Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لزرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج. تحفز هذه الطريقة الأوعية الدموية والنضج المعزز للعضويات في غضون 8 أيام ويمكن استخدامها لدراسة هذه العمليات بطريقة فعالة.
Abstract
تحتوي عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان على هياكل تشبه النيفرون تشبه تلك الموجودة في الكلى البالغة إلى حد ما. لسوء الحظ ، فإن قابليتها للتطبيق السريري يعوقها عدم وجود الأوعية الدموية الوظيفية وبالتالي النضج المحدود في المختبر. إن زرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج يحفز الأوعية الدموية عن طريق الأوعية الدموية المثقوبة ، بما في ذلك تكوين الشعيرات الدموية الكبيبية ، ويعزز نضجها. هذه التقنية فعالة للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للزرع الداخلي لعضويات الكلى في أجنة الدجاج ، يليه حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت لتلطيخ الأوعية الدموية المثقوبة ، وجمع المواد العضوية المزروعة لتحليل التصوير. يمكن استخدام هذه الطريقة للحث على دراسة الأوعية الدموية العضوية والنضج للعثور على أدلة لتعزيز هذه العمليات في المختبر وتحسين نمذجة المرض.
Introduction
لقد ثبت أن عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) لديها إمكانات للدراسات التنموية1،2،3،4 ، وفحص السمية 5،6 ، ونمذجة المرض5،7،8،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن قابليتها للتطبيق لهذه الأغراض وأغراض الزرع السريري في نهاية المطاف محدودة بسبب عدم وجود شبكة الأوعية الدموية. أثناء نمو الكلى الجنينية ، تتفاعل الخلايا القلبية والخلايا المتوسطة والخلايا البطانية الوعائية (ECs) لتشكيل البنية المعقدة للكبيبة. بدون هذا التفاعل ، لا يمكن أن يتطور حاجز الترشيح الكبيبي ، الذي يتكون من الخلايا الدموية ، والغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، و ECs ، بشكل صحيح14،15،16. على الرغم من أن عضويات الكلى في المختبر تحتوي على بعض ECs ، إلا أنها تفشل في تكوين شبكة أوعية دموية مناسبة وتتضاءل بمرور الوقت17. لذلك ليس من المستغرب أن تظل الكائنات العضوية غير ناضجة. زرع في الفئران يحفز الأوعية الدموية ونضوج عضويات الكلى18،19،20،21. لسوء الحظ ، هذه عملية كثيفة العمالة وغير مناسبة لتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية.
تم استخدام أجنة الدجاج لدراسة الأوعية الدموية وتطورها لأكثر منقرن 22. يمكن الوصول إليها بسهولة ، وتتطلب صيانة منخفضة ، وتفتقر إلى نظام مناعي يعمل بكامل طاقته ، ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي بعد فتح قشر البيض23،24،25،26. ثبت أن زرع المواد العضوية على الغشاء المشيمي الولعي (CAM) يؤدي إلى الأوعية الدموية27. ومع ذلك ، فإن مدة الزرع على CAM ، وكذلك مستوى نضوج الكسب غير المشروع ، محدودة بتكوين الطب التكميلي والبديل ، والذي يستغرق حتى اليوم الجنيني 7 حتى يكتمل. لذلك ، تم تطوير طريقة مؤخرا لكفاءة الأوعية الدموية وعضويات الكلى الناضجة من خلال زرع inenterlomic في أجنة الدجاج28. من المعروف أن التجويف السيلومي لأجنة الدجاج منذ ثلاثينيات القرن العشرين هو بيئة مواتية لتمايز الأنسجة الجنينية29,30. يمكن الوصول إليه في وقت مبكر من التطور الجنيني ويسمح بتوسع غير محدود نسبيا للكسب غير المشروع في جميع الاتجاهات.
تحدد هذه الورقة بروتوكولا لزرع عضويات الكلى المشتقة من hiPSC في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج في اليوم 4. هذه الطريقة تحفز الأوعية الدموية وتعزيز نضوج المواد العضوية في غضون 8 أيام. يتيح حقن عدسة كوليناريس أغلوتينين (LCA) ذات العلامات الفلورية قبل التضحية بالأجنة تصور الأوعية الدموية المثقوبة داخل المواد العضوية من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وفقا للقانون الهولندي ، لم تكن موافقة لجنة رعاية الحيوان مطلوبة لهذا البحث.
1. تحضير عضويات الكلى المشتقة من hiPSC للزراعة
- قم بتمييز hiPSCs إلى عضويات الكلى باستخدام البروتوكول الذي طوره Takasato et al.4،18،31. استزراع الكائنات العضوية التي تتبع هذا البروتوكول على إدراج زراعة خلايا البوليستر مع مسام 0.4 ميكرومتر (إدراج زراعة الخلية) حتى اليوم 7 + 12 من التمايز. سيحتوي كل إدراج لثقافة الخلية على ثلاثة عضويات.
- إزالة المواد العضوية من إدراج ثقافة الخلية.
- اصنع ثقبا في منتصف غشاء ثقافة الخلية مع زوج من ملقط التشريح. باستخدام مقص التشريح ، قم بإجراء ثلاث جروح في الغشاء من الفتحة الموجودة في المنتصف إلى حافة إدراج ثقافة الخلية ، مع القطع بين المواد العضوية. سيؤدي ذلك إلى ثلاث قطع من الغشاء ، لكل منها عضو عضوي واحد متصل ، والتي لا تزال متصلة بإدراج ثقافة الخلية عند حافتها الخارجية.
- أمسك بإحدى قطع الغشاء بالقرب من حافتها الخارجية بزوج من الملقط وقم بتمزيقها من إدخال مزرعة الخلية. ضع قطعة الغشاء مع العضو العضوي المرفق في طبق بتري. أضف بضع قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS-/-) إلى العضو العضوي لتجنب الجفاف. كرر للعضوين الآخرين.
- قم بتقسيم المواد العضوية عن طريق تثبيت غشاءها في مكانه بالملقط وتقطيعها إلى نصفين بشفرة حلاقة مزدوجة الحافة من الفولاذ المقاوم للصدأ (العضو العضوي بالكامل كبير جدا بحيث لا يمكن للسيلوم استيعابه في هذه المرحلة من التطور). ادفع النصفين العضويين برفق عن الغشاء باستخدام تشريح الجافية. تخلص من الغشاء واترك المواد العضوية في DPBS-/- حتى الزرع.
ملاحظة: قم بإعداد ثلاثة عضويات كحد أقصى في وقت واحد للزرع لتجنب الإجهاد على الكائنات العضوية قبل الزرع. من الناحية المثالية ، يقوم شخص ما بإعداد المواد العضوية بينما يقوم شخص آخر بإجراء عملية الزرع.
2. تحضير أجنة الدجاج للزراعة
- احتضان بيض ليغورن الأبيض المخصب. ابدأ حضانة البويضات في يوم تمايز أعضاء الكلى 7 + 8 لضمان التوقيت الصحيح للزرع.
- ضع بيض قرن الساق الأبيض المخصب (Gallus domesticus) أفقيا على حامل (الشكل 1 أ ؛ اليوم 0) ، بمناسبة منتصف الجانب المواجه لأعلى بقلم رصاص.
ملاحظة: يمكن استخدام حوامل بلاستيكية مصنوعة حسب الطلب أو كرتون بيض كحوامل لاحتضان البيض. - ضع الحامل مع البيض في حاضنة مرطبة عند 38 ± 1 درجة مئوية (الشكل 1 أ ؛ اليوم 0).
- احتضان البيض لمدة 3 أيام ، والحفاظ على حوض الماء في الحاضنة مملوءة.
- ضع بيض قرن الساق الأبيض المخصب (Gallus domesticus) أفقيا على حامل (الشكل 1 أ ؛ اليوم 0) ، بمناسبة منتصف الجانب المواجه لأعلى بقلم رصاص.
- إنشاء نافذة في قشر البيض في يوم 3 من الحضانة.
- في اليوم 3 من الحضانة ، ضع قطعة صغيرة (~ 1 سم × 0.5 سم) من الشريط الشفاف على الطرف المدبب للبيضة (نهاية صغيرة). اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح.
- أدخل إبرة 19 جم على حقنة سعة 5 مل في الحفرة بزاوية 45 درجة ، وتجنب تلف كيس الصفار ، ونضح 2-3 مل من الزلال من البويضة لخفض الجنين داخل البويضة. أغلق الفتحة بقطعة ثانية (~ 1 سم × 0.5 سم) من الشريط الشفاف.
- ضع قطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف على الجانب المواجه لأعلى من البيضة المحدد بالقلم الرصاص. اصنع ثقبا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بالطرف الحاد لزوج من مقص التشريح (الشكل 1 أ ؛ اليوم 3).
- بدءا من هذه الحفرة ، قم بقص نافذة دائرية صغيرة في قشر البيض باستخدام مقص تشريح منحني. انظر من خلال هذه النافذة لتحديد موقع الجنين ، ثم قم بتكبير النافذة لتحسين الوصول إلى الجنين (الشكل 1 أ ؛ اليوم 3).
- قم بإزالة أي قطع كبيرة من قشر البيض قد تكون سقطت فوق الجنين باستخدام ملقط. قم بإزالة القطع الصغيرة عن طريق وضع بضع قطرات من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +/+) على الجنين باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ثم استنشاق DPBS +/+ مع قشر البيض في الماصة.
- أضف ثلاث قطرات من DPBS +/+ مع 0.5٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى البويضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
- أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف قبل إعادة البويضة إلى الحاضنة حتى اليوم الرابع من الحضانة ، عندما يكون الجنين في مرحلة هامبرغر هاميلتون 23-24 (HH 23-24) 32.
ملاحظة: إغلاق النافذة مهم جدا لتجنب الجفاف وموت الجنين. - افحص الأجنة يوميا للتأكد من صلاحيتها من خلال النظر إليها من خلال الشريط (لا تقم بإزالة الشريط لتجنب الجفاف). خلال هذه الأيام الأولى من الحضانة ، يتغير لون صفار البيض من الأصفر الفاتح إلى الأصفر غير اللامع عند موت الجنين. تخلص من الأجنة المتوفاة.
- الحفاظ على حوض الماء في الحاضنة مملوءة.
3. زرع Inenterlomic في اليوم 4 من الحضانة
- الوصول إلى التجويف السيلومي
- قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني.
- ضع البيضة تحت مجهر تشريح على حامل مطاطي أو كرتون بيض.
- جنين الدجاج الآن في HH 23-24 وملقى على جانبه الأيسر ، وجانبه الأيمن يواجه المشاهد (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4). حدد موقع الجناح الأيمن وبرعم الساق للجنين ، حيث سيتم الوصول إلى السيلوم بين هذين البرعمين الطرفين. في المنطقة الواقعة بين الجناح الأيمن وبرعم الساق ، قم بإنشاء فتحة متتالية في غشاء vitelline ، والمشيم ، والسلى ، عن طريق إمساكها بزوجين من ملقط التشريح وسحبها برفق في اتجاهين متعاكسين.
ملاحظة: غشاء vitelline هو الغشاء الأول الذي تتم مواجهته بعد فتح البويضة ، وفي بعض الحالات ، يكون تالفا بالفعل بعد صنع النافذة في اليوم 3. إذا كان الجنين يدور ، مستلقيا على جانبه الأيمن مع مواجهة جانبه الأيسر للمشاهد (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4) ، من الضروري قلبه لتمكين الزرع. للقيام بذلك ، قم بعمل فتحة كبيرة في غشاء vitelline والغشاء المشيمي ، ثم أدر الجنين بعناية باستخدام ملقط. - تحقق مما إذا كان هناك وصول دون عائق إلى التجويف السيلومي: أمسك برفق بحافة جدار الجسم بين الجناح وبرعم الطرف بزوج من ملقط التشريح واسحبه قليلا نحو المشاهد. يجب أن يكون التجويف السيلومي مرئيا بوضوح. أدخل بعناية أداة حادة ولكن رفيعة (على سبيل المثال ، سلك تنغستن حاد في حامل مشرط دقيق) في التجويف السيلومي.
ملاحظة: إذا كان إدخال الأداة الحادة في التجويف السيلومي غير ممكن ، فهذا يعني أن واحدا أو أكثر من الأغشية لم يتم فتحه بشكل صحيح.
- زرع
- ضع نصف عضوي داخل البيضة فوق الألانتوا باستخدام تشريح الجافية.
- باستخدام ملقط تشريح ، أمسك بعناية بحافة جدار الجسم واسحبها قليلا نحو المشاهد لجعل فتحة السيلوم مرئية.
ملاحظة: تجنب إتلاف الأوعية الدموية في جدار الجسم. - حرك العضو العضوي برفق نحو ومن خلال الفتحة الموجودة في جدار الجسم إلى السيلوم باستخدام سلك تنغستن حاد في حامل مشرط دقيق. ادفع العضو العضوي قليلا إلى الجمجمة لوضعه داخل السيلوم. يمكن رؤيته الآن خلف برعم الجناح مباشرة (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4).
- أضف ثلاث قطرات من DPBS +/+ إلى البيضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
- أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم 12 من الحضانة (8 أيام بعد الزرع).
- استمر في فحص الأجنة يوميا للتأكد من صلاحيتها من خلال النظر إليها من خلال الشريط (لا تقم بإزالة الشريط لتجنب الجفاف). تخلص من الأجنة المتوفاة.
ملاحظة: مع نمو الأجنة وأغشيتها المشيمية ، تصبح مرئية بشكل أكثر وضوحا من خلال الشريط. قلة حركة الجنين والأوعية الدموية المنهارة أو المتناثرة هي علامة على موت الجنين. - تحقق من حوض الماء في الحاضنة يوميا واحتفظ به ممتلئا.
4. حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت
- التحضير للحقن
- اصنع إبر الحقن المجهري الزجاجي عن طريق سحب الشعيرات الزجاجية الدقيقة في مجتذب ماصة بالإعدادات التالية: الحرارة 533 ، السحب 60 ، السرعة 150 ، الوقت 200. أثناء النظر من خلال مجهر التشريح ، قم بقطع النصائح بعناية عن إبر الحقن المجهري باستخدام ملقط تشريح لإنشاء فتحة.
ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المطلوبة لمجتذب الماصة الدقيقة وفقا للماكينة. - تجميع نظام الحقن. خذ قطعتين من أنابيب السيليكون 38 سم وقم بتوصيلهما ببعضهما البعض عن طريق وضع مرشح 0.2 ميكرومتر بينهما. أدخل قطعة فم في نهاية الأنبوب المتصل بمخرج المرشح (أنبوب السيليكون 1) ، وموصل بنهاية الأنبوب المتصل بمدخل المرشح (أنبوب السيليكون 2). أخيرا ، أدخل إبرة الحقن المجهري في الموصل (الشكل 1 ب).
- تمييع عدسة كوليناريس agglutinin المسمى بالفلورسنت (LCA) مع DPBS-/- إلى تركيز 2.5 ملغ مل -1 في أنبوب 0.5 مل وتدور لأسفل لمدة ~ 30 ثانية في جهاز طرد مركزي دقيق لنقل الركام إلى أسفل الأنبوب.
- ماصة 20 ميكرولتر من LCA على قطعة من البارافيلم.
- نضح 20 ميكرولتر من LCA من parafilm إلى إبرة الشعيرات الدموية الدقيقة لنظام الحقن المجمع.
- اصنع إبر الحقن المجهري الزجاجي عن طريق سحب الشعيرات الزجاجية الدقيقة في مجتذب ماصة بالإعدادات التالية: الحرارة 533 ، السحب 60 ، السرعة 150 ، الوقت 200. أثناء النظر من خلال مجهر التشريح ، قم بقطع النصائح بعناية عن إبر الحقن المجهري باستخدام ملقط تشريح لإنشاء فتحة.
- حقن
- قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ضع البيضة تحت مجهر تشريح في حامل مطاطي.
- تقييم الأوعية الدموية وتحديد الأوردة ، والتي يمكن تمييزها عن الشرايين بلونها الأحمر الأكثر إشراقا قليلا (الشكل 1 أ ؛ اليوم 12). لتحسين الوصول إلى الأوعية الدموية ، قم بتكبير النافذة بعناية عن طريق القطع بمقص تشريح منحني. حدد الوريد للحقن بناء على إمكانية الوصول والحجم.
- أدخل طرف إبرة الشعيرات الدموية الدقيقة في الوريد المحدد بزاوية 0 درجة -20 درجة. تأكد من وجود الإبرة في الوريد عن طريق تحريك الطرف برفق من جانب إلى آخر. نفخ بلطف وثبات في نظام الحقن لحقن LCA (الشكل 1A ؛ اليوم 12).
ملاحظة: إذا كانت الإبرة في الوريد في الموضع الصحيح ، فيجب أن تبقى داخل حدود الوريد. - ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح ل LCA بالدوران.
ملاحظة: ليس من الضروري إغلاق البيضة بشريط خلال هذا الوقت.
5. جمع المواد العضوية المزروعة في اليوم 12 من الحضانة
- التضحية بجنين الدجاج
- ضع البيضة في حامل مطاطي على المقعد. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ثم ، قطع الأغشية المحيطة بالجنين بمقص تشريح منحني.
ملاحظة: لا يلزم وجود مجهر تشريح لهذه الخطوة. - اغرف الجنين من البيضة بملعقة مثقبة وقطع رأس الجنين على الفور باستخدام المقص. ضع جسم الجنين في طبق بتري تحت مجهر التشريح.
- ضع البيضة في حامل مطاطي على المقعد. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ثم ، قطع الأغشية المحيطة بالجنين بمقص تشريح منحني.
- تحديد وجمع المواد العضوية
- ضع الجنين على ظهره في طبق بتري وانشر أطرافه.
- افتح بعناية جدار البطن للجنين على طول المحور الطولي باستخدام ملقط.
- حدد موقع العضو العضوي داخل الجنين. غالبا ما يتم ربط العضو العضوي بفص الكبد الأيمن ، إما عند الطرف الذيلي أو أسفل القفص الصدري مباشرة (الشكل 1 أ ؛ اليوم 12). لذلك يوصى بالبدء بالبحث في هذه المواقع.
- بمجرد تحديد موقع العضو العضوي ، قم بإزالته من الجنين عن طريق قطعه بمقص صغير. ضع العضو العضوي وأنسجة الدجاج المرتبطة به حتما في طبق بتري تحت مجهر التشريح. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مناديل الدجاج باستخدام شفرة حلاقة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ.
- معالجة العضو العضوي اعتمادا على التحليل المطلوب.
6. تلطيخ مناعي كامل التركيب
- ضع العضو العضوي المزروع في صفيحة من 24 بئرا وقم بتثبيته في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. اغسل 3x باستخدام DPBS-/-.
- تتخلل وتمنع العضو العضوي في 300 ميكرولتر من محلول الحجب (0.3٪ Triton-X في DPBS- / - يحتوي على 10٪ مصل حمار) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية: لواحد عضوي ، تمييع الأجسام المضادة الأولية NPHS1 (الأغنام α الإنسان ، تخفيف 1: 100) ، CD31 (الفأر α الإنسان ، تخفيف 1: 100) ، و LTL (البيوتين المترافق ، تخفيف 1: 300) في 300 ميكرولتر من محلول الحظر. أضف مزيج الأجسام المضادة إلى العضو العضوي واحتضانه لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- اغسل 3x مع 0.3٪ TritonX في DPBS-/-.
- تحضير مزيج الأجسام المضادة الثانوية: لواحد عضوي ، تمييع الأجسام المضادة الثانوية حمار α الأغنام Alexa Fluor 647 (تخفيف 1: 500) ، حمار α فأر Alexa Fluor 488 (تخفيف 1: 500) ، و streptavidin Alexa Fluor 405 (تخفيف 1: 200) في 300 ميكرولتر من محلول الحظر. أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوي إلى العضو العضوي واحتضانه لمدة 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطيتها بورق الألمنيوم لتجنب تعرض الأجسام المضادة الثانوية للضوء.
- اغسل 3x باستخدام DPBS-/-.
- قم بتضمين العضو العضوي في ~ 30 ميكرولتر من وسط التركيب في طبق سفلي زجاجي 35 مم واتركه يجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، مغطى بورق الألمنيوم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- صورة باستخدام مجهر متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تلخيص الطريقة والجدول الزمني لتمايز hiPSCs إلى عضويات الكلى ، وحضانة بيض الدجاج المخصب ، وزرع عضويات الكلى ، وحقن LCA ، وجمع المواد العضوية في الشكل 1 أ. من المهم تنسيق توقيت التمايز العضوي وحضانة بيض الدجاج ، بدءا من التمايز قبل 15 يوما من الحضانة. يتم توضيح الإجراءات في اليوم 0 و 3 و 4 و 12 من الحضانة بالصور الموجودة أسفل الجدول الزمني. يتم زرع المواد العضوية في اليوم 7 + 12 من التمايز في اليوم 4 (HH 23-24) أجنة الدجاج. يتم حقن LCA في الجهاز الوريدي للجنين بعد 8 أيام من الزرع لتلطيخ الأوعية الدموية المثقوبة ، قبل التضحية بالجنين واسترجاع العضو العضوي. يظهر نظام الحقن المجمع في الشكل 1 ب.
يتم التضحية بأجنة الدجاج في اليوم 12 من الحضانة (الشكل 1 أ). عند التشريح الدقيق للجنين ، يمكن عادة العثور على العضو المزروع متصلا بالكبد. بالنظر من خلال مجهر التشريح ، يبدو الأوعية الدموية (الشكل 1 أ ؛ اليوم 12 ؛ الخطوة 5.2.3). يؤكد التصوير البؤري للعضويات المزروعة المحقونة ب LCA والملطخة لهياكل النيفرون و ECs البشرية الأوعية الدموية بواسطة الأوعية الدموية المثقوبة (الشكل 2 أ) ، والتي تغزو أيضا الهياكل الكبيبية (الشكل 2 ب). الأوعية الدموية هي الخيمرون: يمكن تمييز ECs البشرية المثقوبة (CD31 + ، LCA +) ، ECs البشرية غير المثقوبة (CD31 + ، LCA-) ، و ECs المشتقة من الدجاج (CD31- ، LCA +) (الشكل 2A ، اللوحات III ، IV ، V).
الشكل 1: طريقة الزرع داخل المخ . (أ) الجدول الزمني لتمايز hiPSCs إلى عضويات الكلى ، وحضانة بيض الدجاج المخصب ، والزرع داخل بطانة الكلى العضوية. يبدأ تمايز hiPSCs إلى عضويات الكلى قبل 15 يوما من بدء حضانة بيض الدجاج (يوم التمايز 0 = يوم الحضانة -15) لتمكين زرع عضويات الكلى في اليوم 7 + 12 من التمايز في أجنة الدجاج في اليوم 4 من الحضانة. أيام الحضانة: اليوم 0: يتم وضع بيض الدجاج المخصب أفقيا على حاملات (الخطوة 2.1.1) ، والتي يتم وضعها في حاضنة عند 38 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية (خطوة البروتوكول 2.1.2). اليوم الثالث: يتم إنشاء نافذة في كل بيضة عن طريق عمل ثقب صغير في الجانب المواجه لأعلى من البيضة مع الطرف الحاد لزوج من مقص التشريح المنحني (الخطوة 2.2.3) وقطع نافذة دائرية تبدأ من هذه الفتحة (الخطوة 2.2.4). النافذة مغلقة بشريط شفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة. يوم 4: يتم إجراء زرع Intracelomic من عضويات الكلى في اليوم 7 + 12 من التمايز. الجنين في HH 23-24 وملقى على جانبه الأيسر ، وجانبه الأيمن يواجه المشاهد (الخطوة 3.1.3). بين الجناح وبرعم الساق ، يتم عمل فتحة في غشاء vitelline ، المشيم ، والسلى للوصول إلى التجويف celomic ، ويتم إدخال العضو العضوي من خلال هذه الفتحات في celom. بعد الزرع ، يكون العضو العضوي مرئيا كهيكل أبيض يقع خلف برعم الجناح مباشرة. تظهر حواف أغشية vitelline و amnion المفتوحة (الخطوتان 3.2.3 و 3.2.3-Zoom). في بعض الحالات ، يتم تدوير الأجنة ، مستلقية على جانبها الأيمن بدلا من الجانب الأيسر (3.1.3 NOTE) ، ويجب قلبها قبل الزرع. يوم 12: يتم حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت عن طريق الوريد. تتميز الأوردة عن الشرايين بلونها. الدم في الأوردة غني بالأكسجين ، قادم من الطب التكميلي والبديل ، لذا فهو أحمر أكثر إشراقا قليلا من الشرايين القادمة من الجنين (الخطوات 4.2.2 ، 4.2.2-Zoom ، و 4.2.3.). يتم التضحية بالجنين واسترداد العضو العضوي. أصبح العضو العضوي (المحاط بدائرة) مرتبطا بكبد الدجاج ويبدو أنه وعائي (الخطوة 5.2.3). شريط المقياس = 1 مم. تمت إعادة طباعة الصورة التخطيطية التي تصور صورة الزرع داخل المخ في اللوحة العلوية بإذن من Koning et al.28. (ب) صورة لنظام الحقن المجمع، الذي يتكون من قطعة فم، وقطعتين من أنبوب سيليكون طوله 38 سم، ومرشح 0.2 ميكرومتر، وموصل، وإبرة حقن مجهرية زجاجية تم إنشاؤها عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية الدقيقة في مجتذب ماصة دقيقة. الاختصارات: أ = ألانتويس. صباحا = السلى. ج = سيلوم. CC = قطع غشاء المشيمية. شير = شير 99021; FGF9 = عامل نمو الخلايا الليفية 9 ؛ hiPSCs = الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ؛ IM = الأديم المتوسط المتوسط. رطل = برعم الساق ؛ O = عضوي ؛ PS = خط بدائي ؛ U = الحلقة السرية. V = غشاء فيتيلين ؛ Wb = برعم الجناح ؛ Y = ساق صفار البيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عضويات الكلى المزروعة الوعائية. أ: صور التألق المناعي ل (I) عضو كلى غير مزروع و (II) عضو كلى مزروع. في كلتا الحالتين ، تكون الهياكل الكبيبية (NPHS1 + ، سماوي) والأنبوبية (LTL + ، صفراء) مرئية. في الكائنات العضوية غير المزروعة ، توجد بعض ECs البشرية (CD31 + ، خضراء). في العضو العضوي المزروع ، تظهر شبكة الأوعية الدموية المثقوبة (CD31 + ، خضراء ؛ LCA + المحقونة بالرودامين ، بيضاء) في جميع أنحاء العضو العضوي. في اللوحات III و IV و V ، يتم عرض تكبير المناطق المعبأة في اللوحة II ، لتوضيح الأنواع الثلاثة من ECs التي يمكن تمييزها في الكائنات العضوية المزروعة. تحتوي اللوحة الثالثة على ECs بشرية مثقوبة (CD31 + ، LCA +) ، مميزة برؤوس السهام. تحتوي اللوحة الرابعة على ECs بشرية غير مطبقة (CD31 + ، LCA-) ، مميزة برؤوس الأسهم. تحتوي اللوحة V على ECs المشتقة من الدجاج (CD31- ، LCA +) ، المميزة برؤوس الأسهم. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (B) في الكائنات العضوية غير المزروعة (I) ، تحيط ECs (CD31 + ، الخضراء) بالهياكل الكبيبية (NPHS1 + ، سماوي) ولكنها لا تغزوها. في الكائنات العضوية المزروعة (II) ، يتم توعية الهياكل الكبيبية (NPHS1 + ، الأزرق) بواسطة الشعيرات الدموية المثقوبة (LCA + ، أبيض. CD31+ ، أخضر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة ، تم عرض بروتوكول للزرع داخل المخ لعضويات الكلى المشتقة من hiPSC في أجنة الدجاج. عند الزرع ، يتم الأوعية الدموية العضوية بواسطة الأوعية الدموية المثقوبة التي تتكون من مزيج من ECs المشتقة من الأعضاء البشرية والمشتقة من الدجاج. تنتشر هذه في جميع أنحاء العضوية وتغزو الهياكل الكبيبية ، مما يتيح التفاعل بين ECs و podocytes. وقد تبين سابقا أن هذا يؤدي إلى تعزيز نضوج الهياكل الكبيبية والأنبوبية العضوية28. عملية الزرع فعالة للغاية ، حيث تستغرق ~ 5 دقائق لكل جنين ، والصيانة الوحيدة التي تتطلبها الأجنة هي إعادة تعبئة منتظمة لحوض المياه في الحاضنة. لذلك فإن هذه الطريقة مناسبة جدا لتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية.
وقد ثبت سابقا الأوعية الدموية ونضج عضويات الكلى من خلال زرع في الفئران18،20. في نماذج الفئران كثيفة العمالة هذه ، تم زرع المواد العضوية لمدة 2 إلى 12 أسبوعا. في تجارب الزرع داخل المخ الموضحة هنا ، اقتصرت مدة الزرع على 8 أيام. هذا يسمح بالتضحية بالأجنة قبل اليوم 13 من الحضانة ، عندما يعتقد أنها تبدأ في الشعور بالألم33,34. نظرا لأن أجنة الدجاج تفقس في اليوم 21 ، يمكن تمديد مدة الزرع إلى 15 يوما ، والتضحية بالأجنة في اليوم 19 لتجنب الفقس. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب استخدام التخدير. على الرغم من مدة الزرع القصيرة نسبيا في هذا النموذج ، إلا أنه يؤدي إلى الأوعية الدموية الواسعة والنضج الكبير للنيفرون العضوي مقارنة بالمواد العضوية في المختبر ، بما في ذلك تكوين GBM بين الخلايا العضوية العضوية و ECs28 الغازية.
عند إجراء تجارب زرع داخل المخ ، من المهم مراعاة أنه ليس كل أجنة الدجاج تتطور بشكل طبيعي وتبقى على قيد الحياة. عادة ، ~ 65٪ من الأجنة الموضوعة في الحاضنة في اليوم 0 تصل إلى نقطة نهاية التجربة. ويرجع ذلك إلى مزيج من النزيف الحاد الناجم عن تلف الأوعية الدموية أثناء الزرع (5٪ -10٪ في أيدينا) والضغط الناجم عن إجراءات النوافذ والزرع. عندما تكون الأجنة في مرحلة مبكرة أو متأخرة عن HH 23-24 ، تصبح عملية الزرع معقدة بسبب المساحة المحدودة والأوعية الدموية الأكثر شمولا ، على التوالي. إذا لم تكن الأجنة في المرحلة الصحيحة في الوقت المتوقع ، فقد يكون ذلك بسبب درجة حرارة الحضانة ، حيث تؤدي درجة الحرارة المرتفعة عموما إلى تطور أسرع.
علاوة على ذلك ، فإن الاحتفاظ بالبيض المخصب في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة قبل الحضانة يؤدي إلى مزيد من التباين في النمو. لتجنب ذلك ، يجب الحفاظ على درجة حرارة الحاضنة مستقرة طوال وبين التجارب ، ويجب أن تبدأ الحضانة في غضون 3 أيام بعد تسليم البيض المخصب. يمكن أن تحدث نسب عالية بشكل غير متوقع من موت الجنين بين الإجراءات بسبب الجفاف. لتجنب ذلك ، من الضروري إضافة قطرتين أو ثلاث قطرات من DPBS +/+ إلى كل بيضة بعد فتحها وبعد الزرع وختم البويضة بعناية فائقة بشريط لاصق ، وتنعيم التجاعيد في الشريط قدر الإمكان. لا ينصح بالجمع بين خطوات النوافذ والزرع لتقليل عدد مرات فتح البويضات ، لأن النوافذ في اليوم 4 تزيد بشكل كبير من موت الجنين. هذا هو نتيجة الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية التي أصبحت في كثير من الأحيان تعلق على قشر البيض في هذه المرحلة.
في الختام ، توفر هذه الطريقة أداة فعالة وقوية للحث على الأوعية الدموية وتعزيز النضج في عضويات الكلى. يمكن استخدامه لدراسة هذه العمليات في أعداد كبيرة من الكائنات العضوية ولديه القدرة على نمذجة أمراض الكلى التي تتطلب مستوى أعلى من النضج مما يمكن الحصول عليه حاليا في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر جورج غالاريس (LUMC ، ليدن ، هولندا) على مساعدته في حقن أجنة الدجاج. نحن نعترف بدعم ساسكيا فان دير وال ماس (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، كوني فان مونستيرين (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، مانون زورموند (LUMC ، ليدن ، هولندا) ، وآن ماري دي غراف (LUMC ، ليدن ، هولندا). M. Koning مدعوم من قبل 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق جامعة ليدن "صندوق البروفيسور ياب دي جراف لينجلينج ويادهانرما" GWF2019-02. يتم دعم هذا العمل من قبل شركاء الطب التجديدي عبر الحدود (RegMedXB) و Health Holland ، أعلى قطاع علوم الحياة والصحة. يتم دعم C.W. van den Berg و T.J. Rabelink من قبل مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية (reNEW) ، ويتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية من خلال منح مؤسسة نوفو نورديسك (NNF21CC0073729).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E.
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E.
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
