsforschung stammt aus dem 2D-Kultursystem, bei dem Zellen in einer Monoschicht wachsen. Obwohl die 2D-Kultur bisher das dominierende Zellkultursystem war, hat sie viele Nachteile, die möglicherweise weitere biologische Fortschritte ersticken können. Zum Beispiel fehlen 2D-Kulturen Zell-Zell-Interaktionen, die für die Zellsignalübertragung und -proliferation wichtig sind1. Bisher hat sich gezeigt, dass 3D-Kultursysteme die Differenzierung, das Ansprechen auf Medikamente, die Tumorinvasion und die Biologie besser modellierenkönnen 2,3,4,5. Die 3D-Modellierung von bösartigen Krebserkrankungen ist aufgrund der zunehmenden Alterung der Bevölkerung und der Krebssterblichkeit besonders wichtig. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen und hat häufig eine miserable Prognose6. Es ist bekannt, dass HCC eine niedrige Heilungsrate, ein schlechtes Ansprechen auf Arzneimittel und eine hohe Wiederholungsrate aufweist 6,7,8. Es wurden mehrere 3D-Modelle für normale Leber und HCC entwickelt, die die Physiologie von in vivo normalem und malignem Lebergewebe nachahmen 9,10.

Zu den aktuellen 3D-Systemen gehören Flüssigkeitsüberlagerungen, Bioreaktoren, Hydrogele, Gerüste und 3D-gedruckte Strukturen. Sphäroide, die in Bioreaktoren erzeugt werden, bieten insbesondere einzigartige Vorteile, da sie die Tumorverteilung der Nährstoffexposition, den Gasaustausch und die Zellproliferation/-ruhe nachahmen11. Bioreaktoren eignen sich aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, großen Skalierbarkeit, Nährstoffdiffusion und Zugänglichkeit besonders für Krebsmodelle11. Darüber hinaus können Bioreaktoren Experimente mit hohem Durchsatz, eine höhere Reproduzierbarkeit und weniger menschliche Fehler ermöglichen. Der in dieser Studie verwendete Bioreaktor ist einzigartig, da er ein System mit reduzierter Schwerkraft simuliert, das störende Scherkräfte, die in typischen Bioreaktoren angewendet werden, minimiert und eine bessere Reproduzierbarkeit ermöglicht12. Die omnidirektionale Schwerkraft und die Verringerung der Scherkräfte ermöglichen es den Zellen, sich auf physiologischere Weise zu entwickeln. HepG2/C3A-Zellen, die mit dieser Methode gezüchtet wurden, entwickeln kugelförmige Organellen, die in vivo ATP-, Adenylatkinase-, Harnstoff- und Cholesterinspiegel produzieren13,14. Darüber hinaus sind die medikamentösen Behandlungen in diesem 3D-System im Vergleich zu 2D-Kulturen fortschrittlicher und automatisierter. In 2D-Kulturen müssen medikamentöse Behandlungen oft einen kurzen Zeitverlauf haben, da sie trypsinisieren und die Zellgesundheit erhalten müssen. In unserem Fall können wir jedoch langfristige medikamentöse Behandlungen von Sphäroiden durchführen, ohne die Struktur und Physiologie der Zellen stören zu müssen. Daher ist ein Wechsel von 2D- zu 3D-Kulturen notwendig, um biologische Phänomene in vivo besser zu modellieren und die wissenschaftliche Entwicklung voranzutreiben.

In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide vorgestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2) und ein halbautomatisches System zur phänotypischen Charakterisierung von 3D-Strukturen gezeigt (Abbildung 3). Auf der Bildebene liefern wir Informationen zum Zählen und Messen der Fläche von Sphäroiden (Abbildung 3). Mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden zeigen wir, wie die Proteomik zur Beurteilung spezifischer biologischer Funktionen eingesetzt werden kann (Abbildung 4). Durch das Sammeln und Analysieren dieser Daten hoffen wir, das Verständnis der Biologie hinter 3D-Zellkultursystemen zu verbessern.

Protokoll

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1. Puffer und Reagenzien

  1. Zellwachstumsmedien für HepG2/C3A-Zellen: Bereiten Sie das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L Glukose) vor, das 10 % fötales Kälberserum (FBS), nicht-essentielle Aminosäuren (1 % v/v), L-Glutamin (1 % v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5 % v/v) enthält. Lagern Sie das Nährmedium bei 4 °C.
  2. Zellwachstumsmedien für THLE-3-Zellen: Bereiten Sie Bronchialepithelzellwachstumsmedium [BEGM] vor, das seine Nahrungsergänzungsmittel (Rinderhypophysenextrakt [BPE], Hydrocortison, humaner epidermaler Wachstumsfaktor [hEGF], Epinephrin, Transferrin, Insulin, Retinsäure, Trijodthyronin, Gentamicinsulfat-Amphotericin [GA]) sowie 10% FBS, 5 ng/ml hEGF und 70 ng/ml Phosphoetanolamin enthält.
  3. 500 mM DL-Dithiothreitol (DTT): Zur Herstellung von 10 ml werden 0,771 g DTT in 10 ml Wasser in HPLC-Qualität resuspendiert. 100 μl Aliquots bei -20 °C lagern.
  4. 200 mM Jodacetamid: Zur Herstellung von 1 ml 36 mg Jodacetamid in 1 ml 50 mM Ammoniumbicarbonat resuspendieren. Resuspendiertes Jodacetamid darf nicht aufbewahrt werden.
  5. 5% Natriumdodecylsulfat (SDS): Zur Herstellung von 50 ml werden 2,5 g SDS in 50 ml 50 mM Ammoniumbicarbonat resuspendiert. Bei 4 °C lagern.
  6. 12 % Phosphorsäure: Zur Herstellung von 100 ml werden 14,1 ml 85 % Phosphorsäure in 85,9 ml Wasser in HPLC-Qualität verdünnt. In einer Glasflasche bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.
  7. Bindungspuffer: Zur Herstellung von 1 l 900 ml konzentriertes Methanol zu 100 ml 10 mM Ammoniumbicarbonat oder TEAB hinzufügen.
  8. 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung: 1 ml konzentriertes TFA zu 999 ml Wasser in HPLC-Qualität geben. Bei 4 °C lagern.
  9. 60 % Acetonitril/0,1 % TFA-Lösung: 600 ml Acetonitril in HPLC-Qualität (60 % v/v) zu 399 ml Wasser in HPLC-Qualität geben. Als nächstes wird 1 ml konzentriertes TFA zu dieser Lösung gegeben und dann bei 4 °C gelagert.
  10. Mobile Phase A (MPA) - 0,1 % Ameisensäure: 1 ml konzentrierte Ameisensäure zu 999 ml Wasser in HPLC-Qualität geben und gut mischen.
  11. Mobile Phase B (MPB) - 80 % Acetonitril in HPLC-Qualität + 0,1 % Ameisensäure: 800 ml Acetonitril in HPLC-Qualität zu 199 ml Wasser in HPLC-Qualität geben. Als nächstes fügen Sie 1 ml konzentrierte Ameisensäure zu dieser Lösung hinzu und mischen Sie.

2. Herstellung von Sphäroiden

HINWEIS: Abbildung 1A zeigt die ersten Schritte zur Vorbereitung und Kultivierung von 3D-Sphäroiden aus Zelllinien.

  1. Gefrorene HepG2/C3A- und THLE-3-Zellen werden aufgetaut und als Monoschicht unter Verwendung von Standard-Wachstumsmedien in einem Gewebekulturkolben oder einer Gewebeschale gezüchtet, bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben.
    HINWEIS: Wenn Zellen Konfluenz erreichen, überprüfen Sie die allgemeine Zellmorphologie und die Wachstumsmuster mit einem Mikroskop. Es wird nicht empfohlen, Zellen mit hohen Durchgangszahlen zu verwenden.
  2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, verwenden Sie 5 ml für einenT75 cm 2-Kolben oder eine 10-cm-Schale).
  3. 5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA, verdünnt in HBSS (1:2-Verdünnung), zugeben und 5 min bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu beurteilen, und fügen Sie 3 ml FBS oder Wachstumsmedien (mit 10 % FBS) hinzu, um die Trypsinreaktion zu neutralisieren.
  4. Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Schleudern Sie bei 270 x g bei RT für 5 Minuten.
  5. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml des vollständigen Wachstumsmediums.
    HINWEIS: Wenn zu viele Zellen vorhanden sind, verdünnen Sie die Zellsuspension vor dem Zählen.
  6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension in vollständigen Wachstumsmedien, um 1 x 106 in einem maximalen Volumen von 1,5 ml zu erhalten.
  7. Äquilibrieren Sie eine runde 24-Well-Bodenplatte mit extrem niedrigem Aufsatz, die Mikrowellen enthält.
    1. Waschen Sie die Vertiefungen mit 0,5 ml Nährmedium.
    2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 3.000 x g für 5 Minuten (dadurch werden Luftblasen von der Oberfläche der Vertiefungen entfernt).
  8. Die in Schritt 1.4 hergestellte Zellsuspension wird in die Platte überführt und 3 min bei 120 x g zentrifugiert.
    HINWEIS: Das Volumen der Zellsuspension kann je nach Zellanzahl variieren, aber es ist wichtig, es auf 1,5 ml zu begrenzen.
  9. Die Platte wird 24 h lang bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert, um mit der Sphäroidbildung zu beginnen.

3. Sphäroide, die in Bioreaktoren kultiviert werden (Abbildung 2)

HINWEIS: Um die Struktur von Sphäroiden zu erhalten, verwenden Sie bei der Handhabung von 3D-Kugeln Spitzen mit großer Bohrung.

  1. Äquilibrieren Sie den Bioreaktor, indem Sie die Feuchtigkeitskammer 24 Stunden vor dem Transfer der Sphäroide mit 25 ml sterilem Wasser und die Zellkammer mit 9 ml Wachstumsmedien füllen (Abbildung 2A). Achten Sie darauf, eine 10-ml-Spritze zu verwenden, die an eine lange Nadel gekoppelt ist, wenn Sie Feuchtigkeits- und Zellkammern füllen.
  2. Inkubieren Sie den Bioreaktor rotierend (15 U/min) im 3D-Inkubator (Abbildung 2D,F) für 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2.
  3. Mit Spitzen mit einer breiten Bohrung von 1 ml vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Sphäroide von der Platte mit extrem niedrigem Aufsatz zu lösen, und die Sphäroide in eine Gewebekulturschale übertragen.
  4. Waschen Sie die Platte mit extrem niedrigem Aufsatz mit 0,5 ml vorgewärmtem Nährmedium, um übrig gebliebene Sphäroide aufzufangen, und übertragen Sie sie in dieselbe Schale aus Schritt 3.3.
  5. Beurteilen Sie die Größe, Kompaktheit und Rundheit der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop (4-fache Vergrößerung) und wählen Sie diejenigen aus, die ausreichend ausgebildet sind.
    HINWEIS: Zellen sind ausreichend geformt, wenn sie kompakt sind und bei der Handhabung nicht auseinanderfallen. Wichtig ist auch, dass die Sphäroide eine Einheit bilden und nicht verklumpen. Eine Sphäroidgröße zwischen 100-200 μm wird bevorzugt, wenn sie in den Bioreaktor überführt wird.
  6. Die Sphäroide werden in den äquilibrierten Bioreaktor überführt, der mit 5 ml frischem Nährmedium gefüllt ist. Füllen Sie den Bioreaktor nach dem Umfüllen der Sphäroide vollständig mit frischem Nährmedium und achten Sie darauf, dass beim Befüllen des Bioreaktors keine Blasen entstehen.
  7. Platzieren Sie den Bioreaktor im 3D-Inkubator und stellen Sie die Drehzahl mit der Steuereinheit ein (Abbildung 2C). Bei HepG2/C3A-Sphäroiden ist die Drehzahl auf 10-11 U/min einzustellen. für THLE-3-Sphäroide auf 11-12 U/min einstellen.
    HINWEIS: Die Rotationsgeschwindigkeit ist korrekt eingestellt, wenn die Sphäroide gleichmäßig in der Mitte des Bioreaktors verteilt sind und seine Wände nicht berühren. Abbildung 2E zeigt einen rotierenden Bioreaktor.
  8. Tauschen Sie die Wachstumsmedien alle 2-3 Tage aus, indem Sie 10 ml alte Medien entfernen und durch 10 ml frische Medien ersetzen. Achten Sie darauf, beim Medienwechsel keine Sphäroide zu entfernen (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Routine für den Medienaustausch zu haben (z. B. 48 h/48 h/72 h) und eine detaillierte Aufzeichnung zu führen.
  9. Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit jedes Mal an, wenn das Medium gewechselt wird. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit, wenn die Sphäroide größer und zahlreicher werden.
  10. Nach 15 Tagen in Kultur werden die Sphäroide in zwei neue Bioreaktoren aufgespalten.
    HINWEIS: Je nach Zelllinie und Wachstumsrate kann die Zeit variieren und sollte individuell optimiert werden.
  11. Nach 20 Tagen sind die Sphäroide abholbereit.

4. Bilderfassung und Zählung von Sphäroiden

HINWEIS: Die vereinfachte Pipeline für die Anzahl der Sphäroide ist in Abbildung 3A dargestellt. Für die Anzahl der Sphäroide und die Flächenbestimmung (Abschnitt 5) ist es entscheidend, die Kompaktheit der 3D-Strukturen zu bewerten. Dies trägt zu einem verbesserten Farbkontrast bei, der für die Genauigkeit der Methode erforderlich ist.

  1. Öffnen Sie die auf dem Tablet installierte 3D-App.
  2. Wählen Sie den Bioreaktor aus und machen Sie einen Schnappschuss.
    HINWEIS: Alternativ kann auch ein Foto gemacht werden. Die folgenden Parameter sollten berücksichtigt werden.
    1. Platzieren Sie einen schwarzen Hintergrund hinter dem Bioreaktor (schwarze Stütze ist in der Bioreaktorbox vorhanden).
    2. Stellen Sie sicher, dass keine Lichtreflexion auf der Zellkammer auftritt.
    3. Nehmen Sie das Foto so nah wie möglich am Bioreaktor auf.
  3. Öffnen Sie ein Bild in FIDSCHI (BildJ).
  4. Bereiten Sie das Bild für die Analyse vor:
    1. Wählen Sie das ovale Werkzeug aus. Zeichne einen Kreis um den Stecker.
    2. Klicken Sie auf der Tastatur auf "Löschen ", um alles innerhalb des Kreises schwarz zu machen. Zeichne einen Kreis um die Zellkammer. Stellen Sie sicher, dass sich alle Sphäroide innerhalb des Kreises befinden.
  5. Führen Sie ein Makro aus, um Sphäroide zu zählen:
    1. Klicken Sie auf Plugins > Makro > Datensatz. Kopieren Sie den Makrotext aus der Zusatzdatei 1 in den Rekorder.
    2. Klicken Sie auf Erstellen, und ein neues Fenster wird geöffnet. Drücken Sie auf Ausführen , um das geöffnete Bild zu analysieren.
    3. Es öffnet sich ein neues Fenster mit den Ergebnissen (Anzahl, Gesamtfläche, durchschnittliche Größe und prozentuale Fläche).
  6. Schließen Sie das Bild und wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 für jedes Bild, für das die Sphäroidzählung benötigt wird. Um die Verarbeitung zu vereinfachen und zu beschleunigen, speichern Sie das Makro und führen Sie es aus, indem Sie auf Plugins > Makro > Ausführen klicken und das gespeicherte Makro auswählen.

5. Planimetrische Bestimmung der Sphäroidfläche

HINWEIS: Die vereinfachte Rohrleitung zur Bestimmung der Sphäroidfläche ist in Abbildung 3B dargestellt.

  1. Nehmen Sie Bilder auf, wie in Schritt 3.5 beschrieben.
  2. Bevor Sie beginnen, legen Sie eine globale Skala fest, um die Fläche der Sphäroide zu messen.
    1. Öffnen Sie in Fidschi ein Bild mit einer Maßstabsleiste mit der gewünschten Vergrößerung. Wählen Sie das Linienwerkzeug aus. Zeichnen Sie über die Maßstabsleiste (die Linie muss so lang sein, wie die Maßstabsleiste ist).
    2. Öffnen Sie Analysieren > legen Sie den Maßstab fest. Schreiben Sie den bekannten Abstand (die Länge der Linie wird automatisch in das Feld Abstand in Pixel eingetragen. Stellen Sie sicher, dass Sie ein Häkchen bei Global setzen.
    3. Drücken Sie OK. Nun wird der Maßstab für das zu analysierende Bild festgelegt.
  3. Um die planimetrische Ermittlung zu starten, führen Sie das Makro (Ergänzungsdatei 2) aus.
    1. Klicken Sie auf Verarbeiten > Batch->Makro.Wählen Sie den Ordner aus, der die zu analysierenden Bilder enthält. Dieser Ordner ist der Input.
    2. Wählen Sie den in Schritt 5.3.1 erstellten Ordner als Ausgabe aus. Drücken Sie auf Verarbeiten.
  4. Bewerten Sie zur Qualitätsprüfung, ob die gemessene Sphäroidfläche mit dem Originalbild übereinstimmt.
    HINWEIS: Das Makro schließt Sphäroide am Rand aus, bei denen nur ein Teil des Sphäroids gemessen werden kann.

6. Sammlung von Sphäroiden

HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Sphäroide mit weiten Bohrspitzen zu sammeln, um ihre 3D-Struktur zu erhalten. Die Entnahme kann mit Hilfe des Stopfens an der Vorderseite des Bioreaktors erfolgen (Abbildung 2A).

Die Größe der Sphäroide bei der Entnahme kann je nach Zelllinie, Ausgangsanzahl der Zellen und Spaltungsprozess (Tage in Kultur, Anzahl der Sphäroide pro Bioreaktor und Spaltungsverhältnis) variieren.

  1. Um Sphäroide zu sammeln, entnehmen Sie 5 ml Medien aus dem Bioreaktor durch den oberen Anschluss mit einer Spritze, die mit einer langen Nadel gekoppelt ist. Achten Sie darauf, die Sphäroide in die untere Mitte des Bioreaktors (in der Nähe des unteren Anschlusses) sinken zu lassen.
  2. Öffnen Sie den vorderen Anschluss und sammeln Sie die Sphäroide mit einer 1 ml breiten Spitze. Platzieren Sie die Sphäroide in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 500 x g für 5 min und verwerfen Sie das Medium.
  3. Waschen Sie die Sphäroide mit 200 μl HBSS, um das FBS zu entfernen. Bei 500 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  4. Das Sphäroidpellet mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Verarbeitung bei -80 °C lagern.

7. Lebensfähigkeit von Sphäroiden

ANMERKUNG: Die Lebensfähigkeit von Sphäroiden wurde durch Messung der Aktivität der Adenylatkinase (AK) bestimmt, die von geschädigten Zellen freigesetzt wird (Abbildung 4A). Aufgrund des Diffusionsgradienten ist die AK-Messung effizient, wenn Sphäroide einen Durchmesser von weniger als 900 μm haben12. Wenn die Sphäroide größer werden oder wenn Zweifel an der Viabilitätsmessung bestehen, kann ein ATP-Assay durchgeführt werden15.

  1. Sammeln Sie den sphärischen Überstand und geben Sie 20 μl auf eine weißwandige 96-Well-Platte (flacher Boden klar). Geben Sie 100 μl Adenylatkinase-Detektionsreagenz in jede Vertiefung und homogenisieren Sie es, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
  2. Entfernen Sie Blasen durch Zentrifugieren im Geschwindigkeitsvakuum für 2 min bei RT. Inkubieren Sie die Platten für 20 Minuten bei RT.
  3. Legen Sie die Platte in das Luminometer (Plattenleser, Lumineszenzmodus) und starten Sie das Programm. Stellen Sie die Parameter gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers ein.
    HINWEIS: In Biolumineszenz-Viabilitäts-Assays kann die direkte Lichtleistung des Luminometers (in der Regel RLUs) verwendet werden, um die Zellantwort zu berechnen. Da Adenylatkinase nur aus Zellen austritt, deren Zellintegrität beeinträchtigt ist, ist es möglich, eine vollständige Adenylatkinase-Kontrolle durch die Verwendung eines Lysereagenzes zu erreichen.

8. Protein-Extraktion

HINWEIS: Abbildung 1B zeigt den Arbeitsablauf für die Verarbeitung von Sphäroiden und die Proteinextraktion.

  1. Sammle Sphäroide (Abschnitt 6) an Tag 36. Resuspendieren Sie Sphäroide in 25 μl 5% SDS, um die Zellen zu lysieren.
    1. Nach Zugabe von 5 % SDS homogenisieren Sie das Pellet durch Auf- und Abpipettieren. In einigen Fällen, in denen es schwierig ist, die Sphäroide zu lysieren, verwenden Sie einen kleinen Stößel.
  2. Inkubieren Sie die Proben 1 h lang mit 20 mM DTT, um Proteine zu reduzieren. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
  3. Proben mit 40 mM Jodacetamid für 30 min vor Licht- bis Alkylatproteinen geschützt inkubieren. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
  4. 12%ige Phosphorsäurelösung (10x) in einer Endkonzentration von 1,2 % zu den Proben geben.
  5. Verdünnen Sie die Proben in sechs Volumina Bindepuffer und mischen Sie sie vorsichtig.
  6. Laden Sie die Probe auf eine S-Trap-Filterplatte und schleudern Sie sie 30 s lang bei 500 x g herunter.
    HINWEIS: Wenn das Gesamtvolumen der Probe in Schritt 8.4 die Volumenkapazität der Säule überschreitet, laden Sie die Proben in Chargen und wiederholen Sie Schritt 8.6, bis alles durch die Säule geleitet ist.
  7. Waschen Sie die Proben zweimal mit 150 μl Bindepuffer. Nach jedem Waschgang 30 s lang bei 500 x g herunterschleudern und den Durchfluss verwerfen.
  8. Die Proben werden über Nacht bei 37 °C mit 1 μg Trypsin in Sequenzierqualität, verdünnt in 50 mM Ammoniumbicarbonat, inkubiert.
    HINWEIS: Mindestens 20 μg Protein werden als Ausgangsmaterial für eine umfassende Proteomanalyse empfohlen. Hierfür ist 1 μg Trypsin die ideale Menge für eine effiziente Verdauung. Entfernen Sie alle Blasen zwischen dem Puffer und dem Säulenbett.
  9. Peptide mit 40 μl 50 mM Ammoniumbicarbonat eluieren und in dasselbe Sammelröhrchen poolen.
  10. Bei 500 x g 30 s runterschleudern. Eluieren Sie Peptide mit 40 μl 0,1 % TFA und bündeln Sie sie im selben Sammelröhrchen.
  11. Bei 500 x g 30 s runterschleudern. Die Peptide werden mit 40 μl 60 % Acetonitril und 0,1 % TFA eluiert und in dasselbe Sammelröhrchen gepoolt.
  12. Bei 500 x g 30 s runterschleudern. Trocken gepoolte Eluate im Geschwindigkeitsvakuum und lagern die Proben bis zur Verarbeitung bei -80 °C.

9. Bereinigung der Probe

HINWEIS: Bevor Sie mit der Proteomik-Analyse fortfahren, ist es notwendig, das in den Proben vorhandene Salz zu entfernen. Salze können die Analyse der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) beeinträchtigen, da sie während des Elektrosprays ionisieren und das Signal von Peptiden unterdrücken. Der in dieser Studie verwendete Aufbau zur Entsalzung wurde zuvor von Joseph-Chowdhury und Kollegen demonstriert16.

  1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass eine saubere 96-Well-Sammelplatte vorhanden ist, um den Durchfluss während der folgenden Schritte aufzufangen. Mischen Sie das C18-Harz (50 mg/ml in 100% Acetonitril) auf einer magnetischen Rührplatte.
  2. Fügen Sie 70 μl der C18-Harzsuspension pro Vertiefung der 96-Well-Filterplatte hinzu, um sicherzustellen, dass sich das C18-Harz nicht am Boden der Pipette ansammelt.
  3. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um Spritzer zu vermeiden. Verwerfen Sie den Durchfluss, der auf der 96-Well-Sammelplatte gesammelt wurde.
  4. Waschen Sie das Harz mit 100 μl 0,1 % TFA. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen und Vermischen der Proben zu verhindern, und verwerfen Sie den Durchfluss.
  5. Resuspendieren Sie jede Probe in 100 μl 0,1 % TFA. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert zwischen 2 und 3 liegt.
  6. Laden Sie jede Probe in jede Vertiefung der Filterplatte. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen und Vermischen der Proben zu verhindern, und verwerfen Sie den Durchfluss.
  7. Mit 100 μl 0,1 % TFA waschen. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen und Vermischen der Proben zu verhindern. Verwerfen Sie den Durchfluss.
  8. Ersetzen Sie die 96-Well-Sammelplatte durch eine neue 96-Well-Platte, um die entsalzten Proben zu sammeln.
  9. Fügen Sie 60 μl Acetonitril/0,1 % TFA pro Vertiefung hinzu. Um die Proben aus dem C18-Harz zu eluieren, schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um Spritzer zu vermeiden.
  10. Den Durchfluss auffangen und in einem Geschwindigkeitsvakuum bei RT trocknen. Fahren Sie mit LC-MS/MS fort oder lagern Sie die Platte bei -80 °C, bis sie bereit ist, die Proben zu verarbeiten.

10. Proteomik-Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie

HINWEIS: Um die Daten für dieses Manuskript zu generieren, wurde ein nLC-MS/MS-System mit einem Zwei-Säulen-Systemaufbau mit einer 300 μm ID x 0,5 cm C18-Trap-Säule und einer 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analytischen Nanosäule verwendet, die im eigenen Haus verpackt wurde.

  1. Bereiten Sie die mobilen Phasen für die Durchführung auf der HPLC vor:
    Mobile Phase A (MPA): 0,1 % Ameisensäure in HPLC-Wasser
    Mobile Phase B (MPB): 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril in HPLC-Qualität
  2. Programmieren Sie die HPLC-Methode wie folgt: 4%-34% MPB über 120 min, 34%-90% MPB über 5 min, isokratische 90% MPB über 5 min; Durchflussrate: 300 nL/min.
  3. Richten Sie die MS-Erfassungsmethode ein, um eine datenunabhängige Erfassung (DIA) durchzuführen, um MS/MS-Spektren der detektierten Peptidsignale zu erzeugen.
  4. Resuspendieren Sie 1 μg Proben in 10 μl mit 0,1 % TFA, bevor Sie die Proben in den nLC-Autosampler geben.
  5. Führen Sie die nLC-MS-Methode wie programmiert für die kanonische Proteomik-Erfassung aus:
    1. Stellen Sie den vollständigen MS-Scan auf 300-1100 m/z im Orbitrap ein, mit einer Auflösung von 120.000 (bei 200 m/z) und einem AGC-Ziel (Automatic Gain Control) von 125.
    2. MS/MS im Orbitrap mit einem sequentiellen Isolationsfenster von 50 m/z mit einem AGC-Ziel von 400 und einer höherenergetischen Kollisionsdissoziationsenergie (HCD) von 30.

11. Datenanalyse

  1. Importieren Sie die nLC-MS/MS-Rohdatendateien in eine Peak-Detektionssoftware, die mit der verwendeten MS-Plattform kompatibel ist.
  2. Wählen Sie die richtige Datenbank (Mensch, Maus usw.) aus.
  3. Setzen Sie die N-terminale Acetylierung als variable Modifikation und Carbamidomethylcystein als feste Modifikation.
  4. Geben Sie Trypsin als Verdauungsenzym an, wobei zwei verpasste Spaltungen zulässig sind.
  5. Stellen Sie die Massentoleranz entsprechend dem Massenanalysator ein, der für die Spektrenerfassung verwendet wird.
  6. Exportieren Sie die Analyse als Tabellenkalkulation und verarbeiten Sie die Daten bei Bedarf weiter.

Ergebnisse

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In diesem Protokoll beschreiben wir die Eigenschaften eines innovativen stressfreien 3D-Zellinkubators, eines Systems, das speziell für die Kultivierung von 3D-Sphäroiden entwickelt wurde (Abbildung 2). Wir haben das Protokoll für die 3D-Kultivierung von THLE-3- und HepG2/C3A-Zelllinien optimiert. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach anzuwenden und ermöglicht die Reproduzierbarkeit und kostengünstige Kultivierung von > 100 Sphäroiden pro Bioreaktor. Im Bioreaktor werden die Sphäroide ähnlich behandelt wie Zellen, die in einer 2D-Kultur gehalten werden. Optimale Wachstumsbedingungen werden erreicht, indem das Medium zwei- bis dreimal pro Woche ausgetauscht wird (Abbildung 2B) und die Rotationsgeschwindigkeit entsprechend dem Wachstum und der Größe der Sphäroide angepasst wird (Abbildung 2C). Dieses System, in dem 3D-Sphäroide in rotierenden Bioreaktoren kultiviert werden (Abbildung 2E,F), bietet eine optimale Wachstumsumgebung für 3D-Strukturen, indem das Sphäroid einer gleichen und sehr geringen Scherkraft ausgesetzt wird.

Wir haben bereits gezeigt, wie Sphäroide für die Analyse der Chromatinmodifikation16 verwendet werden können. Hier zeigen wir im Detail, wie man Lebersphäroide erhält und wie Proteomik-Experimente zur Analyse des gesamten Proteoms durchgeführt werden können (Abbildung 1). Kurz gesagt, das Protokoll wurde durch die Verwendung von THLE-3- oder HepG2/C3A-Flachzellen initiiert, bis die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreichte. Um Zellen als Sphäroide zu kultivieren, wurden etwa 2.000 Zellen in eine Platte mit extrem niedriger Anhaftung plattiert, die Mikrowellen enthielt, damit sie sich selbst aggregieren konnten, und dann wurden die gebildeten Sphäroide in einen Bioreaktor übertragen (Abbildung 1A). Obwohl sie nach 3 Wochen in der Kultur funktionell aktiv sind, wie zuvorgezeigt wurde 17, zeigen wir Ergebnisse von Sphäroide, die nach 36 Tagen in Kultur für dieses Protokoll gesammelt wurden. Nach der Entnahme wurden die Sphäroide heruntergeschleudert und sowohl das Pellet als auch der Überstand für die Analyse gelagert. Die Zellviabilität wurde anhand des Überstandes für die Quantifizierung der von geschädigten Zellen freigesetzten Adenylatkinase bewertet, wie zuvor beschrieben17. Zelluläre Proteine wurden aus dem Zellpellet extrahiert und das gesamte Proteom mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert (Abbildung 1B).

Dieses Protokoll demonstriert auch ein halbautomatisches Verfahren zur Zählung von Sphäroiden (Abbildung 3A) unter Verwendung des öffentlichen Bildverarbeitungsprogramms FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Für die Analyse sollte ein qualitativ hochwertiges Bild des Sphäroids aufgenommen werden, und einige Parameter sollten berücksichtigt werden, wie in Abschnitt 5 erwähnt. Nachdem das Bild für die Analyse vorbereitet wurde, wird ein Makroskript (Ergänzungsdatei 1) zum Zählen der Sphäroide verwendet. Das Makro funktioniert, indem es zunächst einen Ordner mit dem Namen FIJI Spheroids counting in dem Ordner erstellt, in dem sich die Sphäroidbilder befinden. In diesem Ordner werden alle Informationen aus der Analyse gespeichert. Dazu gehört ein Bild der gezählten Sphäroide, mit einer ID-Nummer auf jedem Sphäroid. Es enthält auch eine Excel-Datei namens Sphäroidzählung. Diese Datei enthält die Pixelfläche und die ID-Nummer für jedes Sphäroid, das gezählt wurde. Die Daten, die einem analysierten Bild entsprechen, werden auf jeder Registerkarte der Datei angezeigt. Die Registerkarte ist nach dem Namen des analysierten Bildes beschriftet. Da die Größe der Sphäroide durch viele Faktoren beeinträchtigt werden kann, einschließlich der Anzahl der Strukturen innerhalb eines Gefäßes und der medikamentösen Behandlung, ist es auch wichtig, ihre Oberfläche zu überwachen (Planimetrie). Das hier vorgestellte Makroskript (Ergänzungsdatei 2) arbeitet mit der Messung der schwarzen Bereiche, die den Sphäroiden im Bild entsprechen (Abbildung 3B). Die Ausgabe wird in einer Datei namens planimetry.xlsx gesammelt, die die gemessene Fläche, den Umfang und den Durchmesser jedes Sphäroids enthält. Es gibt auch ein Maß namens Feret, das zur Berechnung des Durchmessers verwendet wird. Feret ist der längstmögliche Durchmesser, während minFeret der kürzeste ist. Der Durchmesser ist der Durchschnitt dieser beiden. Im Ausgabeordner befindet sich neben der planimetrie.xlsx Datei auch ein Bild der gemessenen Sphäroide.

Bevor mit der Proteomanalyse begonnen wurde, wurde die Lebensfähigkeit der Sphäroide über die Kulturzeit bewertet. Die AK-Spiegel steigen bis zum 17. Tag an und erreichen etwa 7 % des Zelltods, und dann sinkt der Tod auf Werte unter 5 % (Abbildung 4A), was mit der zuvor veröffentlichten Arbeit17 übereinstimmt. Dieses Protokoll zeigt auch die vollständige Proteomanalyse zur Überwachung des Zellphänotyps. Zunächst wurden die Proteome von THLE-3 und HepG2/C3A Flachzellen und Sphäroiden verglichen. Durch die Analyse der ersten Hauptkomponente (PC1) wird deutlich, dass es eine strikte Trennung von Sphäroidproben und flachen Zellkulturen gibt, und es scheint, dass die Korrelation des Zelltyps (THLE-3 und HepG2/C3A) nicht relevant ist (Abbildung 4B). Obwohl THLE-3- und HepG2/C3A-Sphäroide nicht zusammenwachsen, haben sie ähnliche Profile, die mit der Leberfunktion übereinstimmen. Wir zeigen in diesem Protokoll das Beispiel von Metallothioneinen, die eine Rolle bei der Metallentgiftung durch die Leber spielen. In der Proteomik-Analyse identifizierten wir 2 Isoformen, die in Sphäroiden im Vergleich zu flachen Zellen (MT1E und MT1X) überexprimiert sind (Abbildung 4C). Wir zeigen auch die Gene Ontology (GO) Anreicherung beider Zelllinien, die als Sphäroide gezüchtet wurden. Der Kohlenhydratstoffwechsel, der den Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), die Elektronentransportkette (Zellatmung) und den Pyruvatstoffwechsel umfasst, ist ein häufiger Begriff und wird sowohl in HepG2/C3A- als auch in THLE-3-Sphäroiden angereichert (Abbildung 4D,E). Zelluläre Entgiftung, Fettsäure- und Cholesterinstoffwechsel sind weitere Funktionen, die in beiden Sphäroiden angereichert sind. Zusammen sind diese Funktionen bekanntermaßen entscheidend für die Leberfunktion.

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Abbildung 1: Arbeitsablauf für Sphäroide, Kultur und Probenvorbereitung . (A) Experimenteller Ansatz für 3D-Zellkulturen. Flachzellkulturen bei gewünschter Konfluenz wurden trypsinisiert und auf einer 24-Well-Platte mit extrem niedriger Anhaftung ausgesät, die Mikrowells enthielt, in denen sich die Zellen selbst zu Sphäroiden zusammensetzen. Nach 24 h wurden die Sphäroide in einen Bioreaktor überführt und kultiviert, bis sie für die Analyse bereit sind. (B) Nach der Entnahme wurden die Sphäroide pelletiert, und sowohl das Pellet als auch der Kulturüberstand wurden bis zur Verarbeitung gelagert. Histone16und Nicht-Histonproteine wurden extrahiert, zu Peptiden verdaut und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert. Die aus der Massenspektrometrie gewonnenen Rohdateien wurden mit der menschlichen Datenbank abgeglichen und die Daten wurden weiterverarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: 3D-Zellkultursystem . (A) Teile des Bioreaktors. Der Bioreaktor besteht aus einer Gasaustausch- und Befeuchtungskammer mit Wasserperlen und einer zu öffnenden Zellkammer mit zwei Stopfen für den Medienaustausch und die Sphäroidesammlung. (B) Austausch von Bioreaktormedien. Der Bioreaktor wird mit einer Spritze mit einer Nadel mit 10 ml Nährmedium gefüllt. (C) Die Systemsteuerungs-App. Die Drehzahl, der CO2-Gehalt, die Temperatur, das Alarmprotokoll und andere Funktionen können über das Steuergerät gesteuert werden. (D) Platzierung des Bioreaktors im 3D-Inkubator. Jeder Bioreaktor verfügt über einen zugehörigen Motor, der den Bioreaktor langsam drehen kann. (E) Bioreaktor in Bewegung mit der Drehzahl (U/min), die von einer (C)-Tablette gesteuert wird. Die Drehzahl (U/min) wird entsprechend der Größe der Sphäroide eingestellt. (F) Bioreaktoren im 3D-Inkubator. Der 3D-Inkubator bietet Platz für bis zu 6 einzeln gesteuerte Bioreaktoren. Foto mit freundlicher Genehmigung von Jason Torres Photography. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Phänotypische Charakterisierung von Sphäroiden mittels Bildaufnahme . (A) Halbautomatische Sphäroidzählung. Nach der Aufnahme von Schnappschüssen der Sphäroide im Bioreaktor wird das Bild für die Analyse auf den Fidschi-Inseln vorbereitet. Jedes Sphäroid wird gezählt, und für jedes von ihnen wird eine ID-Nummer angegeben. Ein Makro wird verwendet, und die Ergebnisse werden mit der ID für das gezählte Sphäroid, der Beschriftung (Name des analysierten Bildes) und dem Bereich (die Anzahl der im Sphäroid gezählten Pixel) angezeigt. (B) Planimetrische Bestimmung der Sphäroidfläche. Mit Hilfe eines Makros werden die Fläche, der Umfang und der Durchmesser eines bestimmten Sphäroids bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Proteomanalyse von Lebersphäroiden . (A) Die Viabilität der Sphäroide wurde auf der Grundlage der Freisetzung der Adenylatkinase (AK) auf dem Kulturüberstand berechnet. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte für doppelte Datenpunkte ± SD. (B) Es wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, um das Proteom von THLE-3 und HepG2/C3A Flachzellen und Sphäroiden zu vergleichen. (C) Relative Häufigkeit von Metallothioneinen, bei denen es sich um Proteine handelt, die von der menschlichen Leber exprimiert werden. Die Daten werden als Mittelwerte ± REM dargestellt. (D) Funktionell gruppierte Netzwerke zeigen GO-Anreicherung für HepG2/C3A-Sphäroide und (E) THLE-3-Sphäroide, wobei nur die Markierung des höchstwertigen Terms pro Gruppe angezeigt wird. Das Netzwerk wurde mit ClueGo19 aufgebaut. Die Knotengröße stellt die Bedeutung des Begriffs Anreicherung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: Makroskript für die Sphäroidzählung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: Makro für die planimetrische Bestimmung von Sphäroide. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Das Verständnis der Biologie hinter dreidimensionalen (3D) zellulären Strukturen ist äußerst wichtig für ein umfassenderes Wissen über ihre Funktionalitäten. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von 3D-Modellen für die Untersuchung komplexer Biologie und die Durchführung von Toxizitätsscreenings. Bei der Kultivierung von Zellen in 3D müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, einschließlich der phänotypischen Bewertung des Modellsystems. Ein Phänotyp ist definiert als eine Gruppe von beobachtbaren Merkmalen eines bestimmten Organismus, wie z. B. Morphologie, Verhalten, physiologische und biochemische Eigenschaften20.

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Proteomik-Experimente mit wenigen Sphäroiden durchgeführt und zur Überwachung des typischen Leberphänotyps verwendet werden können. Die Massenspektrometrie hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur 3D-Zellcharakterisierung entwickelt, die die Untersuchung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen ermöglicht 12,16,21,22. Für eine umfassende Proteomanalyse empfiehlt es sich, mindestens 20 μg Protein-Ausgangsmaterial zu verwenden, von dem 1 μg in das Massenspektrometer injiziert wird. Es ist wichtig zu erwähnen, dass das Hinzufügen von weniger Proben zu einem Verlust der Empfindlichkeit führen kann, und dass das Hinzufügen von mehr Probe die Qualität der Chromatographie allmählich verschlechtern und schließlich zu einer Verstopfung der Säule führen würde. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass die HepG2/C3A- und THLE-3-Sphäroide mit wichtigen Proteinen aus der Glykolyse und dem TCA-Zyklus angereichert sind, die spezifische Leberwege sind und für die Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels und für die Energieproduktion entscheidend sind23,24. Tatsächlich liefert die massenspektrometrische Analyse nicht nur Informationen auf Proteinebene, sondern ermöglicht auch die Untersuchung von posttranslationalen Proteinmodifikationen, wie unsere Gruppe16 bereits gezeigt hat.

Ein weiterer Aspekt, der bei 3D-Phänotypstudien zu berücksichtigen ist, ist die Anzahl und Größe der Sphäroide. Neben der Reproduzierbarkeit von Experimenten ist das Zählen der Anzahl der Sphäroide und die Bestimmung ihrer Größe unerlässlich, um zu bestimmen, wann die Kultur in mehrere Bioreaktoren aufgeteilt werden muss, da die Anzahl der 3D-Strukturen innerhalb eines Gefäßes die Größe und die Stoffwechselaktivität der Sphäroide beeinflussen kann. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die Anzahl und Größe der Sphäroide von der Zelllinie, der Startanzahl der Zellen, dem Teilungsprozess und dem Zeitpunkt der Entnahme abhängen. Details zur HepG2/C3A-Sphäroidkultur, wie z. B. die Anzahl der Zellen pro Sphäroide, der Proteingehalt und die Größe in Abhängigkeit vom Alter, wurden von Fey, Korzeniowska und Wrzesinski25 bereitgestellt. Für eine genaue und erfolgreiche Analyse mit der hier beschriebenen halbautomatischen Methode ist der kritischste Schritt ein gutes Sphäroidebild. Der Einfachheit halber kann das Bild mit einem Telefon oder Tablet aufgenommen werden, aber die Auflösung sollte so hoch wie möglich gehalten werden. Da Bilder schnell aufgenommen werden können, ermöglichen sie groß angelegte Screening-Experimente, um bestimmte phänotypische Merkmale zu visualisieren oder das Ansprechen auf eine medikamentöse Behandlung zu untersuchen. Aufgrund der steigenden Anzahl von zellbasierten Assays wurden daher in den letzten 10 Jahren eine Reihe von Open-Source-Software für die Bildanalyse entwickelt26. In diesem Protokoll beschreiben wir ein halbautomatisches System, das die Software FIJI18 verwendet, um die Größe von Sphäroiden zu zählen und zu messen. Wir haben Skripte (einfache Programmierbefehle) vorgestellt, um eine Abfolge von algorithmischen Operationen zu definieren, die auf eine Bildsammlung angewendet werden können, was die Analyse zu einem einfachen und schnellen Prozess macht. Je nach Charakteristik des Sphäroids sollte jedoch eine manuelle Messung durchgeführt werden. Wenn zum Beispiel die Sphäroide zu durchscheinend sind, ist die FIJI-Schrift ungenau. Eines der wichtigsten Kriterien für das Funktionieren dieser Methode ist übrigens die Kompaktheit der Sphäroide. Diese Eigenschaft trägt zu einem verstärkten Farbkontrast zwischen den Sphäroiden und dem Hintergrund bei, der für die Genauigkeit der Methode erforderlich ist.

Zusammenfassend wurde neben der Vorstellung einer Methodik zur Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide auch ein halbautomatisches System beschrieben, das mit phänotypischer Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik gekoppelt ist. Wir gehen davon aus, dass diese Toolbox für die Analyse von 3D-Zellen mit vollautomatischer Bildanalysesoftware und Massenspektrometern der nächsten Generation robuster wird.

Offenlegungen

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Helle Sedighi Frandsen ist als wissenschaftliche Mitarbeiterin bei CelVivo ApS, dem Hersteller des ClinoStar-Systems, beschäftigt. Karoline Mikkelsen ist eine industrielle Doktorandin, die bei CelVivo ApS beschäftigt ist und ihre Doktorarbeit an der SDU in Odense, Dänemark, durchführt. Alle anderen Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Das Sidoli-Labor bedankt sich bei der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenBio-Rad2239480
10 mLSpritze Fisher ScientificLuer-Lock-Spitze, graduiert auf 12 mL
1000 & micro; L Pipettenspitzen mit breiter ÖffnungFisher Scientific14222703
200 µ L Pipettenspitzen mit breiter ÖffnungFisher Scientific14222730
96-Well-Orochem-FilterplatteOrochem OF1100
96-Well-Platte mit SockelAxygenPCR-96-FS-C
96-Well-VakuumverteilerMilliporeMAVM0960R
AmmoniumbicarbonatSigmaA6141-25G
Bronchialepitheliales Zellwachstumsmedium (BEGM)LonzaCC-3170
Wasser in ZellkulturqualitätCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivoN/ABioreaktor für 3D-Zellkulturen
ClinoStar InkubatorCelVivoN/ACO2 Inkubator für 3D-Zellkulturen
DTTSigmaD0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Elplasia 24-Well-Platte mit ultraniedrigem Aufsatz und rundem Boden mit MikrowellsCorning4441
Fötales RinderserumFisher ScientificMT35010CV
AmeisensäureThermo28905
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)FisherScientific MT21022CV
hEGFCorning354052
HERAcell vios 160iThermo51033557CO2 Inkubator für 2D-Zellkulturen
HPLC-Qualität AcetonitrilFisher ScientificA955-4
HPLC-Qualität MethanolFisher ScientificA452-1
Wasser in HPLC-QualitätFisher ScientificW5-4
IodacetamidSigmaI1149-5G
L-GlutaminFisher ScientificMT25015CI
Nicht-essentielle AminosäurenFisher ScientificMT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µ mWaters186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MassenspektrometerThermoIQLAAEGAAPFADBMBHQHochauflösendes Massenspektrometer
PAULA MikroskopLeica
Penicillin-StreptomycinFisher ScientificMT3002CI
PerkinElmer Victor X2 Multilabel Mikroplatten-ReaderPerkinElmer
pH-PapierHydrion93
PhosphoetanolaminSigmaP0503
PhosphorsäureFisher ScientificA260-500
PipettenpistoleEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
KühlzentrifugeThermo75-217-420
Reprosil-Pur-HarzMSWILR13. AQ.003120 Å Porengröße, C18-AQ-Phase, 3 μ M Bead Größe
SDSBio-Rad1610301
Modifiziertes Trypsin in SequenzierqualitätPromegaV511A
SpeedVac Vakuumkonzentrator (96-Well-Platten)Thermo15308325Savant SPD1010
SterilhaubeThermo1375
Sterile serologische PipettenFisherScientific 1367549
S-FalleProtifiC02-micro-80
Spritzennadel (18 G)Fisher Scientific148171003" Länge, 0,05" Durchmesser
Trifluoressigsäure (TFA)Thermo28904
Trypsin-EDTAGibco25300-054
VortexSigmaZ258415
WasserbadFisher Scientific
1481754 FSGPD10

Referenzen

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  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
  3. Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
  4. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
  5. Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
  6. Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243(2022).
  7. Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
  8. Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
  9. Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
  10. van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
  11. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  12. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22(2018).
  13. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  14. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
  16. Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606(2022).
  17. Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
  20. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).
  21. Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
  22. Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
  23. Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
  24. Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
  25. Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
  26. Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).

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3D Spheroid CulturesPhenotypic AnalysisClinostat IncubatorHepG2 C3A CellsTHLE 3 CellsProteomics AnalysisSpheroid FormationLC MS ProteomicsImage CaptureCell Viability

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