Summary
Функция скелетных мышц может быть оценена путем количественной оценки сократительной способности изолированных мышечных волокон, традиционно используя трудоемкие подходы с низкой пропускной способностью. Здесь мы описываем основанный на оптике высокопроизводительный метод количественной оценки сократительной способности мышечных волокон, встроенных в гидрогель. Этот подход находит применение для скрининга лекарств и терапевтических разработок.
Abstract
Культура клеток in vitro является мощным инструментом для оценки клеточных процессов и тестирования терапевтических стратегий. Для скелетных мышц наиболее распространенные подходы включают либо дифференцировку миогенных клеток-предшественников в незрелые миотубы, либо кратковременную культуру ex vivo изолированных отдельных мышечных волокон. Ключевым преимуществом культуры ex vivo по сравнению с in vitro является сохранение сложной клеточной архитектуры и сократительных характеристик. Здесь мы подробно описываем экспериментальный протокол выделения интактных мышечных волокон flexor digitorum brevis у мышей и их последующей культуры ex vivo . В этом протоколе мышечные волокна встроены в гидрогель на основе фибрина и матричного матричного слоя базальной мембраны для иммобилизации волокон и поддержания их сократительной функции. Затем мы описываем методы оценки сократительной функции мышечных волокон с использованием высокопроизводительной системы сократимости на основе оптики. Встроенные мышечные волокна электрически стимулируются, чтобы вызвать сокращения, после чего их функциональные свойства, такие как укорочение саркомера и скорость сокращения, оцениваются с использованием количественного определения на основе оптики. Объединение культуры мышечных волокон с этой системой позволяет проводить высокопроизводительные испытания влияния фармакологических агентов на сократительную функцию и исследования генетических мышечных нарушений ex vivo . Наконец, этот протокол также может быть адаптирован для изучения динамических клеточных процессов в мышечных волокнах с использованием микроскопии живых клеток.
Introduction
Достижения в методах культивирования клеток in vitro открыли новые возможности для изучения регенеративных возможностей тканей, патофизиологических клеточных механизмов и последующих терапевтических стратегий, и все это при использовании тканей млекопитающих в хорошо контролируемых условиях 1,2,3. Использование систем культивирования in vitro хорошо зарекомендовало себя в области исследований мышц 4,5. В целом, in vitro дифференцированные незрелые миотубы из миогенных клеток-предшественников используются 2,6,7,8. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в протоколе дифференцировки для получения более зрелых мышечных волокон9, их незрелость по-прежнему ограничивает перевод результатов в условия in vivo 1,10. Одной из центральных проблем в области мышечной биологии является неспособность дифференцированных миотуб in vitro полностью олицетворять сложные внутриклеточные структуры, клеточные сигнальные процессы и внеклеточные взаимодействия, наблюдаемые в нативной мышечной ткани, и, что важно, повторять сократительные силы, создаваемые мышечными волокнами 1,2,10,11,12 . Кроме того, нескоординированное сокращение миотуб в процессе дифференцировки часто приводит к спонтанному отрыву от чашки культуры, что затрудняет сократительную оценку дифференцированных миотуб in vitro и ограничивает ее качественной или полуколичественной оценкой 8,11,12,13. Эти ограничения часто требуют регулярных экспериментов in vivo с животными, особенно если сократительная способность мышц является первичным экспериментальным результатом1.
Альтернативой культивированию дифференцированных миотуб in vitro является культура ex vivo изолированных зрелых мышечных волокон 1,14. Во время культивирования ex vivo зрелая мышечная ткань удаляется из организма с последующей изоляцией одной клетки для культивирования в лабораторных условиях 1,14. Изолированные зрелые мышечные волокна сохраняют свои сложные клеточные структуры, наблюдаемые в нативной ткани14,15, и этот метод открывает возможность для прямых вмешательств, таких как генетические манипуляции и скрининг лекарств, в четко определенной и контролируемой среде культуры. Одно из первых сообщений о выделении волокон скелетных мышц и культуре ex vivo датируется 1930-ми годами; Однако выход жизнеспособных волокон из этого протокола был низким16. При постоянной оптимизации процедуры выделения и условий культивирования теперь возможно значительное улучшение количества жизнеспособных и функциональных мышечных волокон 14,15,17,18,19. Одним из таких улучшений условий культивирования является покрытие культуральных чашек белками внеклеточного матрикса для содействия адгезии изолированных мышечных волокон к чашке для культивирования15,18,20. Обычно используется ламининовое покрытие, так как ламинин является одним из наиболее распространенных элементов во внеклеточном матриксе мышц20,21. Оптимизация процедуры выделения в сочетании с покрытием культуральных чашек позволила области исследований мышц сохранить изолированные жизнеспособные мышечные волокна с неповрежденной клеточной архитектурой и сократительной функциональностью в культуре в течение коротких периодов времени 1,15,18,22.
Наиболее традиционный подход, используемый в мышечном поле для измерения силы и сократительных способностей, заключается в установке отдельных мышечных волокон между двигателем драйвера длины и преобразователемсилы 23,24. Как правило, мышечные волокна, используемые для этих установок с моторным приводом, рассекаются либо из замороженной, либо из свежей ткани с последующей пермеабилизацией или «снятием кожи», что обеспечивает внешнюю активацию кальция, где различные концентрации кальция используются для индуцирования сокращениямышечных волокон 24. Хотя этот метод является золотым стандартом для измерения сократительности мышечных волокон, за один раз можно измерить только одно мышечное волокно, что делает этот метод трудоемкой и трудоемкой процедурой25. Кроме того, процедура изоляции и снятия шкуры мышечных волокон нарушает различные структуры, участвующие в связывании возбуждения-сокращения (т. е. высвобождении кальция и последующем обратном захвате в саркоплазматический ретикулум), тем самым не позволяя изучать кинетику релаксации и любые заболевания, которые могут повлиять на этот процесс26,27. Альтернативой препарату очищенных волокон является использование механического рассечения для выделения интактных мышечных волокон, где сократительные силы могут быть измерены в ответ на электрическую активацию28; Однако этот подход является технически сложным и очень трудоемким, что приводит к низкой пропускной способности измерений. Наконец, как в кожевенных, так и в интактных препаратах мышечные клетки полностью удаляются из внеклеточной среды во время сократительных измерений 24, что делает невозможным исследование влияния состава/жесткости внеклеточного матрикса на сокращениемышечных волокон24. В результате необходима разработка альтернативных методов, позволяющих измерять сократимость мышечных волокон изолированных интактных мышечных волокон с высокой пропускной способностью, воссоздавая связь между мышечными волокнами и внеклеточным матриксом.
Недавно был разработан новый оптический подход к высокопроизводительным измерениям сократительной способности мышечных волокон29. Эта система, основанная на оптике, измеряет периодичность саркомеров для оценки длины саркомера во время сокращения с использованием высокоскоростной визуализации. В этой системе клетки остаются на месте в чашке для культивирования, в то время как оптика перемещается, тем самым сводя к минимуму время, необходимое между измерениями нескольких клеток29. Основным преимуществом использования этого высокопроизводительного подхода, основанного на оптике, является то, что он позволяет создавать условия культивирования, аналогичные условиям нативной ткани. Подход, используемый для имитации нативных условий in vivo, заключается во встраивании клеток в гидрогели30. Как правило, гидрогель представляет собой вязкоупругий материал, способный сохранять свой объем и форму, а гидрогели обладают свойствами как твердых, так и жидких материалов31. Твердая часть состоит из полимерных цепей, сшитых друг с другом, создавая структуру, похожую на сетку30,31. Свойства материала гидрогелей могут быть настроены таким образом, чтобы имитировать матричное осаждение мышц30,31. Таким образом, сочетание высокопроизводительной системы на основе оптики с клетками, встроенными в гидрогели, открывает новые возможности для оценки влияния состава внеклеточного матрикса и механических свойств на функциональность мышечных волокон.
Общая цель данной работы состоит в том, чтобы: 1) описать методологию ферментативной изоляции и культивирования мышечных волокон ex vivo в условиях, имитирующих нативную тканевую среду, и 2) оценить сократимость мышечных волокон с использованием высокопроизводительного подхода. Мы описываем подробную методологию, позволяющую легко выделить большое количество одиночных мышечных волокон из мышцы-сгибателя пальцев (FDB) с помощью ферментативного пищеварения. Кроме того, мы описываем технику встраивания изолированных мышечных волокон в гидрогель на основе фибрина с целью имитации нативной среды мышц и улучшения жизнеспособности и сократимости мышечных волокон. Затем мы описываем высокопроизводительный метод измерения сокращений живых мышечных волокон in vitro с использованием этой недавно разработанной системы. Дополнительным преимуществом этой процедуры встраивания является иммобилизация волокон во время сокращения, что может улучшить отношение сигнал/шум этих измерений. Этот метод встраивания геля применим как для процедур инкапсуляции однополимерного, так и для композитного геля, облегчая оценку влияния состава внеклеточного матрикса на сократимость мышечных волокон.
Protocol
Для исследований сокращения ex vivo посмертная ткань была получена от животных, принесенных в жертву для других утвержденных исследовательских проектов и / или племенных излишков Университета VU в соответствии с Директивой Европейского совета (2010/63 / EU) с разрешения Закона об исследованиях животных Нидерландов.
1. Подготовка материала
- Подготовьте пипетки для растирания (храните в 70% этаноле в проточном шкафу до использования). Обрежьте концы двух наконечников P1,000, чтобы создать отверстия разного размера; Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы мышца могла пройти, не блокируя пипетку. Пропустите срезанные концы через пламя, чтобы они стали гладкими.
- Приготовьте блюда Sylgard, как описано в другом месте32, и заранее стерилизуйте 70% этанолом для использования для защиты лапы и мышц во время изоляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посуду Sylgard можно использовать повторно после тщательной очистки деионизированной водой и 70% этанолом. - Перед процедурой выделения готовят следующие растворы: диссекционную среду, фибринную питательную среду и мышечную среду для переваривания (см. Таблицу 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышечная среда для пищеварения должна быть стерилизована фильтром с использованием фильтра 0,22 мкм. Все приготовленные растворы должны быть уравновешены в стандартном инкубаторе клеточных культур при 37 ° C и 5% CO2 в течение не менее 30 мин перед использованием. - После мышечного переваривания приготовьте следующие растворы для отливки гидрогеля: клеточную смесь и матричную смесь (см. Таблицу 2). Смешайте клеточную смесь и матричную смесь в соотношении 1:1 для конечной концентрации фибрина 2,5 мг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте матрицу на льду и используйте предварительно охлажденные наконечники пипеток, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию матрицы базальной мембраны. Используемое здесь соотношение тромбин:фибриноген 1:10 (единицы на мг фибриногена) было оптимизировано для времени полимеризации 30 мин. Если гель полимеризуется в течение 30 мин, следует использовать более низкую концентрацию тромбина. Дополнительные сведения см. в обсуждении.
2. Рассечение мышц FDB
- Усыпить мышь вывихом шейки матки. Продезинфицируйте заднюю конечность 70% спиртом.
- Отрежьте нижнюю часть задней ноги выше лодыжки. Разрежьте кожу на тыльной стороне стопы по направлению к пальцам ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте нижнюю часть задней ноги в голеностопном суставе, чтобы предотвратить повреждение мышц нижних конечностей и большеберцовой кости, если они понадобятся позже. - Осторожно очистите кожу по направлению к пальцам ног. Будьте осторожны, чтобы не повредить мышцу. FDB - это самая поверхностная мышца на вентральной стороне стопы.
- Поместите рассеченную стопу в чашку Sylgard с 10 мл предварительно разогретой диссекционной среды при 37 ° C. Проткните стопу через кожу, которая все еще прикреплена к пальцам ног, и закрепите голень за лодыжкой.
- Аккуратно удалите соединительную ткань поверх мышцы. Перережьте сухожилие на пятке и поднимите мышцу вверх за сухожилие.
- Разрезайте вдоль и под мышцей соединительную ткань. Продолжайте резать, пока не обнажятся сухожилия пальцев ног.
- Когда половина длины трех сухожилий обнажена, разрежьте сухожилия и освободите мышцу стопы. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Обрежьте четвертое боковое сухожилие и его мышечные волокна.
- Очистите соединительную ткань от мышцы и переложите в трубку, содержащую предварительно разогретую среду для рассечения.
3. Пищеварение мышц FDB
- Подготовьте мышечную среду для переваривания в соответствии с таблицей 1.
- Перенесите мышцы FDB в мышечную среду для переваривания с помощью серологической пипетки. Инкубировать в инкубаторе тканевых культур при 37 °C и 5%CO2 в течение 80 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время должно быть оптимизировано для каждой партии коллагеназы. Пищеварение завершается, когда мышца начинает изнашиваться и выглядит увеличенной. Смотрите обсуждение для оптимизации времени пищеварения. - После пищеварения переместите мышцу в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл диссекционной среды, и инкубируйте в течение 30 минут перед растиранием.
4. Растирание мышц FDB и гравитационное осаждение
- Тритуируйте мышцу, используя заранее подготовленные наконечники для растирания (шаг 1.1), пипеткой на мышцу, переходя от самого большого к наименьшему размеру. Если этот шаг занимает больше 5 минут, поместите мышцу в инкубатор на 5 минут, чтобы дать ей отдохнуть.
- Тритурируйте до тех пор, пока мышечные волокна в основном не оторвутся от сухожилия, и сухожилие не сможет пройти через наконечник P200. Удалите сухожилия.
- Добавьте диссоциированные волокна FDB в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл диссекционной среды, и дайте волокнам осесть в инкубаторе в течение 20 минут. Наблюдайте за образовавшимися гранулами.
- Дополнительно: Удалите 10 мл среды сверху и повторите шаг 4.3. Этот этап облегчает удаление лишнего мусора и связанных с ним одноядерных клеток.
5. Встраивание волокна FDB
- Аккуратно удалите всю среду с верхней части волокнистой гранулы. Ресуспендируют клетки в 875 мкл клеточной смеси на мышцу FDB (на льду).
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна мышца FDB дает достаточно волокон для семи лунок 24-луночной пластины. Эту плотность можно регулировать в соответствии с потребностями эксперимента. Следующий объем геля (250 мкл) оптимизирован для 24-луночного формата, но может быть соответствующим образом масштабирован для других форматов. - Аликвот 125 мкл клеток смешивают в отдельные микроцентрифужные пробирки.
- По одной лунке за раз добавляйте 125 мкл матричной смеси в аликвоту клеточной суспензии и перемешивайте, осторожно пипеткой вверх и вниз, избегая образования пузырьков.
- Сразу же переложите готовую смесь в лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно запипейте смесь пипеткой в середину лунки. Повторите шаги 5.3 и 5.4 для каждой скважины. - Затвердевают гели в инкубаторе в течение 30-45 мин. После застывания аккуратно добавьте питательную среду в лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрое пипетирование может отсоединить гидрогель от скважины. С этого момента волокна можно стимулировать и измерять. Однако, по нашему опыту, позволяя волокнам приспосабливаться к условиям культивирования в течение 24 часов, можно улучшить сократимость волокон. - Для более длительного выращивания питательной среды пополняйте питательную среду на полусмену каждые 2 дня. Для этого удаляют половину питательной среды, и заменяют ее равным количеством свежей среды.
6. Сократительные измерения на основе оптики
- Включите систему измерения сократительной способности на основе оптики (см. Таблицу материалов), люминесцентную лампу, электрокардиостимулятор и компьютер. Установите электростимулятор на частоту 1,0 Гц, 10,0 В и длительность импульса 5,00 мс для стимуляции изолированных мышечных волокон.
- Вставьте пластину в измерительную систему. Подсоедините иноходец к вставке для стимуляции и вставьте его в культуральную пластину.
- Откройте программу IonWizard и откройте новый файл, нажав «Файл» (вверху слева экрана) | Новый.
- Проверьте, правильно ли настроена программа на эксперимент Skeletal Sarcomere, нажав « Создать» | Коллекционный эксперимент. Чтобы изменить эксперимент, нажмите на нужный эксперимент и нажмите добавить. Для эксперимента с саркомером скелета примените следующие настройки: Sarc 20x, Средние линии, одиночный БПФ, частота дискретизации 250 Гц и время сбора данных 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные настройки должны быть подготовлены до начала эксперимента. Настройки могут быть скорректированы в соответствии с потребностями эксперимента. - Отрегулируйте температуру измерительной системы до 25 °C. Нажмите « Открыть поиск ячеек» под панелью инструментов и дождитесь появления нового экрана. В правом верхнем углу этого экрана выберите тип плиты и активные скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения проводятся при 25 ° C, чтобы уменьшить скорость сокращения быстро сокращающихся мышечных волокон FDB, тем самым предотвращая недостаточную дискретизацию сократительного события. - Сфокусируйте волокна, отрегулировав ползунок фокусировки. В качестве альтернативы используйте клавиши W и S для этой функции фокусировки.
- Включите стимуляцию, чтобы начать электрическую стимуляцию. Обратите внимание, что волокна теперь начинают подергиваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если волокна не дергаются, убедитесь, что все провода подключены и иноходец полностью погружен в воду. Если после этого по-прежнему нет движения, волокна могут не реагировать из-за чрезмерного переваривания или чрезмерного повреждения во время растирания. - Сфокусируйте область измерения на конце волокна так, чтобы саркомеры проходили вертикально. Убедитесь, что саркомеры находятся в фокусе. Если саркомеры находятся в фокусе, на панели инструментов виден один пик. Во время сокращения этот пик будет смещаться вправо по мере укорачивания саркомера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиолетовая область измерения может быть отрегулирована до начала эксперимента. Чтобы обеспечить правильное измерение, включите ~ 20 саркомеров. Если этот пик меняет форму во время сокращения, это может указывать на то, что саркомер затемнен или не в фокусе во время сокращения, что создает шум. - Запустите эксперимент, нажав кнопку «Пуск » на панели инструментов. Нажмите клавишу Q , чтобы начать измерение, и подождите, пока программа измерит 10 переходных процессов сокращения. Если более четырех переходных процессов выглядят бесшумными, примите измерение, нажав клавишу Z . Если переходные процессы имеют слишком много шума, отклоните измерение, нажав клавишу X .
- Отмерьте от 10 до 20 волокон на условие. Места расположения ранее измеренных волокон сохраняются.
- Дополнительно: Добавьте соединения, после чего волокна могут быть повторно измерены на этом этапе.
- Когда эксперимент будет завершен, нажмите кнопку остановки на нижней панели инструментов, чтобы закрыть окно поиска ячеек. Сохраните файл и запустите новый.
- Для анализа данных откройте программу «Cytosolver desktop». Нажмите « Импорт» и выберите файл (ы) для анализа.
- После того, как программа закончит анализ, ищите синие, красные и серые пики. Синие пики - это переходные процессы, которые принимаются программой. Красные пики — это переходные процессы, которые отклоняются программой, а серые пики — это переходные процессы, отклоняемые пользователем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии отклонения могут быть скорректированы в программном обеспечении для анализа. Как правило, значения отклоняются, если они превышают максимальный предел производной, а переходные процессы отклоняются на основе значений соответствия кривой R2 <0,95. - Нажмите на экспорт. Установите флажки в следующих полях: Усредненные временные данные и экспорт в Excel.
- Когда закончите, выключите все машины. Выньте тарелку с культурой и утилизируйте ее. Очистите электроды иноходца деионизированной водой и 70% этанолом.
Representative Results
Используя этот протокол, отдельные мышечные волокна FDB были выделены и встроены в гидрогель. Обзор процедуры рассечения мышц показан на рисунке 1. Мышца FDB обнажается с неповрежденными сухожилиями и отрезается от фасции. Сохранение сухожилий мышц в качестве точек фиксации сводит к минимуму потенциальное повреждение мышечных волокон во время процедуры изоляции. Избыток соединительной ткани можно обрезать, чтобы уменьшить мусор и рост вторичных типов клеток. После того, как мышца была иссечена и очищена в достаточной степени, мышца ферментативно переваривается с использованием коллагеназы, и отдельные мышечные волокна высвобождаются путем растирания перед встраиванием изолированных клеток в гидрогели. Изоляция мышечных волокон FDB обеспечивает относительно короткие мышечные волокна, преимущество которых заключается в том, что ими легко манипулировать. Благодаря своему размеру мышечные волокна FDB можно безопасно пипетировать без повреждений, вызванных спутыванием, и они легко встраиваются в гидрогель. Поскольку отдельные мышечные волокна не очень хорошо прилипают к культуральным пластинам, встраивание волокон в гидрогель гарантирует, что волокна останутся на месте во время культивирования клеток и сократительных измерений. Кроме того, добавление матрикса базальной мембраны к фибриновому гелю позволяет взаимодействовать между мышечными волокнами и матрицей, имитируя нативную среду in vivo . Изолированными отдельными мышечными волокнами можно манипулировать и поддерживать в культуре в течение нескольких дней после изоляции. На рисунке 2 показан пример изолированных волокон FDB, встроенных в гидрогелевую матрицу. Здоровые волокна имеют видимые саркомеры и вытянуты прямо (синяя стрелка), в то время как изогнутые волокна обычно повреждены или нежизнеспособны (желтая стрелка) и должны быть исключены из измерений. Гиперсжатые волокна выглядят как темные свернувшиеся объекты в матрице (красная стрелка). Если процедура выделения прошла успешно, доля здоровых волокон должна составлять ~75%. Большая доля гиперсокращенных волокон обычно указывает на повреждение во время процедуры изоляции. Мембрана мышечных волокон может быть повреждена либо из-за переваривания мышцы, либо из-за повреждения волокон во время растирания. Повреждение при растирании в основном возникает, если мышца недостаточно переварена и, следовательно, не распадается легко.
Функциональность и жизнеспособность волокон оценивали с помощью сократительных измерений мышечных волокон с использованием оптической высокопроизводительной системы измерения сократительной способности. Система выводит несколько параметров, таких как длина саркомера, процент укорочения саркомера, сократительная скорость и скорость релаксации. Используя систему измерения сократительной способности, сокращение саркомера может быть измерено на мышечное волокно. На рисунке 3 показаны примеры сокращений мышечных волокон, измеренных с помощью измерительной системы. Из одного переходного процесса сокращения получаются следующие параметры: длина саркомера на исходном уровне, продолжительность сокращения, длина саркомера при максимальном сокращении и продолжительность релаксации (рис. 3А). Эти параметры используются для расчета процента скоростей укорочения, сжатия и релаксации саркомера. Средние значения скорости также могут быть рассчитаны на основе значений продолжительности и абсолютного укорочения, если это необходимо. Действительное измерение сокращения включает прямую базовую линию, за которой следует падение до пика и возврат к базовой линии (рис. 3A). Шум, несфокусированные саркомеры или аберрантное движение волокна могут влиять на переходный процесс измерения (рис. 3B, C), и эти измерения могут быть отброшены вручную или будут отклонены программой анализа. При таком подходе четкая визуализация саркомеров важна для измерения сокращений; Таким образом, все, что снижает видимость саркомеров, может создавать шум. Это может произойти, если во время сокращения происходит движение саркомера за пределы фокальной плоскости. Измерения, в которых серия сокращений различается по скорости или глубине, также должны быть исключены из набора данных.
Сократительные данные отдельных мышечных волокон, полученные с помощью этой системы, могут быть использованы для сравнения различных условий культивирования. Эффективность системы проиллюстрирована на рисунке 4. Здесь мы измерили сокращения мышечных волокон FDB как в 2D (культуральные пластины, покрытые ламинином), так и в 3D (гидрогель фибрина). Более высокий процент пригодных для использования измерений был достигнут в 3D, так как встраивание волокон в гель предотвращало влияние бокового движения и других артефактов движения на измерение (рис. 4A). Встраивание волокон не оказало существенного влияния ни на укорочение саркомера, ни на значения максимальной скорости сжатия по сравнению с волокнами, культивируемыми в 2D-культуре (рис. 4B). Чтобы проиллюстрировать, как различные матрицы влияют на сокращение мышечных волокон FDB, мы также сравнили этот фибриновый гидрогель с чистым матриксом базальной мембраны (4 мг / мл) (рис. 4C). Снижение сократительной способности, наблюдаемое в матриксе чистой базальной мембраны, вероятно, было связано с жесткостью геля или усилением взаимодействия между клеткой и матриксом. Концентрации фибрина до 7 мг / мл также были протестированы, без существенного влияния на сократительную скорость и укорочение (неопубликованные данные). Использование гидрогеля на основе фибрина обеспечивает минимальное влияние на сократительные параметры.
Рисунок 1: Обзор процедуры рассечения мышц FDB. (A) Задняя конечность разрезается выше лодыжки (красная пунктирная линия), и (B) кожа удаляется путем разрезания вдоль верхней части стопы по синей пунктирной линии. (C) Стопа закреплена через лодыжку и кожу на пальцах ног. (D) Микроскопический вид обнаженной мышцы и окружающей ее соединительной ткани. Фасция видна в виде белого непрозрачного слоя, через который проходит сосудистая сеть. (E) Фасция удаляется из мышцы, а сухожилие разрезается по красной пунктирной линии. (F) Мышца FDB отделяется от подлежащих тканей путем подъема и разрезания под и вдоль мышцы. (G) Когда сухожилия пальцев ног хорошо видны, FDB разрезается по красной пунктирной линии. (H) FDB закреплен сухожилиями, а четвертое боковое сухожилие и его волокна можно удалить, разрезав по красной пунктирной линии. Излишки фасций теперь можно обрезать. (I) После очистки мышца FDB переводится в раствор коллагеназы. Масштабные линейки = (D-I) 2 мм. Аббревиатура: FDB = flexor digitorum brevis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроскопическое изображение мышечных волокон FDB, погруженных в гидрогель после 24 ч культивирования. Синяя стрелка: Пример жизнеспособного мышечного волокна FDB. Желтая стрелка: пример скрученного мышечного волокна FDB. Скрученные мышечные волокна могут иметь сниженную жизнеспособность и нарушенные сокращения и, таким образом, должны быть исключены из измерений. Красная стрелка: пример гиперсокращенного мышечного волокна FDB. Чрезмерная гиперсжатие возникает, когда растирание выполняется слишком энергично или может быть вызвано чрезмерным перевариванием коллагеназы или использованием несбалансированной питательной среды. Масштабная линейка = 100 мкм. Аббревиатура: FDB = flexor digitorum brevis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример переходных процессов сжатия волокна, измеренных с использованием высокопроизводительной сократительной системы на основе оптики . (А) Пример нормального переходного процесса сокращения. Этот переходный процесс получается из саркомеров, заключенных в фиолетовый квадрат, показанный на нижней панели инструментов. Переходный процесс состоит из следующих компонентов: длина саркомера на исходном уровне (зеленый), продолжительность сокращения (синий), длина саркомера при максимальном сокращении (фиолетовый) и продолжительность релаксации (красный). На основе этих значений рассчитываются такие параметры, как скорость и процент сжатия. (B) Пример неадекватного переходного процесса сокращения. Эти измерения происходят, когда сигнал саркомера не улавливается из-за шума (см. Красные стрелки). (C) Пример переходного процесса сокращения, который имеет артефакт движения (см. зеленые стрелки). Артефакты движения возникают, когда мышечное волокно выходит за пределы фокуса во время сокращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные данные, полученные с использованием высокопроизводительной сократительной системы на основе оптики при сравнении 2D и 3D условий и различных гидрогелей . (A) Процент принятых и отклоненных измерений сокращения, обнаруженных программой анализа данных в 2D-культуре и в 3D-культуре на основе 30 измерений. (B) Сравнение максимальной скорости сокращения в 2D-культивируемых и 3D-культивируемых мышечных волокнах, выделенных у трех мышей после 24 ч культивирования. (C) Сравнение укорочения саркомера в 2D-культивируемых и 3D-культивируемых мышечных волокнах, выделенных от трех мышей после 24 ч культивирования. (D) Сравнение максимальной скорости сокращения чистых матричных базальных мембран (Matrigel) и фибрин-гидрогеля мышечных волокон, выделенных у трех мышей после 24 ч культивирования. (E) Сравнение саркомерового укорочения чистых матриксов базальной мембраны (Matrigel) и фибрин-гидрогеля мышечных волокон, выделенных у трех мышей после 24 ч культивирования. Данные были проанализированы с использованием t-критерия Стьюдента и показаны как среднее ± SD. Каждая точка данных представляет собой одно мышечное волокно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав диссекционной среды, используемой для рассечения мышцы, среды для культивирования фибрина, используемой для культивирования изолированных мышечных волокон, и среды для мышечного пищеварения, используемой для ферментативного переваривания изолированных мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Состав клеточной смеси, используемой для литья гидрогелей, и матричной смеси, используемой для литья гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Discussion
Здесь мы подробно описываем протокол для выполнения ферментативной изоляции и культивирования мышечных волокон FDB в формате 3D-культуры с последующими сократительными измерениями с использованием системы измерения сократительности на основе оптики. Этот протокол имеет ряд преимуществ, среди которых: 1) прямая и своевременная изоляция многих интактных мышечных волокон из одной мышцы; 2) встраивание мышечных волокон в перестраиваемую гидрогелевую матрицу; 3) проведение высокопроизводительных измерений сократительной способности с использованием системы на основе оптики; и 4) возможность проводить повторные измерения одних и тех же мышечных волокон после вмешательства. Выделение единичных живых мышечных волокон обеспечивает зрелые мышечные клетки, которые сохраняют свою сократительную функцию. Поскольку мышечные волокна, полученные из FDB мыши, относительно невелики, ими легко манипулировать во время изоляции и они сохраняют свою прямую форму, что позволяет проводить последующие сократительные измерения. Хотя система была в первую очередь разработана для изучения сокращения кардиомиоцитов, волокна скелетных мышц содержат тот же сократительный механизм с легко различимым рисунком саркомера и, таким образом, также могут быть измерены с помощью этой системы29. Сочетание одноклеточных сократительных измерений с живой культурой мышечных волокон ex vivo является мощным инструментом для оценки здоровья и функционирования зрелых мышечных волокон в ответ на электрическую активацию.
Ограничением использования диссоциированных мышечных волокон является отсутствие внешних сил (т.е. пассивного растяжения), приложенных к волокнам, что приводит к более низкой длине саркомера в состоянии покоя по сравнению с теми, которые обнаруживаются in vivo. Хотя длина саркомера 2,4-2,5 мкм обеспечивает оптимальное производство силы, длина саркомера в состоянии покоя может сильно варьироваться33. В то время как длина саркомера в покое in vivo FDB еще не описана, наши собственные неопубликованные данные предполагают среднюю длину 2,2 мкм. Текущие результаты показывают среднюю длину саркомера в состоянии покоя ~ 1,95 мкм в ненагруженных волокнах FDB после 24 ч в культуре (рис. 3). Хотя эта меньшая длина саркомера в покое приведет к снижению выработки силы, длина ~ 1,95 мкм все равно должна производить >90% от максимальной силы34. Таким образом, этих длин саркомеров должно быть достаточно для определения различий в функции волокон между различными генетическими моделями или после медикаментозного лечения. Кроме того, встраивание волокон в гидрогель обеспечивает много дополнительных точек адгезии по сравнению со свободно плавающими 2D-культивируемыми волокнами, что ограничивает дальнейшее укорочение саркомера с течением времени.
Одним из преимуществ этого протокола изоляции мышечных волокон является использование легко рассекаемой быстро сокращающейся мышцы, состоящей из относительно небольших мышечных волокон по сравнению с другими мышцами, такими как длинный разгибатель пальцев (EDL). Их меньший размер делает мышечную изоляцию более подходящей для разделения на основе растирания, тем самым снижая вероятность повреждения мышечных волокон, вызванного пипеткой или клубком. Внеклеточный матрикс мышц FDB может быть легко ферментативно переварен с помощью коллагеназы, что позволяет изолировать сотни мышечных волокон за короткий промежуток времени. Однако чрезмерное переваривание может привести к повреждению мышечных волокон. Чрезмерное переваривание мышечных волокон можно распознать, когда мышца разваливается почти мгновенно при растирании мышцы или когда большая часть объема клеток гиперсокращается во время процедуры посева клеток. Чтобы предотвратить чрезмерное переваривание мышц, время переваривания должно быть оптимизировано для каждой партии коллагеназы. Чтобы проверить это, две мышцы FDB следует переваривать параллельно с поэтапным временем переваривания 5 минут между ними. Следует выбирать время переваривания с наибольшим выходом жизнеспособных мышечных волокон. Затем эту оптимизацию следует выполнить во второй раз, снова с 5-минутным разделением во время переваривания. Время переваривания, дающее самые жизнеспособные мышечные волокна, следует использовать в качестве оптимального времени переваривания для текущей партии коллагеназы. Другой способ ограничить вариабельность коллагеназы от партии к партии - это напрямую рассчитать единицы активности на миллилитр исходного раствора, а затем восстановить последующие партии коллагеназы до того же количества. Наконец, время пищеварения, возможно, потребуется оптимизировать для разных штаммов мышей, например, при изучении старых или больных животных, у которых наблюдается повышенное отложение внеклеточного матрикса35,36.
Возможность пипетки жизнеспособных изолированных мышечных волокон открывает возможности для культивирования мышечных волокон FDB в различных условиях культивирования. Одним из таких вариантов является культивирование этих волокон в гидрогелях для имитации нативной среды культивирования тканей. Этот протокол встраивания гарантирует, что волокна остаются на месте во время сократительных измерений, и был оптимизирован для того, чтобы волокна оседали на дно пластины до того, как гель застынет. Тем не менее, этот протокол, возможно, должен быть скорректирован с учетом различий в запасах тромбина и фибриногена. Если активность тромбина слишком высока, гель преждевременно застынет, и волокна могут оставаться во взвешенном состоянии в более высоких местах за пределами фокальной плоскости микроскопа. Если это произойдет, соотношение тромбин:фибриноген необходимо скорректировать. Это можно проверить, наложив волокна на все более низкие концентрации тромбина и обратив внимание на то, сколько времени занимает полимеризация. Как правило, это не должно происходить быстрее, чем через 30 минут. Однако слишком низкая концентрация тромбина также может ухудшить процесс полимеризации. Другой способ убедиться, что волокна находятся в правильной фокальной плоскости, заключается в том, чтобы сначала засеять их с использованием 2D-протокола, а затем добавить слой гидрогеля поверх волокон после того, как они прилипнут к культуральной пластине. Однако следует знать, что удаление среды из волокон может вызвать гиперсокращение, поскольку они чувствительны к высыханию. Также неясно, будет ли гидрогель полностью прикрепляться к культуральной пластине, и он может легче отсоединиться. Следовательно, эта процедура встраивания предпочтительна для поддержания жизнеспособности волокон и на месте для измерений сокращения.
Использование этого протокола позволяет изучать сократительную динамику зрелых мышечных волокон ex vivo и может быть применено как к здоровым мышам, так и к мышам, несущим генетические мутации мышечных заболеваний. Кроме того, он позволяет проверить, как условия культивирования или добавление соединений влияют на функцию мышечных волокон. Сократительные данные, полученные с помощью системы на основе оптики, дают представление о сократительной способности живых отдельных мышечных волокон, и изменения этой способности могут быть коррелированы со здоровьем волокон. Однако одних этих данных недостаточно, чтобы определить, происходят ли эти изменения на стадиях актин-миозинового перекрестного мостика или высвобождения кальция при мышечном сокращении. Хотя мы не описываем методы измерения кальциевой сигнализации в этом протоколе, эта установка также способна измерять кальциевые переходные процессы на основе фуры в сокращающихся мышечных клетках29. Недостатком этой системы является то, что мышца FDB содержит только быстро сокращающиеся мышечные волокна типа IIa/IIx, а мышцы, содержащие медленно сокращающиеся волокна типа I такого размера, еще не описаны37. Это исключает возможность изучения специфического функционирования оптоволокна с помощью этого метода. Протокол, который мы предлагаем здесь, потенциально может быть адаптирован для других мышц, таких как EDL или камбаловидная мышца, для изучения различий в типах волокон. Из-за их большего размера этот протокол необходимо будет дополнительно оптимизировать для этих мышц. Более длинные волокна имеют тенденцию запутываться на этапе гравитационного осаждения и разрываются при манипулировании пипеткой, что приведет к снижению выхода. Поэтому из-за их несовместимости с пипетированием более длинные волокна также менее совместимы с техникой заделки геля. Измерения этих волокон все еще могут быть выполнены в формате 2D-культуры, но волокна могут больше перемещаться во время сокращения из-за их размера, что влияет на отношение сигнал/шум. Другим ограничением этой системы является невозможность выполнять измерения силы наряду с сокращенными измерениями, такими как те измерения силы, которые могут быть получены с использованием других препаратов28 интактных мышечных волокон. Однако это ограничение можно обойти, оценив силу, создаваемую мышечным волокном. Генерируемую силу мышечных волокон можно оценить, если известны форма мышечных волокон в сокращенном и расслабленном состояниях, а также модуль Юнга матрицы25. Тем не менее, эта оптическая система обеспечивает простой в использовании и высокопроизводительный подход к изучению сократительной функции мышц и открывает ряд новых возможностей для изучения генетических заболеваний мышц и терапевтических вмешательств.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Сильвии Богаардс, Санне Луйкс, Валентину Янсену, Михелю Хелмсу и Эмми Мандерс за их техническую помощь в разработке этого протокола. Эта работа была поддержана наградами Ассоциации мышечной дистрофии (Премия за развитие MDA603238 T.J.K.), Голландского сердечно-сосудистого альянса (грант талантов для T.J.K) и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC, Австралия; Стипендия APP1121651 М.Я.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
- Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
- Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
- Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
- Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
- Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
- Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
- Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
- Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
- Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
- Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
- Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
- Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
- Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
- Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
- Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Holmberg, J., Durbeej, M.
- Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
- Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
- de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
- Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
- Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
- Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).
- Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
- Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
- Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
- Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
- Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).
