Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kontraktile målinger med høy gjennomstrømning av hydrogel-innebygde intakte musemuskelfibre ved bruk av et optikkbasert system

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65103
Automatic Translation
*1, *1, 1,4, 1,2,3
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Heart Failures and Arrhythmias, Amsterdam UMC, 3Amsterdam Movement Sciences, Tissue Function and Regeneration, Amsterdam UMC, 4Discipline of Child and Adolescent Health, Faculty of Health and Medicine, University of Sydney
* These authors contributed equally

Summary

Skjelettmuskulaturfunksjonen kan vurderes ved å kvantifisere kontraktiliteten til isolerte muskelfibre, tradisjonelt ved hjelp av arbeidskrevende, lav gjennomstrømningsmetoder. Her beskriver vi en optikkbasert, høy gjennomstrømningsmetode for å kvantifisere kontraktiliteten til hydrogel-innebygde muskelfibre. Denne tilnærmingen har applikasjoner for narkotika screening og terapeutisk utvikling.

Abstract

In vitro cellekultur er et kraftig verktøy for å vurdere cellulære prosesser og teste terapeutiske strategier. For skjelettmuskulatur involverer de vanligste tilnærmingene enten å differensiere myogene stamceller til umodne myorør eller den kortsiktige ex vivo-kulturen av isolerte individuelle muskelfibre. En viktig fordel med ex vivo kultur over in vitro er bevaring av den komplekse cellulære arkitekturen og kontraktile egenskaper. Her beskriver vi en eksperimentell protokoll for isolering av intakte flexor digitorum brevis muskelfibre fra mus og deres påfølgende ex vivo-kultur . I denne protokollen er muskelfibre innebygd i en fibrinbasert og kjellermembranmatrikshydrogel for å immobilisere fibrene og opprettholde deres kontraktile funksjon. Vi beskriver deretter metoder for å vurdere muskelfiberkontraktilitetsfunksjonen ved hjelp av et optikkbasert, høyt gjennomstrømningskontraktilitetssystem. De innebygde muskelfibrene stimuleres elektrisk for å indusere sammentrekninger, hvoretter deres funksjonelle egenskaper, som sarkomerforkortelse og kontraktil hastighet, vurderes ved hjelp av optikkbasert kvantifisering. Kobling av muskelfiberkultur med dette systemet muliggjør testing av høy gjennomstrømning av effekten av farmakologiske midler på kontraktil funksjon og ex vivo studier av genetiske muskelsykdommer. Endelig kan denne protokollen også tilpasses for å studere dynamiske cellulære prosesser i muskelfibre ved hjelp av levende cellemikroskopi.

Introduction

Fremskritt innen in vitro cellekulturteknikker har åpnet nye muligheter for å studere vevsregenerative evner, patofysiologiske cellulære mekanismer og påfølgende terapeutiske strategier, alt mens du bruker pattedyrvev under velkontrollerte forhold 1,2,3. Bruk av in vitro dyrkningssystemer er godt etablert innenfor muskelforskningsfeltet 4,5. Generelt brukes in vitro-differensierte umodne myorør fra myogene stamceller 2,6,7,8. Selv om det er gjort fremskritt i differensieringsprotokollen for å generere mer modne muskelfibre9, begrenser deres umodenhet fortsatt oversettelsen av funnene til en in vivo-innstilling 1,10. Et sentralt problem i muskelbiologifeltet er manglende evne til in vitro-differensierte myorør å fullt ut epitomisere de komplekse intracellulære strukturer, cellesignaleringsprosesser og ekstracellulære interaksjoner observert i naturlig muskelvev og, viktigere, rekapitulere kontraktile krefter produsert av muskelfibre 1,2,10,11,12 . I tillegg resulterer den ukoordinerte sammentrekningen av myotuber under differensieringsprosessen ofte i spontan løsrivelse fra kulturfatene, noe som gjør kontraktil vurdering av in vitro differensierte myotuber utfordrende og begrenset til kvalitativ eller semi-kvantitativ evaluering 8,11,12,13. Disse begrensningene krever ofte regelmessige in vivo-eksperimenter med dyr, spesielt hvis muskelkontraktilitet er et primært eksperimentelt utfall1.

Et alternativ til dyrkning in vitro-differensierte myorør er ex vivo-kulturen av isolerte modne muskelfibre 1,14. Under ex vivo-kultur blir utviklingsmodent muskelvev skåret ut av kroppen, etterfulgt av enkeltcelleisolasjon for dyrking under laboratorieforhold 1,14. De isolerte modne muskelfibrene opprettholder sine komplekse cellulære strukturer observert i det opprinnelige vevet14,15, og denne metoden åpner muligheten for direkte inngrep, for eksempel genetisk manipulering og medikamentscreening, i et veldefinert og kontrollerbart kulturmiljø. En av de første rapportene om skjelettmuskulaturfiberisolasjon og ex vivo-kultur dateres tilbake til 1930-tallet; Utbyttet av levedyktige fibre fra denne protokollen var imidlertid lavt16. Med kontinuerlig optimalisering av isolasjonsprosedyren og kulturforholdene er det nå mulig å oppnå en betydelig forbedring i mengden levedyktige og funksjonelle muskelfibre 14,15,17,18,19. En slik forbedring i kulturforholdene innebærer å belegge kulturretter med ekstracellulære matriksproteiner for å fremme adherens av de isolerte muskelfibrene på kulturskålen15,18,20. Vanligvis brukes lamininbelegg, siden laminin er et av de mest tallrike elementene i den ekstracellulære matrisen av muskler20,21. Optimaliseringen av isolasjonsprosedyren kombinert med belegget av kulturskålene har gjort det mulig for muskelforskningsfeltet å holde isolerte levedyktige muskelfibre med intakt cellulær arkitektur og kontraktil funksjonalitet i kultur i korte perioder 1,15,18,22.

Den mest konvensjonelle tilnærmingen som brukes innen muskelfeltet for å måle kraft og kontraktile evner, er å montere individuelle muskelfibre mellom en lengdedrivermotor og en krafttransduser23,24. Generelt dissekeres muskelfibrene som brukes til disse motordrevne oppsettene fra enten snap-frosset eller friskt vev, etterfulgt av permeabilisering eller "skinning", som muliggjør ekstern kalsiumaktivering, hvor varierende kalsiumkonsentrasjoner brukes til å indusere muskelfiberkontraksjon24. Selv om denne metoden er gullstandarden for muskelfiberkontraktile målinger, kan bare en enkelt muskelfiber måles om gangen, noe som gjør denne teknikken til en møysommelig og tidkrevende prosedyre25. Videre forstyrrer isolasjons- og skinningsprosedyren til muskelfibrene de forskjellige strukturer som er involvert i eksitasjon-sammentrekningskobling (dvs. kalsiumfrigjøring og påfølgende gjenopptak i sarkoplasmatisk retikulum), og tillater dermed ikke studier av avslapningskinetikk og eventuelle sykdommer som kan påvirke denne prosessen26,27. Et alternativ til det flådde fiberpreparatet bruker mekanisk disseksjon for å isolere intakte muskelfibre, hvor kontraktile krefter kan måles som respons på elektrisk aktivering28; Denne tilnærmingen er imidlertid teknisk utfordrende og svært tidkrevende, noe som resulterer i målinger med lav gjennomstrømning. Til slutt, i både flådde og intakte preparater, blir muskelcellene helt fjernet fra det ekstracellulære miljøet under kontraktile målinger 24, noe som gjør undersøkelsen av effekten av den ekstracellulære matrikssammensetningen / stivheten på muskelfiberkontraksjon umulig24. Som et resultat er det nødvendig med utvikling av alternative metoder for å muliggjøre muskelfiberkontraktilitetsmålinger av isolerte intakte muskelfibre på en høy gjennomstrømningsmåte mens man gjenskaper forbindelsen mellom muskelfibre og den ekstracellulære matrisen.

Nylig ble en ny optikkbasert tilnærming for muskelfiberkontraktilitetsmålinger med høy gjennomstrømning utviklet29. Dette optikkbaserte systemet måler periodisiteten til sarkomerer for å vurdere sarkomerlengden under sammentrekning ved hjelp av høyhastighetsbilder. Innenfor dette systemet holder cellene seg på plass i dyrkningsskålen mens optikken beveges, og minimerer dermed tiden som trengs mellom målingene av flere celler29. En stor fordel ved å bruke denne optikkbaserte tilnærmingen med høy gjennomstrømning er at den gjør det mulig å utvikle kulturforhold som ligner på det opprinnelige vevet. En tilnærming som brukes til å etterligne innfødte in vivo-forhold, er å legge inn celler i hydrogeler30. Vanligvis er en hydrogel et viskoelastisk materiale som er i stand til å opprettholde volum og form, og hydrogeler har egenskapene til både faste og flytende materialer31. Den faste delen består av polymerkjeder som er tverrbundet til hverandre, og skaper en struktur som ligner en netto30,31. Materialegenskapene til hydrogeler kan stilles inn for å etterligne matriksavsetningen av muskler30,31. Dermed åpner kombinasjonen av et optikkbasert system med høy gjennomstrømning med celler innebygd i hydrogeler nye muligheter for å vurdere effekten av ekstracellulær matrikssammensetning og mekaniske egenskaper på muskelfiberfunksjonalitet.

Det overordnede målet med denne artikkelen er å 1) beskrive metodikken for enzymatisk isolasjon og ex vivo-kultur av muskelfibre under forhold som etterligner det opprinnelige vevsmiljøet og 2) vurdere muskelfiberkontraktilitet ved hjelp av en høy gjennomstrømningstilnærming. Vi beskriver en detaljert metodikk for enkelt å isolere et stort antall enkeltmuskelfibre fra muskelen flexor digitorum brevis (FDB) ved hjelp av enzymatisk fordøyelse. I tillegg beskriver vi en teknikk for å legge inn de isolerte muskelfibrene i en fibrinbasert hydrogel for å etterligne det opprinnelige miljøet i musklene og forbedre muskelfiberens levedyktighet og kontraktilitet. Vi skisserer deretter en høy gjennomstrømningsmetode for å måle levende muskelfiberkontraksjoner in vitro ved hjelp av dette nylig utviklede systemet. En ekstra fordel med denne innebyggingsprosedyren er immobilisering av fibre under sammentrekning, noe som kan forbedre signal-støy-forholdet mellom disse målingene. Denne gel-embedding-metoden er anvendelig for både enkeltpolymer- og komposittgelinnkapslingsprosedyrer, noe som letter vurderingen av effekten av ekstracellulær matrikssammensetning på muskelfiberkontraktilitet.

Protocol

For ex vivo kontraksjonsstudier ble post mortemvev oppnådd fra dyr ofret for andre godkjente forskningsprosjekter og / eller avlsoverskudd ved VU-universitetet i samsvar med EUs rådsdirektiv (2010/63 / EU) med tillatelse fra dyreforsøksloven i Nederland.

1. Materiell forberedelse

  1. Forbered pipetter for triturering (oppbevares i 70% etanol i et strømningsskap til bruk). Klipp endene av to P1,000-spisser for å lage forskjellige hullstørrelser; Sørg for at hullet er akkurat stort nok til at muskelen kan passere gjennom uten å blokkere pipeten. Kjør de kuttede endene gjennom en flamme slik at de blir glatte.
  2. Forbered Sylgard-retter som beskrevet andre steder32, og steriliser med 70% etanol på forhånd for bruk til å sikre pote og muskel under isolasjon.
    MERK: Sylgard-retter kan gjenbrukes etter grundig rengjøring med avionisert vann og 70% etanol.
  3. Tilbered følgende oppløsninger før isolasjonsprosedyren: disseksjonsmedium, fibrinkulturmedium og muskelfordøyelsesmedium (se tabell 1).
    MERK: Muskelfordøyelsesmediet skal filtersteriliseres ved hjelp av et 0,22 μm filter. Alle tilberedte løsninger skal tempereres i en standard cellekulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 i minst 30 minutter før bruk.
  4. Etter muskelfordøyelsen, klargjør følgende løsninger for å støpe hydrogelen: celleblanding og matriksblanding (se tabell 2). Kombiner celleblandingen og matriksblandingen i forholdet 1:1 for en endelig fibrinkonsentrasjon på 2,5 mg/ml.
    MERK: Forbered matrisen på is, og bruk forkjølte pipettespisser for å forhindre for tidlig polymerisering av kjellermembranmatrisen. Trombin:fibrinogenforholdet på 1:10 (enheter per mg fibrinogen) som brukes her, er optimalisert for en polymerisasjonstid på 30 minutter. Hvis gelen polymeriseres innen 30 minutter, bør en lavere trombinkonsentrasjon brukes. Se diskusjonen for mer informasjon.

2. FDB muskel disseksjon

  1. Euthanize musen ved cervical dislokasjon. Desinfiser bakbenet med 70% alkohol.
  2. Klipp av det nedre bakbenet over ankelen. Skjær opp huden på dorsalsiden av foten mot tærne.
    MERK: Klipp av det nedre bakbenet på ankelleddet for å forhindre skade på musklene i underekstremitetene og tibia hvis de trengs senere.
  3. Skrell huden forsiktig mot tærne. Vær forsiktig så du ikke skader muskelen. FDB er den mest overfladiske muskelen på den ventrale siden av foten.
  4. Plasser den dissekerte foten i et Sylgard-fat med 10 ml forvarmet disseksjonsmedium ved 37 °C. Fest foten gjennom huden som fortsatt er festet til tærne, og fest underbenet utover ankelen.
  5. Fjern forsiktig bindevevet på toppen av muskelen. Kutt senen ved hælen, og løft muskelen opp etter senen.
  6. Skjær ved siden av og under muskelen gjennom bindevevet. Fortsett å kutte til tåsenene er utsatt.
  7. Når halvparten av lengden på de tre senene er utsatt, kutt senene, og slipp muskelen fra foten. VALGFRITT: Trim av den fjerde laterale senen og dens muskelfibre.
  8. Rengjør bindevevet av muskelen, og overfør til et rør som inneholder forvarmet disseksjonsmedium.

3. FDB muskel fordøyelse

  1. Forbered muskelfordøyelsesmediet i samsvar med tabell 1.
  2. Overfør FDB-musklene til muskelfordøyelsesmediet ved hjelp av en serologisk pipette. Inkuber i en vevskulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 80 minutter.
    MERK: Denne tiden bør optimaliseres for hver kollagenasebatch. Fordøyelsen er komplett når muskelen begynner å frynse og ser forstørret ut. Se diskusjonen for optimalisering av fordøyelsestiden.
  3. Etter fordøyelsen, overfør muskelen til et 15 ml rør inneholdende 3 ml disseksjonsmedium, og inkuber i 30 minutter før triturering.

4. FDB muskeltriturering og gravitasjonssedimentering

  1. Triturere muskelen ved hjelp av de tidligere forberedte tritureringstipsene (trinn 1.1) ved å pipetere muskelen, fra den største til den minste størrelsen. Hvis dette trinnet tar lengre tid enn 5 minutter, plasser muskelen i inkubatoren i 5 minutter for å la den hvile.
  2. Triturere til muskelfibrene stort sett har kommet av senen og senen kan passere gjennom en P200-spiss. Fjern senene.
  3. Tilsett de dissosierte FDB-fibrene til et 15 ml rør inneholdende 10 ml disseksjonsmedium, og la fibrene slå seg ned i inkubatoren i 20 minutter. Vær oppmerksom på pelleten som dannes.
  4. Valgfritt: Fjern 10 ml medium fra toppen, og gjenta trinn 4.3. Dette trinnet letter fjerning av overflødig rusk og tilhørende mononukleerte celler.

5. Innebygging av FDB-fiber

  1. Fjern forsiktig alt mediet fra toppen av fiberpelleten. Resuspender cellene i 875 μL celleblanding per FDB-muskel (på is).
    MERK: En FDB-muskel gir nok fibre til syv brønner på en 24-brønnsplate. Denne tettheten kan justeres i henhold til eksperimentets behov. Følgende gelvolum (250 μL) er optimalisert for et 24-brønns format, men kan skaleres tilsvarende for andre formater.
  2. Aliquot 125 μL av cellen blandes i enkle mikrosentrifugerør.
  3. En brønn om gangen, tilsett 125 μL matriksblanding til en cellesuspensjonsalikot, og bland ved å pipetere forsiktig opp og ned, unngå dannelse av bobler.
  4. Overfør umiddelbart den endelige blandingen til en brønn.
    MERK: Pass på å pipe blandingen inn i midten av brønnen. Gjenta trinn 5.3 og trinn 5.4 for hver brønn.
  5. Størk gelene i en inkubator i 30-45 min. Etter størkning, legg forsiktig kulturmediet til brønnene.
    MERK: Rask pipettering kan løsne hydrogelen fra brønnen. Fra dette punktet kan fibrene stimuleres og måles. Men etter vår erfaring kan det å la fibrene tilpasse seg kulturforholdene i 24 timer forbedre fiberkontraktiliteten.
  6. For lengre kultur, fyll på kulturmediet med en halv forandring hver 2. For å gjøre dette, fjern halvparten av kulturmediet, og erstatt det med like mye friskt medium.

6. Optikkbaserte kontraktile målinger

  1. Slå på det optikkbaserte kontraktile målesystemet (se materialfortegnelsen), fluorescenslampen, den elektriske cellepaceren og datamaskinen. Sett den elektriske stimulatoren til 1,0 Hz, 10,0 V og en pulsvarighet på 5,00 ms for å stimulere de isolerte muskelfibrene.
  2. Sett platen inn i målesystemet. Koble paceren til tempoinnsatsen, og sett den inn i kulturplaten.
  3. Åpne programmet IonWizard, og åpne en ny fil ved å klikke på File (øverst til venstre på skjermen) | Nytt.
  4. Sjekk om programmet er på riktig eksperiment, Skeletal Sarcomere, ved å klikke på Ny | Samle eksperiment. For å endre eksperimentet, klikk på ønsket eksperiment og trykk på legg til. For skjelettsarkomereksperimentet, bruk følgende innstillinger: Sarc 20x, gjennomsnittlige linjer, enkelt FFT, 250 Hz samplingsfrekvens og en innsamlingstid på 10 s.
    MERK: De eksperimentelle innstillingene bør forberedes før eksperimentet. Innstillingene kan justeres etter behovene til eksperimentet.
  5. Juster temperaturen på målesystemet til 25 °C. Klikk på åpne cellesøker under verktøylinjen, og vent til en ny skjerm dukker opp. Øverst til høyre på denne skjermen velger du platetype og aktive brønner.
    MERK: Målingene utføres ved 25 °C for å redusere sammentrekningshastigheten til de raskt rykende FDB-muskelfibrene, og forhindrer dermed undersampling av kontraktil hendelse.
  6. Få fibrene i fokus ved å justere glidebryteren for fokus. Alternativt kan du bruke W-tasten og S-tasten for denne fokuseringsfunksjonen.
  7. Aktiver pacingen for å starte den elektriske stimuleringen. Vær oppmerksom på at fibrene nå begynner å rykke.
    MERK: Hvis ingen fibre rykker, må du kontrollere at alle ledningene er koblet til og at paceren er helt nedsenket. Hvis det etter dette fortsatt ikke er bevegelse, kan fibrene ikke reagere på grunn av overfordøyelse eller overdreven skade under triturering.
  8. Fokuser måleområdet på enden av en fiber slik at sarkomerene går vertikalt. Pass på at sarkomerene er i fokus. Hvis sarkomerene er i fokus, er en enkelt topp synlig i verktøylinjen. Under sammentrekning vil denne toppen bevege seg til høyre når sarkomeren forkortes.
    MERK: Det lilla måleområdet kan justeres før eksperimentet starter. For å sikre en riktig måling, inkluderer ~ 20 sarkomerer. Hvis denne toppen endrer form under sammentrekning, kan dette tyde på at sarkomeren er skjult eller ute av fokus under sammentrekningen, noe som introduserer støy.
  9. Start eksperimentet ved å klikke på start i verktøylinjen. Trykk på Q-tasten for å starte en måling, og vent til programmet måler 10 kontraksjonstransienter. Hvis mer enn fire transienter ser støyfrie ut, godtar du målingen ved å trykke på Z-tasten . Hvis transientene har for mye støy, avviser du målingen ved å trykke på X-tasten .
  10. Mål mellom 10 fibre og 20 fibre per tilstand. Plasseringen av de tidligere målte fibrene beholdes.
  11. Valgfritt: Tilsett forbindelser, hvoretter fibre kan måles på nytt på dette punktet.
  12. Når eksperimentet er ferdig, trykker du på stoppknappen på den nedre verktøylinjen for å lukke cellesøkervinduet. Lagre filen, og start en ny fil.
  13. For å analysere dataene, åpne programmet "Cytosolver desktop". Klikk på importer, og velg filen(e) som skal analyseres.
  14. Etter at programmet er ferdig med analysen, se etter blå, røde og grå topper. De blå toppene er transienter som er akseptert av programmet. De røde toppene er transienter som avvises av programmet, og de grå toppene er transienter som avvises av brukeren.
    MERK: Avvisningskriteriene kan justeres i analyseprogramvaren. Generelt forkastes verdier hvis de overskrider en maksimal derivert grense, og transienter forkastes basert på kurvetilpasning R2-verdier på <0,95.
  15. Klikk på eksporter. Merk av i følgende bokser: Gjennomsnittlig forbigående data og eksporter til Excel.
  16. Når du er ferdig, slå av alle maskinene. Ta ut kulturplaten, og kast den. Rengjør pacerelektrodene med avionisert vann og 70% etanol.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen ble enkle FDB-muskelfibre isolert og innebygd i hydrogel. Oversikt over muskeldisseksjonsprosedyren er vist i figur 1. FDB-muskelen eksponeres med intakte sener og skjæres løs fra fascia. Opprettholde senene i musklene som fikseringspunkter minimerer potensiell skade på muskelfibrene under isolasjonsprosedyren. Overflødig bindevev kan trimmes av for å redusere rusk og vekst av sekundære celletyper. Når muskelen har blitt skåret ut og renset tilstrekkelig, blir muskelen enzymatisk fordøyd ved hjelp av kollagenase, og enkeltmuskelfibre frigjøres ved triturering før de isolerte cellene legges inn i hydrogeler. Isoleringen av FDB muskelfibre gir relativt korte muskelfibre, som har fordelen av å bli lett manipulert. På grunn av sin størrelse kan FDB-muskelfibre pipetteres trygt uten flokeindusert skade og er lett innebygd i en hydrogel. Siden enkeltmuskelfibre ikke holder seg veldig godt til kulturplater, sikrer innlemming av fibrene i hydrogel at fibrene forblir satt under cellekulturen og kontraktile målinger. Videre tillater tilsetningen av en kjellermembranmatrise til fibringelen interaksjoner mellom muskelfibrene og matrisen, som etterligner det innfødte in vivo-miljøet . Isolerte enkeltmuskelfibre kan manipuleres og opprettholdes i kultur i flere dager etter isolasjon. I figur 2 er et eksempel på isolerte FDB-fibre innebygd i en hydrogelmatrise vist. De sunne fibrene har synlige sarkomerer og er strukket ut rett (blå pil), mens de buede fibrene vanligvis er skadet eller ikke levedyktig (gul pil) og bør utelukkes fra målingene. Hyperkontraherte fibre vises som mørke, oppblåste objekter i matrisen (rød pil). Hvis isolasjonsprosedyren var vellykket, bør andelen sunne fibre være ~ 75%. En større andel av hyperkontraherte fibre indikerer vanligvis skade under isolasjonsprosedyren. Membranen i muskelfibrene kan bli skadet enten ved overfordøyelse av muskelen eller skade på fibrene under triturering. Triturasjonsskader oppstår hovedsakelig hvis muskelen er underfordøyd og dermed ikke kommer fra hverandre lett.

Fiberfunksjonaliteten og levedyktigheten ble vurdert gjennom kontraktile målinger av muskelfibrene ved hjelp av et optikkbasert, kontraktilt målesystem med høy gjennomstrømning. Systemet sender ut flere parametere, for eksempel sarkomerlengde, prosentandel sarkomerforkortelse, kontraktilhastighet og avslapningshastighet. Ved hjelp av kontraktilt målesystem kan sarkomerkontraksjon måles per muskelfiber. Figur 3 viser eksempler på muskelfiberkontraksjoner målt med målesystemet. Fra en enkelt kontraksjonsforbigående oppnås følgende parametere: sarkomerlengde ved baseline, kontraksjonsvarighet, sarkomerlengde ved maksimal sammentrekning og relaksasjonsvarighet (figur 3A). Disse parametrene brukes til å beregne prosentandelen sarkomerforkortelse, sammentrekning og avslapningshastigheter. Gjennomsnittlige hastighetsverdier kan også beregnes ut fra varighets- og absolutte forkortingsverdier, om nødvendig. Et gyldig kontraksjonsmål har en rett grunnlinje, etterfulgt av en dukkert til toppen og en retur til grunnlinjen (figur 3A). Støy, ufokuserte sarkomerer eller avvikende bevegelse av fiberen kan påvirke måletransienten (figur 3B,C), og disse målingene kan kasseres manuelt eller vil bli avvist av analyseprogrammet. I denne tilnærmingen er den klare visualiseringen av sarkomerene viktig for å måle sammentrekningene; Dermed kan alt som reduserer sarkomerenes synlighet introdusere støy. Dette kan skje hvis det er bevegelse av sarkomeren utenfor fokalplanet under sammentrekning. Målinger der en serie sammentrekninger varierer i hastighet eller dybde, bør også utelukkes fra datasettet.

De kontraktile dataene for enkeltmuskelfibre oppnådd med dette systemet kan brukes til å sammenligne forskjellige kulturforhold. Systemets effektivitet er illustrert i figur 4. Her målte vi sammentrekningene av FDB muskelfibre i både 2D (lamininbelagte kulturplater) og 3D (fibrinhydrogel) kulturformater. En høyere prosentandel av brukbare målinger ble oppnådd i 3D, da innebygging av fibrene i gelen forhindret lateral bevegelse og andre bevegelsesartefakter fra å påvirke målingen (figur 4A). Innebygging av fibrene hadde ingen signifikant effekt på verken sarkomerforkortelse eller maksimal sammentrekningshastighetsverdi sammenlignet med 2D-dyrkede fibre (figur 4B). For å illustrere hvordan ulike matriser påvirker sammentrekningen av FDB-muskelfibre, sammenlignet vi også denne fibrinhydrogelen med en ren kjellermembranmatrise (4 mg/ml) (figur 4C). Den reduserte kontraktiliteten observert i den rene kjellermembranmatrisen skyldtes sannsynligvis gelens stivhet eller økte cellematriseinteraksjoner. Fibrinkonsentrasjoner på opptil 7 mg/ml er også testet, uten signifikant effekt på kontraktil hastighet og forkortelse (upubliserte data). Bruken av denne fibrinbaserte hydrogelen sikrer minimal interferens med kontraktile parametere.

Figure 1
Figur 1 Oversikt over FDB muskeldisseksjonsprosedyre. (A) Bakbenet er kuttet over ankelen (rød stiplet linje), og (B) huden fjernes ved å kutte langs toppen av foten langs den blå stiplede linjen. (C) Foten festes gjennom ankelen og huden ved tærne. (D) Mikroskopisk visning av den eksponerte muskelen og dens omkringliggende bindevev. Fascia er synlig som et hvitt ugjennomsiktig lag gjennom hvilket vaskulaturen løper. (E) Fascia fjernes fra muskelen, og senen kuttes langs den rødstiplede linjen. (F) FDB-muskelen skilles fra det underliggende vevet ved å løfte og kutte under og langs muskelen. (G) Når tærnes sener er godt synlige, skjæres FDB løs langs den rødstiplede linjen. (H) FDB er sikret av senene, og den fjerde laterale senen og dens fibre kan fjernes ved å kutte langs den røde stiplede linjen. Overflødig fascia kan nå trimmes av. (I) Etter rengjøring overføres FDB-muskelen til kollagenaseoppløsningen. Skalastenger = (D-I) 2 mm. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopisk bilde av FDB muskelfibre innebygd i hydrogel etter 24 timers kultur. Blå pil: Eksempel på en levedyktig FDB muskelfiber. Gul pil: Eksempel på en vridd FDB muskelfiber. Vridde muskelfibre kan ha redusert levedyktighet og svekkede sammentrekninger og bør derfor utelukkes fra målingene. Rød pil: Eksempel på en hyperkontrahert FDB muskelfiber. Overdreven hyperkontraksjon oppstår når triturering utføres for kraftig eller kan skyldes overfordøyelse av kollagenase eller bruk av ikke-likevektskulturmedium. Skala bar = 100 μm. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på fiberkontraksjonstransienter målt ved hjelp av det optikkbaserte, kontraktile systemet med høy gjennomstrømning. (A) Eksempel på en normal sammentrekning forbigående. Denne forbigående er hentet fra sarkomerer omsluttet av den lilla firkanten vist i den nedre verktøylinjen. Transienten består av følgende komponenter: sarkomerlengde ved baseline (grønn), kontraksjonsvarighet (blå), sarkomerlengde ved maksimal sammentrekning (lilla) og relaksasjonsvarighet (rød). Parametere som hastighet og prosentandel av sammentrekning beregnes ut fra disse verdiene. (B) Eksempel på en utilstrekkelig sammentrekning forbigående. Disse målingene skjer når sarkomersignalet ikke fanges opp på grunn av støy (se røde piler). (C) Eksempel på en sammentrekningsforbigående som har en bevegelsesartefakt (se grønne piler). Bevegelsesartefakter oppstår når muskelfibrene beveger seg utenfor fokus under sammentrekningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative data oppnådd ved bruk av det optikkbaserte kontraktile systemet med høy gjennomstrømning ved sammenligning av 2D versus 3D-forhold og forskjellige hydrogeler . (A) Prosentandel av aksepterte og avviste kontraksjonsmålinger funnet av dataanalyseprogrammet i 2D-kultur og i 3D-kultur basert på 30 målinger. (B) Sammenligning av maksimal sammentrekningshastighet i 2D-dyrkede og 3D-dyrkede muskelfibre isolert fra tre mus etter 24 timers kultur. (C) Sammenligning av sarkomerforkortelse i 2D-dyrkede og 3D-dyrkede muskelfibre isolert fra tre mus etter 24 timers kultur. (D) Sammenligning av maksimal sammentrekningshastighet av ren kjellermembranmatrise (Matrigel) -innebygd og fibrinhydrogel-innebygde muskelfibre isolert fra tre mus etter 24 timers kultur. (E) Sammenligning av sarkomerforkortelse av ren kjellermembranmatrise (Matrigel) -innebygd og fibrinhydrogel-innebygde muskelfibre isolert fra tre mus etter 24 timers kultur. Dataene ble analysert med en Student t-test og vises som gjennomsnitt ± SD. Hvert datapunkt er en muskelfiber. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av disseksjonsmediet som brukes til å dissekere muskelen, fibrinkulturmediet som brukes til dyrkning av de isolerte muskelfibrene og muskelfordøyelsesmediet som brukes til enzymatisk å fordøye de isolerte musklene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Sammensetning av celleblandingen som brukes til å støpe hydrogelene og matriksblandingen som brukes til å støpe hydrogelene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for å utføre enzymatisk isolasjon og kultur av FDB-muskelfibre i et 3D-kulturformat, etterfulgt av kontraktile målinger ved hjelp av et optikkbasert kontraktilt målesystem. Denne protokollen har en rekke fordeler, inkludert 1) rett frem og rettidig isolasjon av mange intakte muskelfibre fra en enkelt muskel; 2) innebygging av muskelfibrene i en justerbar hydrogelmatrise; 3) ytelsen til kontraktilitetsmålinger med høy gjennomstrømning ved bruk av det optikkbaserte systemet; og 4) evnen til å gjennomføre gjentatte målinger av de samme muskelfibrene etter en intervensjon. Isoleringen av enkeltlevende muskelfibre gir modne muskelceller som beholder sin kontraktile funksjon. Siden muskelfibrene hentet fra musens FDB er relativt små, blir de lett manipulert under isolasjon og opprettholder sin rette form, noe som muliggjør nedstrøms kontraktile målinger. Selv om systemet primært ble utviklet for å studere kardiomyocyttkontraksjon, inneholder skjelettmuskelfibre det samme kontraktile maskineriet med lett gjenkjennelig sarkomermønster og kan dermed også måles ved hjelp av dette systemet29. Koblingen av encellede kontraktile målinger med live ex vivo muskelfiberkultur er et kraftig verktøy for å vurdere moden muskelfiberhelse og funksjon som respons på elektrisk aktivering.

En begrensning ved bruk av dissosierte muskelfibre er mangelen på ytre krefter (dvs. passiv strekk) påført fibrene, noe som resulterer i lavere hvilesarkomerlengder sammenlignet med de som finnes in vivo. Selv om en sarkomerlengde på 2,4-2,5 μm sikrer optimal kraftproduksjon, kan hvilesarkomerlengden variere sterkt33. Mens in vivo hvilende sarkomerlengde av FDB ennå ikke er beskrevet, antyder våre egne upubliserte data en gjennomsnittlig lengde på 2,2 μm. De nåværende resultatene viser en gjennomsnittlig hvilende sarkomerlengde på ~ 1,95 μm i ubelastede FDB-fibre etter 24 timer i kultur (figur 3). Selv om denne lavere hvilende sarkomerlengden vil resultere i lavere kraftproduksjon, bør en lengde på ~ 1,95 μm fortsatt produsere >90% av maksimal kraft34. Som sådan bør disse sarkomerlengdene være tilstrekkelige til å bestemme forskjeller i fiberfunksjon mellom forskjellige genetiske modeller eller etter medikamentelle behandlinger. I tillegg gir innebygging av fibre i en hydrogel mange ekstra punkter for vedheft sammenlignet med frittflytende 2D-dyrkede fibre, noe som vil begrense ytterligere sarkomerforkortelse over tid.

En fordel med denne muskelfiberisolasjonsprotokollen er bruken av en lett dissekert hurtigtrekksmuskel som består av relativt små muskelfibre sammenlignet med andre muskler, for eksempel extensor digitorum longus (EDL). Deres mindre størrelse gjør muskelisolasjonen mer egnet for triturasjonsbasert separasjon, og reduserer dermed sjansen for pipet- eller flokeindusert skade på muskelfibrene. Den ekstracellulære matrisen av FDB-muskler kan lett enzymatisk fordøyes med kollagenase, noe som muliggjør isolering av hundrevis av muskelfibre på kort tid. Imidlertid kan overfordøyelse føre til skade på muskelfibrene. Overfordøyelsen av muskelfibrene kan gjenkjennes når muskelen faller fra hverandre nesten umiddelbart når du triturerer muskelen eller når en stor del av cellevolumet er hyperkontrahert under cellesåingsprosedyren. For å forhindre overfordøyelse av muskelen, må fordøyelsestiden optimaliseres for hver kollagenasebatch. For å teste dette, bør to FDB-muskler fordøyes parallelt med en forskjøvet fordøyelsestid på 5 minutter mellom dem. Fordøyelsestiden med høyest utbytte av levedyktige muskelfibre bør velges. Denne optimaliseringen bør deretter utføres en gang til, igjen med 5 min separasjon i fordøyelsestiden. Fordøyelsestiden som gir de høyeste levedyktige muskelfibrene, bør brukes som optimal fordøyelsestid for den nåværende batchen av kollagenase. En annen måte å begrense batch-til-batch-variabiliteten av kollagenase ville være å direkte beregne aktivitetsenhetene per milliliter stamløsning og deretter rekonstituere de påfølgende kollagenasebatchene til samme mengde. Til slutt kan fordøyelsestidene måtte optimaliseres på tvers av forskjellige musestammer, for eksempel hvis man studerer eldre eller syke dyr som viser økt ekstracellulær matriksavsetning35,36.

Muligheten for pipettering levedyktige, isolerte muskelfibre åpner muligheter for å dyrke FDB muskelfibre i ulike kulturforhold. Et slikt alternativ er dyrking av disse fibrene i hydrogeler for å etterligne det opprinnelige vevskulturmiljøet. Denne innebyggingsprotokollen sikrer at fibrene holder seg på plass under kontraktile målinger og har blitt optimalisert for å la fibrene slå seg til bunnen av platen før gelen stivner. Imidlertid kan det hende at denne protokollen må justeres for å imøtekomme forskjeller i trombin- og fibrinogenbestandene. Hvis trombinaktiviteten er for høy, vil gelen sette seg for tidlig, og fibrene kan holde seg suspendert på høyere steder utenfor mikroskopets fokalplan. Hvis dette skjer, må trombin:fibrinogenforholdet justeres. Dette kan testes ved plating av fibre i stadig lavere trombinkonsentrasjoner og ta hensyn til hvor lang tid polymerisasjonen tar. Vanligvis bør dette ikke skje raskere enn 30 min. Å ha en trombinkonsentrasjon som er for lav, kan imidlertid også svekke polymerisasjonsprosessen. En annen metode for å sikre at fibrene er i riktig fokalplan, er å først frø dem ved hjelp av en 2D-protokoll og deretter legge et lag hydrogel over fibrene etter at de har festet seg til kulturplaten. Imidlertid bør man være oppmerksom på at fjerning av mediet fra fibrene kan indusere hyperkontraksjon, da de er følsomme for uttørking. Det er også uklart om hydrogelen vil feste seg helt til kulturplaten, og det kan løsne lettere. Derfor er denne innebyggingsprosedyren å foretrekke for å holde fibrene levedyktige og på plass for sammentrekningsmålinger.

Bruken av denne protokollen muliggjør studier av kontraktil dynamikk av modne muskelfibre ex vivo og kan brukes på både friske mus og de som bærer genetiske mutasjoner for muskelsykdommer. På samme måte muliggjør det testing av hvordan kulturforhold eller tilsetning av forbindelser påvirker muskelfiberfunksjonen. De kontraktile dataene oppnådd ved bruk av det optikkbaserte systemet gir en indikasjon på kontraktil evne til levende enkeltmuskelfibre, og endringer i denne evnen kan korreleres med fiberhelse. Disse dataene alene er imidlertid ikke tilstrekkelige til å avgjøre om disse endringene forekommer ved aktin-myosin kryssbro eller kalsiumfrigjøringsstadier av muskelkontraksjon. Selv om vi ikke beskriver metoder for å måle kalsiumsignalering i denne protokollen, er dette oppsettet også i stand til å måle Fura-baserte kalsiumtransienter i kontraherende muskelceller29. En ulempe med dette systemet er at FDB-muskelen bare inneholder raske trekk type IIa / IIx muskelfibre, og muskler som inneholder langsomme rykninger type I-fibre av denne størrelsen er ennå ikke beskrevet37. Dette eliminerer muligheten til å studere fibertypespesifikk funksjon ved hjelp av denne metoden. Protokollen vi foreslår her kan potensielt tilpasses for andre muskler som EDL eller soleus for å studere fibertypeforskjeller. På grunn av deres større størrelse, må denne protokollen optimaliseres ytterligere for disse musklene. Lengre fibre har en tendens til å bli sammenflettet under tyngdekraftsedimenteringstrinnet og vil briste hvis de manipuleres ved pipettering, noe som vil føre til lavere utbytte. På grunn av deres inkompatibilitet med pipettering, er lengre fibre derfor også mindre kompatible med gelinnebyggingsteknikken. Målinger av disse fibrene kan fortsatt gjøres i et 2D-kulturformat, men fibrene kan bevege seg mer under sammentrekning på grunn av deres størrelse, og dermed påvirke signal-støy-forholdet. En annen begrensning av dette systemet er manglende evne til å utføre kraftmålinger sammen med kontraktile målinger, for eksempel de kraftmålinger som kan oppnås ved hjelp av andre intakte muskelfiberpreparater28. Imidlertid kan denne begrensningen omgås ved å estimere kraften som genereres av muskelfiberen. Den genererte kraften av muskelfibre kan estimeres dersom muskelfiberformen under kontraherte og avslappede tilstander, samt Youngs modul av matrisen er kjent25. Ikke desto mindre gir dette optikkbaserte systemet en brukervennlig tilnærming med høy gjennomstrømning for å studere muskelkontraktil funksjon og åpner for en rekke nye muligheter for å studere genetiske muskelsykdommer og terapeutiske inngrep.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes og Emmy Manders for deres tekniske ekspertise i å bidra til å utvikle denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av priser fra Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 til TJK), den nederlandske kardiovaskulære alliansen (Talent Grant til TJK) og National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australia; Fellesskap APP1121651 til M.Y).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aprotinin, from Bovine Lung Thermo Scientific AAJ63039MC 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Collagenase type 2 Worthington 77336 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fibrinogen from Bovine Plasma Sigma Aldrich 50-176-5054 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher A1413201 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Gibco MEM High glucose + pyruvate Thermo Fisher 11095080
Horse serum Thermo Fisher H1270
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning CB-40230 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Serum Replacement 2 (50x) Sigma Aldrich S9388
Thrombin, Bovine Plasma Thermo Scientific AAJ63383EXP 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Tranexamic Acid Thermo Scientific AC228042500 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Equipment
24-well electrical stimulator IonOptix N/a
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
MultiCell Cytocypher IonOptix N/a
MyoCam-S3 IonOptix N/a
MyoPacer IonOptix N/a
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent  Dow corning  N/a
Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15002-08
Software
CytoSolver IonOptix N/a
IonWizard IonOptix N/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  2. Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
  3. Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
  4. Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
  5. Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
  6. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
  7. Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
  8. Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
  11. Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
  12. Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
  13. Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
  14. Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
  15. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  16. Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
  17. Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
  18. Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
  19. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  20. Holmberg, J., Durbeej, M. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).
  21. Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
  22. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  23. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  24. Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
  25. Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
  26. de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
  27. Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
  30. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
  31. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).
  33. Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
  34. Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
  35. Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
  36. Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
  37. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).

Tags

Tom verdi utgave 195
Kontraktile målinger med høy gjennomstrømning av hydrogel-innebygde intakte musemuskelfibre ved bruk av et optikkbasert system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vonk, L. A., Esen, O., Yuen, M.,… More

Vonk, L. A., Esen, O., Yuen, M., Kirby, T. J. High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System. J. Vis. Exp. (195), e65103, doi:10.3791/65103 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter