Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til transplantation af nyreorganoider i det celomiske hulrum af kyllingembryoner. Denne metode inducerer vaskularisering og forbedret modning af organoiderne inden for 8 dage og kan bruges til at studere disse processer på en effektiv måde.
Abstract
Nyreorganoider afledt af humane inducerede pluripotente stamceller indeholder nefronlignende strukturer, der til en vis grad ligner dem i den voksne nyre. Desværre hæmmes deres kliniske anvendelighed af manglen på en funktionel vaskulatur og følgelig begrænset modning in vitro. Transplantationen af nyreorganoider i det celomiske hulrum af kyllingembryoner inducerer vaskularisering ved perfunderede blodkar, herunder dannelsen af glomerulære kapillærer, og forbedrer deres modning. Denne teknik er meget effektiv, hvilket giver mulighed for transplantation og analyse af et stort antal organoider. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for intracelomisk transplantation af nyreorganoider i kyllingembryoner efterfulgt af injektion af fluorescerende mærket lektin for at plette den perfunderede vaskulatur og indsamling af transplanterede organoider til billeddannelsesanalyse. Denne metode kan bruges til at inducere og studere organoid vaskularisering og modning for at finde spor til forbedring af disse processer in vitro og forbedre sygdomsmodellering.
Introduction
Human induceret pluripotent stamcelle (hiPSC)-afledte nyreorganoider har vist sig at have potentiale for udviklingsstudier 1,2,3,4, toksicitetsscreening 5,6 og sygdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighed til disse og eventuelle kliniske transplantationsformål begrænset af manglen på et vaskulært netværk. Under embryonal nyreudvikling interagerer podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC'er) for at danne glomerulus indviklede struktur. Uden denne interaktion kan den glomerulære filtreringsbarriere, der består af podocytter, den glomerulære kældermembran (GBM) og EC'er, ikke udvikle sig korrekt14,15,16. Selvom nyreorganoider in vitro indeholder nogle EC'er, undlader disse at danne et ordentligt vaskulært netværk og mindskes over tid17. Det er derfor ikke overraskende, at organoiderne forbliver umodne. Transplantation hos mus inducerer vaskularisering og modning af nyreorganoiderne 18,19,20,21. Desværre er dette en arbejdskrævende proces, der er uegnet til analyse af et stort antal organoider.
Kyllingembryoner er blevet brugt til at studere vaskularisering og udvikling i over et århundrede22. De er let tilgængelige, kræver lav vedligeholdelse, mangler et fuldt funktionelt immunsystem og kan udvikle sig normalt efter åbning af æggeskallen23,24,25,26. Transplantationen af organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist sig at føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheden af transplantationen på CAM såvel som niveauet for modning af transplantatet begrænset af CAM-dannelse, hvilket tager indtil embryonal dag 7 at fuldføre. Derfor blev der for nylig udviklet en metode til effektivt at vaskularisere og modne nyreorganoider gennem intracelomisk transplantation i kyllingembryoner28. Det celomiske hulrum af kyllingembryoner har siden 1930'erne været kendt for at være et gunstigt miljø for differentiering af embryonale væv29,30. Det kan tilgås tidligt i embryonal udvikling og giver mulighed for relativt ubegrænset udvidelse af transplantatet i alle retninger.
Dette papir skitserer en protokol til transplantation af hiPSC-afledte nyreorganoider i det celomiske hulrum i dag 4 kyllingembryoner. Denne metode inducerer vaskularisering og forbedret modning af organoiderne inden for 8 dage. Injektion af fluorescerende mærket linse culinaris agglutinin (LCA) inden ofring af embryonerne muliggør visualisering af perfunderede blodkar i organoiderne gennem konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I henhold til nederlandsk lovgivning var godkendelse fra dyrevelfærdsudvalget ikke påkrævet for denne forskning.
1. Forberedelse af hiPSC-afledte nyreorganoider til transplantation
- Differentier hiPSC'er til nyreorganoider ved hjælp af protokollen udviklet af Takasato et al.4,18,31. Kultur organoiderne efter denne protokol om polyestercellekulturindsatser med 0,4 μm porer (cellekulturindsatser) indtil dag 7 + 12 af differentiering. Hver cellekulturindsats indeholder tre organoider.
- Fjern organoiderne fra cellekulturindsatsen.
- Lav et hul i midten af membranen i cellekulturindsatsen med et par dissekerende tang. Brug dissekering saks til at lave tre snit i membranen fra hullet i midten til kanten af cellekulturindsatsen, skære mellem organoiderne. Dette vil resultere i tre stykker membran, hver med en organoid fastgjort, som stadig er forbundet med cellekulturindsatsen ved deres ydre kant.
- Tag fat i et af membranstykkerne tæt på yderkanten med en pincet og riv det løs fra cellekulturindsatsen. Placer membranstykket med den vedhæftede organoid i en petriskål. Tilsæt et par dråber Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) uden calcium og magnesium (DPBS-/-) til organoiden for at undgå dehydrering. Gentag for de to andre organoider.
- Skær organoiderne ved at holde deres membran på plads med tang og skære dem i halve med et barberblad i rustfrit stål med dobbelt kant (en hel organoid er for stor til, at celom kan rumme på dette udviklingsstadium). Skub forsigtigt de to organoide halvdele ud af membranen med en dura dissektor. Kassér membranen og lad organoiderne stå i DPBS-/- indtil transplantation.
BEMÆRK: Forbered maksimalt tre organoider ad gangen til transplantation for at undgå stress for organoiderne før transplantation. Ideelt set forbereder en person organoiderne, mens en anden udfører transplantationen.
2. Forberedelse af kyllingembryoner til transplantation
- Inkubere befrugtede hvide leghorn æg. Start inkubationen af æggene på nyreorganoid differentieringsdag 7 + 8 for at sikre den korrekte timing af transplantationen.
- De befrugtede hvide benhornæg (Gallus domesticus) anbringes vandret på en holder (figur 1A; dag 0), der markerer midten af den opadvendte side med en blyant.
BEMÆRK: Enten specialfremstillede plastholdere eller æggekartoner kan bruges som holdere til at udruge æggene. - Holderen med æggene anbringes i en befugtet inkubator ved 38 ± 1 ºC (figur 1A; dag 0).
- Inkuber æggene i 3 dage, og hold vandbassinet i inkubatoren fyldt.
- De befrugtede hvide benhornæg (Gallus domesticus) anbringes vandret på en holder (figur 1A; dag 0), der markerer midten af den opadvendte side med en blyant.
- Opret et vindue i æggeskallen på dag 3 af inkubation.
- På dag 3 af inkubation skal du placere et lille stykke (~ 1 cm x 0,5 cm) gennemsigtigt tape på den spidse spids af ægget (lille ende). Lav et lille hul i æggeskallen midt på det gennemsigtige bånd ved at banke på det med den skarpe ende af en dissekerende saks.
- Indsæt en 19 G kanyle på en 5 ml sprøjte i hullet i en vinkel på 45°, undgå beskadigelse af blommesækken, og aspirer 2-3 ml albumen fra ægget for at sænke embryoet inde i ægget. Forsegl hullet med et andet stykke (~ 1 cm x 0,5 cm) gennemsigtig tape.
- Placer et stort stykke (~ 5 cm x 5 cm) gennemsigtig tape på den blyantmærkede, opadvendte side af ægget. Lav et hul i æggeskallen midt på det gennemsigtige bånd ved at banke på det med den skarpe ende af en dissekerende saks (figur 1A; dag 3).
- Start fra dette hul, skær et lille cirkulært vindue i æggeskallen ved hjælp af buet dissekerende saks. Se gennem dette vindue for at lokalisere embryoet, og forstør derefter vinduet for at optimere adgangen til embryoet (figur 1A; dag 3).
- Fjern eventuelle store stykker æggeskal, der kan være faldet oven på embryoet ved hjælp af tang. Fjern mindre stykker ved at placere et par dråber DPBS med calcium og magnesium (DPBS+/+) på embryoet med en plastoverførselspipette og derefter aspirere DPBS+/+ med æggeskallen ind i pipetten.
- Tilsæt tre dråber DPBS+/+ suppleret med 0,5% penicillin/streptomycin til ægget ved hjælp af en plastoverførselspipette.
- Luk forsigtigt vinduet med et stort stykke (~ 5 cm x 5 cm) gennemsigtigt tape, inden ægget placeres tilbage i inkubatoren indtil dag 4 af inkubation, når embryoet er i Hamburger-Hamilton fase 23-24 (HH 23-24)32.
BEMÆRK: Forsegling af vinduet er meget vigtigt for at undgå dehydrering og død af embryoet. - Kontroller embryonerne dagligt for levedygtighed ved at se på dem gennem båndet (fjern ikke båndet for at undgå dehydrering). I løbet af disse første inkubationsdage ændres æggeblommens farve fra lys til mat gul ved embryodød. Kassér afdøde embryoner.
- Hold vandbassinet i inkubatoren fyldt.
3. Intracelomisk transplantation på dag 4 af inkubation
- Få adgang til det celomiske hulrum
- Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks.
- Placer ægget under et dissekerende mikroskop på en gummiholder eller æggekarton.
- Kyllingeembryoet er nu i HH 23-24 og ligger på venstre side med højre side vendt mod beskueren (figur 1A; dag 4). Find embryoets højre vinge og benknop, da celom vil være tilgængelig mellem disse to lemmer. I området mellem højre vinge og benknop skabes en åbning fortløbende i vitellinmembranen, korionen og amnion ved at holde dem med to par dissekerende tang og forsigtigt trække dem i modsatte retninger.
BEMÆRK: Vitellinmembranen er den første membran, der opstår efter åbning af ægget, og i nogle tilfælde er den allerede beskadiget efter at have lavet vinduet på dag 3. Hvis embryoet roteres, ligger det på sin højre side med venstre side vendt mod beskueren (figur 1A; dag 4), er det nødvendigt at vende det rundt for at muliggøre transplantation. For at gøre dette skal du lave en stor åbning i vitellinen og chorionmembranen og derefter forsigtigt dreje embryoet rundt ved hjælp af tang. - Kontroller, om der er uhindret adgang til det celomiske hulrum: Tag forsigtigt fat i kanten af kropsvæggen mellem vingen og lemknoppen med et par dissekerende tang og træk den lidt mod beskueren. Det celomiske hulrum skal være tydeligt synligt. Indsæt forsigtigt et stump, men slankt instrument (f.eks. En stump wolframtråd i en mikroskalpelholder) i det celomiske hulrum.
BEMÆRK: Hvis det ikke er muligt at indsætte det stumpe instrument i det celomiske hulrum, betyder det, at en eller flere af membranerne ikke er åbnet korrekt.
- Transplantation
- Placer en halv organoid inde i ægget oven på allantois ved hjælp af en dura dissector.
- Brug dissekerende tang til forsigtigt at tage fat i kanten af kropsvæggen og trække den lidt mod beskueren for at gøre åbningen til celom synlig.
BEMÆRK: Undgå at beskadige blodkarrene i kropsvæggen. - Flyt forsigtigt organoiden mod og gennem åbningen i kropsvæggen ind i celom med en stump wolframtråd i en mikroskalpelholder. Skub organoiden lidt kranielt for at sætte den ind i celom. Det er nu synligt lige bag vingeknoppen (figur 1A; dag 4).
- Tilsæt tre dråber DPBS+/+ til ægget ved hjælp af en plastoverførselspipette.
- Forsegl forsigtigt vinduet med et stort stykke (~ 5 cm x 5 cm) gennemsigtigt tape, inden ægget placeres tilbage i inkubatoren indtil dag 12 af inkubation (8 dage efter transplantation).
- Bliv ved med at kontrollere embryonerne dagligt for levedygtighed ved at se på dem gennem tapen (fjern ikke tapen for at undgå dehydrering). Kassér afdøde embryoner.
BEMÆRK: Når embryonerne og deres chorioallantoiske membraner vokser, bliver de tydeligere synlige gennem båndet. Manglende bevægelse af embryoet og kollapsede eller sparsomme blodkar er et tegn på embryodød. - Kontroller vandbassinet i inkubatoren dagligt og hold det fyldt.
4. Injektion af fluorescerende mærket lectin
- Klargøring til injektion
- Lav mikroinjektionsnåle af glas ved at trække glasmikrokapillærer i en mikropipettetrækker med følgende indstillinger: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Mens du kigger gennem dissekeringsmikroskopet, skal du forsigtigt bryde spidserne af mikroinjektionsnålene ved hjælp af dissekerende tang for at skabe en åbning.
BEMÆRK: De nødvendige indstillinger for mikropipetteaftrækkeren kan variere afhængigt af maskinen. - Saml injektionssystemet. Tag to stykker 38 cm silikoneslanger og tilslut dem til hinanden ved at placere et 0,2 μm filter mellem dem. Indsæt et mundstykke i enden af røret, der er forbundet med filterudløbet (silikonerør 1), og et stik til enden af røret, der er forbundet med filterindløbet (silikonerør 2). Til sidst indsættes mikroinjektionskanylen i konnektoren (figur 1B).
- Fortynd fluorescerende mærket linse culinaris agglutinin (LCA) med DPBS-/ - til en koncentration på 2,5 mg ml-1 i et 0,5 ml rør og drej ned i ~30 s i en mikrocentrifuge for at flytte aggregaterne til bunden af røret.
- Der pipetteres 20 μL LCA på et stykke parafilm.
- De 20 μL LCA suges fra parafilmen ind i mikrokapillærnålen i det samlede injektionssystem.
- Lav mikroinjektionsnåle af glas ved at trække glasmikrokapillærer i en mikropipettetrækker med følgende indstillinger: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Mens du kigger gennem dissekeringsmikroskopet, skal du forsigtigt bryde spidserne af mikroinjektionsnålene ved hjælp af dissekerende tang for at skabe en åbning.
- Injektion
- Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Placer ægget under et dissekerende mikroskop i en gummiholder.
- Evaluer vaskulaturen og find venerne, som kan skelnes fra arterierne ved deres lidt lysere røde farve (figur 1A; dag 12). For at forbedre adgangen til vaskulaturen skal du forsigtigt forstørre vinduet ved at skære med buet dissekerende saks. Vælg en vene til injektion baseret på tilgængelighed og størrelse.
- Indsæt spidsen af mikrokapillærnålen i den valgte vene i en vinkel på 0°-20º. Sørg for, at nålen er i venen ved forsigtigt at bevæge spidsen fra side til side. Blæs forsigtigt og støt ind i injektionssystemet for at injicere LCA (figur 1A; dag 12).
BEMÆRK: Hvis nålen i venen er i den rigtige position, skal den forblive inden for venens grænser. - Sæt ægget tilbage i inkubatoren i 10 minutter for at lade LCA cirkulere.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at forsegle ægget med tape i løbet af denne tid.
5. Indsamling af transplanterede organoider på dag 12 af inkubation
- Ofre kyllingembryoet
- Læg ægget i en gummiholder på bænken. Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Skær derefter gennem membranerne, der omgiver embryoet, med buet dissekerende saks.
BEMÆRK: Et dissekeringsmikroskop er ikke påkrævet til dette trin. - Hæld embryoet op fra ægget med en perforeret ske og halshug straks embryoet ved hjælp af en saks. Placer embryoets krop i en petriskål under dissektionsmikroskopet.
- Læg ægget i en gummiholder på bænken. Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Skær derefter gennem membranerne, der omgiver embryoet, med buet dissekerende saks.
- Lokalisering og indsamling af organoider
- Placer embryoet på ryggen i petriskålen og spred dets lemmer.
- Åbn forsigtigt embryoets abdominalvæg langs længdeaksen ved hjælp af tang.
- Find organoid inde i embryoet. Organoid bliver oftest fastgjort til højre leverlap, enten ved den kaudale spids eller kranialt lige under brystkassen (figur 1A; dag 12). Det anbefales derfor at starte med at kigge disse steder.
- Når organoiden er placeret, fjern den fra embryoet ved at skære rundt om den med mikrosaks. Placer organoiden og kyllingevævet, der uundgåeligt er fastgjort til det, i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Fjern så meget kyllingevæv som muligt med et barberblad i rustfrit stål med dobbelt kant.
- Behandl organoiden afhængigt af den ønskede analyse.
6. Helmonteret immunofluorescensfarvning
- En transplanteret organoid anbringes i en plade med 24 huller, og der fastgøres 4% paraformaldehyd (PFA) i 500 μL ved 4 °C i 24 timer. Vask 3x med DPBS-/-.
- Permeabilize og blokere organoid i 300 μL blokerende opløsning (0,3% Triton-X i DPBS-/- indeholdende 10% æselserum) i 2 timer ved stuetemperatur.
- Forbered den primære antistofblanding: for en organoid, fortynd primære antistoffer NPHS1 (får-α-menneske, fortynding på 1:100), CD31 (mus-α-menneske, fortynding på 1:100) og LTL (biotinkonjugeret, fortynding på 1:300) i 300 μL blokerende opløsning. Antistofblandingen tilsættes organoiden og inkuberes i 72 timer ved 4 °C.
- Vask 3x med 0,3% TritonX i DPBS/-.
- Forbered den sekundære antistofblanding: For en organoid fortyndes sekundære antistoffer æsel-α-får Alexa Fluor 647 (fortynding på 1:500), æsel-α-mus Alexa Fluor 488 (fortynding på 1:500) og streptavidin Alexa Fluor 405 (fortynding på 1:200) i 300 μL blokeringsopløsning. Tilsæt den sekundære antistofblanding til organoiden og inkuber i 2-4 timer ved stuetemperatur. Dæk med aluminiumsfolie for at undgå eksponering af de sekundære antistoffer for lys.
- Vask 3x med DPBS-/-.
- Integrer organoiden i ~ 30 μL monteringsmedium i en 35 mm glasbundskål og lad den tørre natten over ved stuetemperatur, dækket med aluminiumsfolie. Opbevares ved 4 °C.
- Billede ved hjælp af et konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden og tidslinjen for differentiering af hiPSC'er til nyreorganoider, inkubation af befrugtede kyllingæg, transplantation af nyreorganoider, injektion af LCA og indsamling af organoiderne er opsummeret i figur 1A. Det er vigtigt at koordinere tidspunktet for organoid differentiering og kyllingæg inkubation, begyndende differentiering 15 dage før inkubation. Handlingerne på dag 0, 3, 4 og 12 af inkubation er illustreret med fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteres på dag 7 + 12 af differentiering i dag 4 (HH 23-24) kyllingembryoner. LCA injiceres i embryoets venøse system 8 dage efter transplantation for at plette den perfunderede vaskulatur, før embryoet ofres og organoiden hentes. Det samlede indsprøjtningssystem er vist i figur 1B.
Kyllingembryoner ofres på dag 12 af inkubation (figur 1A). Ved omhyggelig dissektion af embryoet kan den transplanterede organoid normalt findes fastgjort til leveren. Når man ser gennem et dissektionsmikroskop, ser det ud til at være vaskulariseret (figur 1A; dag 12; trin 5.2.3). Konfokal billeddannelse af transplanterede organoider injiceret med LCA og farvet til nefronstrukturer og humane EC'er bekræfter vaskularisering af perfunderede blodkar (figur 2A), som også invaderer glomerulære strukturer (figur 2B). Vaskulaturen er kimær: perfunderede humane EC'er (CD31+, LCA+), ikke-perfunderede humane EC'er (CD31+, LCA-) og perfunderede kyllingeafledte EC'er (CD31-, LCA+) kan skelnes (figur 2A, panel III, IV, V).
Figur 1: Intracelomisk transplantationsmetode . (A) Tidslinje for differentieringen af hiPSC'er til nyreorganoider, inkubation af befrugtede kyllingæg og intracelomisk transplantation af nyreorganoider. Differentiering af hiPSC'er til nyreorganoider påbegyndes 15 dage før inkubation af kyllingæg påbegyndes (differentieringsdag 0 = inkubationsdag -15) for at muliggøre transplantation af nyreorganoiderne på dag 7 + 12 af differentiering i kyllingembryoner på dag 4 af inkubation. Inkubationsdage: Dag 0: Befrugtede kyllingæg anbringes vandret på holdere (trin 2.1.1), som anbringes i en inkubator ved 38 ºC ± 1 °C (protokoltrin 2.1.2). Dag 3: Der skabes et vindue i hvert æg ved at lave et lille hul i den opadvendte side af ægget med den skarpe ende af en buet dissekerende saks (trin 2.2.3) og skære et cirkulært vindue ud fra dette hul (trin 2.2.4). Vinduet er forseglet med gennemsigtigt tape, inden ægget placeres tilbage i inkubatoren. Dag 4: Intracelomisk transplantation af nyreorganoider på dag 7 + 12 af differentiering udføres. Embryoet befinder sig i HH 23-24 og ligger på venstre side med højre side vendt mod beskueren (trin 3.1.3). Mellem vingen og benknoppen laves en åbning i vitellinmembranen, chorion og amnion for at få adgang til det celomiske hulrum, og organoiden indsættes gennem disse åbninger i celom. Efter transplantation er organoiden synlig som en hvid struktur placeret lige bag vingeknoppen. Kanterne på de åbnede vitellin- og amnionmembraner er synlige (trin 3.2.3 og 3.2.3-Zoom). I nogle tilfælde roteres embryonerne, ligger på højre side i stedet for venstre side (3.1.3 BEMÆRK) og skal vendes om inden transplantation. Dag 12: Fluorescerende mærket lectin injiceres intravenøst. Vener adskiller sig fra arterier ved deres farve; blodet i venerne er iltrigt, kommer fra CAM, så de er lidt lysere rødt end arterierne, der kommer fra embryoet (trin 4.2.2., 4.2.2-Zoom og 4.2.3.). Embryoet ofres og organoiden hentes. Organoid (cirklet) er blevet knyttet til kyllingeleveren og synes at være vaskulariseret (trin 5.2.3). Vægtstang = 1 mm. Det skematiske billede, der viser det intracelomiske transplantationsbillede i toppanelet, blev genoptrykt med tilladelse fra Koning et al.28. (B) Billede af det samlede injektionssystem, bestående af et mundstykke, to stykker 38 cm silikonerør, et 0,2 μm filter, et stik og en mikroinjektionsnål af glas, der blev genereret ved at trække glasmikrokapillærer i en mikropipetteaftrækker. Forkortelser: A = allantois; Am = amnion; C = celom; CC = skåret chorionmembran; CHIR = CHIR99021; FGF9 = fibroblastvækstfaktor 9; hiPSC'er = humant inducerede pluripotente stamceller IM = mellemliggende mesoderm; Lb = benknop; O = organoid; PS = primitiv stribe; U = navlestreng; V = vitellinmembran; Wb = vingeknop; Y = æggeblomme stilk. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vaskulariserede transplanterede nyreorganoider . (A) Immunofluorescerende billeder af (I) en utransplanteret nyreorganoid og (II) en transplanteret nyreorganoid. Under begge forhold er glomerulære (NPHS1+, cyan) og rørformede (LTL+, gule) strukturer synlige. I de utransplanterede organoider er nogle humane EC'er (CD31+, grøn) til stede. I den transplanterede organoid er et perfuseret vaskulært netværk (CD31+, grøn; injiceret rhodamin mærket LCA +, hvid) synlig i hele organoiden. I panel III, IV og V vises forstørrelser af de indrammede områder i panel II for at demonstrere de tre typer EC'er, der kan skelnes i transplanterede organoider. Panel III indeholder perfunderede humane EC'er (CD31+, LCA+), markeret med pilespidser. Panel IV indeholder uperfuserede humane EC'er (CD31+, LCA-), mærket med pilespidser. Panel V indeholder perfunderede kyllingeafledte EC'er (CD31-, LCA+), markeret med pilespidser. Skalabjælke = 200 μm. (B) I utransplanterede organoider (I) omgiver EC'er (CD31+, grøn) glomerulære strukturer (NPHS1+, cyan), men invaderer dem ikke. I transplanterede organoider (II) vaskulariseres glomerulære strukturer (NPHS1+, blå) af perfunderede kapillærer (LCA+, hvid; CD31+, grøn). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript demonstreres en protokol for intracelomisk transplantation af hiPSC-afledte nyreorganoider i kyllingembryoner. Ved transplantation vaskulariseres organoider af perfunderede blodkar, der består af en kombination af humane organoidafledte og kyllingafledte EC'er. Disse spredes gennem organoiden og invaderer de glomerulære strukturer, hvilket muliggør interaktion mellem EC'erne og podocytterne. Det blev tidligere vist, at dette fører til forbedret modning af de organoide glomerulære og rørformede strukturer28. Transplantationen er meget effektiv og tager ~ 5 minutter pr. Embryo, og den eneste vedligeholdelse, som embryonerne kræver, er en regelmæssig genopfyldning af vandbassinet i inkubatoren. Denne metode er derfor meget velegnet til analyse af et stort antal organoider.
Vaskularisering og modning af nyreorganoider er tidligere blevet påvist ved transplantation hos mus18,20. I disse arbejdskrævende musemodeller blev organoider transplanteret i 2 til op til 12 uger. I de intracelomiske transplantationseksperimenter, der er vist her, var transplantationens varighed begrænset til 8 dage. Dette giver mulighed for ofring af embryonerne før dag 13 i inkubationen, når de menes at begynde at opleve smerte33,34. Da kyllingembryoner klækkes på dag 21, kunne transplantationens varighed forlænges til 15 dage og ofre embryonerne på dag 19 for at undgå udklækning. Dette ville dog kræve brug af bedøvelsesmidler. På trods af den relativt korte transplantationsvarighed i denne model inducerer den omfattende vaskularisering og signifikant modning af organoide nefroner sammenlignet med in vitro-organoider, herunder dannelsen af en GBM mellem organoide podocytter og de invaderende EC'er28.
Ved udførelse af intracelomiske transplantationsforsøg er det vigtigt at overveje, at ikke alle kyllingembryoner udvikler sig normalt og overlever. Normalt når ~ 65% af embryonerne placeret i inkubatoren på dag 0 eksperimentets slutpunkt. Dette skyldes en kombination af akut blødning forårsaget af karskader under transplantation (5% -10% i vores hænder) og den stress, der induceres af vindues- og transplantationsprocedurerne. Når embryoner er i et tidligere eller senere stadium end HH 23-24, bliver transplantation kompliceret på grund af henholdsvis begrænset plads og mere omfattende vaskulatur. Hvis embryoner ikke er i det rigtige stadium på det forventede tidspunkt, kan dette skyldes inkubationstemperaturen, da en højere temperatur generelt fører til hurtigere udvikling.
Desuden inducerer opbevaring af befrugtede æg ved stuetemperatur i længere tid før inkubation mere variation i udviklingen. For at undgå dette skal inkubatorens temperatur holdes stabil under og mellem forsøgene, og inkubationen skal påbegyndes inden for 3 dage efter levering af de befrugtede æg. Uventet høje procentdele af embryodød mellem procedurer kan skyldes dehydrering. For at undgå dette er det vigtigt at tilføje to eller tre dråber DPBS +/+ til hvert æg efter åbning og efter transplantation og forsegle ægget meget omhyggeligt med tape og udjævne folder i båndet så meget som muligt. Det anbefales ikke at kombinere vindues- og transplantationstrinnene for at reducere antallet af gange, æggene åbnes, da vinduer på dag 4 øger embryodøden betydeligt. Dette er resultatet af skader på blodkar, der ofte er blevet fastgjort til æggeskallen på dette stadium.
Afslutningsvis giver denne metode et effektivt og kraftfuldt værktøj til at fremkalde vaskularisering og forbedre modning i nyreorganoider. Det kan bruges til at studere disse processer i et stort antal organoider og har potentiale til modellering af nyresygdomme, der kræver et højere modningsniveau end i øjeblikket kan erhverves in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Holland) for hans hjælp med injektion af kyllingeembryoner. Vi anerkender støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institut for Anatomi & Embryologi, LUMC, Leiden, Holland), Conny van Munsteren (Institut for Anatomi & Embryologi, LUMC, Leiden, Holland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holland). M. Koning støttes af »Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC«. Dette arbejde blev delvist støttet af Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Dette arbejde støttes af partnerne i Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink er støttet af The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Cell Medicine er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillinger (NNF21CC0073729).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E.
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E.
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
