Summary
在这里，我们描述了含有纳米盘的生物活性剂的生产和表征。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述该方案。
Abstract
术语纳米盘是指由双层形成脂质、支架蛋白和集成生物活性剂组成的离散类型的纳米颗粒。纳米盘被组织成圆盘状的脂质双层，其周边由支架蛋白限制，支架蛋白通常是可交换载脂蛋白家族的成员。许多疏水性生物活性剂通过集成到颗粒脂质双层的疏水环境中，在纳米盘中有效地溶解，产生了直径为10-20nm的颗粒群。纳米盘的配制需要单个组分的精确比例，每种组分的适当顺序添加，然后对配方混合物进行浴超声处理。两亲性支架蛋白自发接触并重组分散的双层形成脂质/生物活性剂混合物，形成离散、均匀的纳米盘颗粒群。在此过程中，反应混合物从不透明、浑浊的外观转变为澄清的样品，当完全优化时，离心时不会产生沉淀。表征研究涉及生物活性剂增溶效率的测定、电子显微镜、凝胶过滤色谱、紫外可见（UV/Vis）吸光光谱和/或荧光光谱。随后通常使用培养的细胞或小鼠研究生物活性。在含有抗生素（即大环内酯类多烯类抗生素两性霉素B）的纳米盘的情况下，可以测量它们作为浓度或时间函数抑制酵母或真菌生长的能力。相对容易配制、相对于组分的多功能性、纳米级粒径、固有稳定性和水溶性允许纳米盘技术的无数体 外 和 体内 应用。在本文中，我们描述了一种配制和表征含有两性霉素B作为疏水生物活性剂的纳米盘的一般方法。
Introduction
新生的盘状高密度脂蛋白（HDL）是人体循环系统中更丰富的球形高密度脂蛋白的天然祖先。这些新生颗粒，也称为pre-ß HDL，具有独特而独特的结构特性1。事实上，新生的HDL不是作为球状粒子存在的，而是圆盘状的。对天然和重组盘状高密度脂蛋白的广泛结构表征研究表明，它们由磷脂双层组成，其周长由两亲性可交换载脂蛋白（apo）限制，例如apoA-I。在人脂蛋白代谢中，循环的新生高密度脂蛋白从外周细胞中积累脂质，并在依赖于关键蛋白质介质的过程中成熟为球形高密度脂蛋白，包括ATP结合盒转运蛋白A1和卵磷脂：胆固醇酰基转移酶2。这个过程代表了反向胆固醇转运途径的关键组成部分，被认为可以预防心脏病。有了这些知识和重建盘状HDL的能力，研究人员将这些颗粒用作治疗动脉粥样硬化的治疗干预措施3。从本质上讲，将重组高密度脂蛋白（rHDL）输注到患者中会促进胆固醇从斑块沉积物中排出，并将其返回到肝脏以转化为胆汁酸并从体内排泄。一些生物技术/制药公司正在推行这种治疗策略4。
与此同时，在实验室中产生这些粒子的能力引发了一系列研究活动，导致了新的应用和新技术。一个突出的应用涉及使用rHDL颗粒作为微型膜，在天然环境中容纳跨膜蛋白5。迄今为止，已有数百种蛋白质成功掺入盘状rHDL，研究表明，这些蛋白质作为受体、酶、转运蛋白等保留了天然构象和生物活性。这些被称为“纳米盘”的颗粒也被证明适合结构表征，通常以高分辨率6。这种跨膜蛋白研究方法被认为优于洗涤剂胶束或脂质体的研究，因此正在迅速发展。重要的是要认识到，已经报道了两种能够形成rHDL的不同方法。“胆酸盐透析”方法13在与在rHDL双层5中掺入跨膜蛋白相关的应用中很常用。基本上，该配制方法涉及在含有洗涤剂胆酸钠（或脱氧胆酸钠;胶束分子量[MW]为4，200Da）的缓冲液中混合形成磷脂的双层，支架蛋白和目标跨膜蛋白。去垢剂可有效溶解不同的反应组分，使样品能够针对缺乏去垢剂的缓冲液进行透析。在透析步骤中，当洗涤剂从样品中取出时，会自发形成rHDL。当这种方法用于捕获感兴趣的跨膜蛋白时，产物颗粒被称为纳米盘5。然而，尝试使用这种方法掺入小分子疏水生物活性剂（MW <1，000 Da）在很大程度上是不成功的。与跨膜蛋白不同，小分子生物活性剂能够与洗涤剂一起从透析袋中逸出，大大降低了它们在rHDL中的掺入效率。通过从配方混合物14中省略洗涤剂解决了这个问题。相反，组分依次加入到水性缓冲液中，从双层形成脂质开始，形成含有rHDL的稳定生物活性剂，称为纳米盘。其他人则使用rHDL掺入和运输体内成像剂7。最近，由载脂蛋白支架和阴离子甘油磷脂心磷脂组成的专用rHDL已被用于配体结合研究。这些颗粒为研究心磷脂与各种水溶性配体（包括钙、细胞色素c和抗癌剂阿霉素8）的相互作用提供了一个平台。
本研究的重点是配制具有稳定掺入疏水性生物活性剂（即纳米盘）的rHDL。这些试剂整合到盘状rHDL颗粒的脂质环境中的能力有效地赋予它们水溶性。因此，纳米盘具有 体内 治疗应用的潜力。在配制纳米盘时，需要特定的孵育/反应条件才能成功地将离散疏水性生物活性剂掺入产品颗粒中，本报告的目的是提供详细的实用信息，可用作为特定应用创建新型纳米盘颗粒的基础模板。因此，在本手稿的上下文中，术语nanodisc和nanodisk是不可互换的。纳米盘是指配制为含有嵌入其脂质双层5中的跨膜蛋白的rHDL，而术语纳米盘是指配制为掺入低分子量（<1，000 Da）疏水性生物活性剂（例如两性霉素B14）的rHDL。
有多种方法可用于获取合适的支架蛋白。可以从制造商处购买支架蛋白[例如apoA-I（SRP4693）或apoE4（A3234）]，但是，成本可能是一个限制因素。首选方法是在大肠杆菌中表达重组支架蛋白。针对人类apoA-I9，apoE410以及昆虫血淋巴蛋白apolipophorin-III11的协议已发布。为了本文描述的实验的目的，使用重组人apoE4的N端（NT）结构域（氨基酸1-183）。合成编码人apoE4-NT的核苷酸序列并将其插入到与载体编码的pelB前导序列直接相邻的pET-22b（+）表达载体中。该构建体导致pelB领导序列-apoE4-NT融合蛋白的表达。蛋白质合成后，细菌pelB领导序列将新合成的蛋白质引导到周质空间，其中前导肽酶切割pelB序列。所得的apoE4-NT蛋白没有序列标签或尾巴，随后逃逸细菌并积聚在培养基11，12中，简化了下游加工。
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Protocol
1. 支架蛋白组分的转化、表达和纯化
- BL21 细菌转化与含 apoE4-NT 的质粒
- 将一管BL21（DE3）感受态细胞在冰上解冻10分钟。
- 所有冰融化后，轻轻混合并小心地将 50 μL 细胞移液到冰上的转化管中。
- 向细胞混合物中加入含有 50 ng 质粒 DNA（有关序列，参见 补充表 1）的 5 μL。小心地轻弹试管四到五次以混合。不要涡旋。
- 将混合物放在冰上30分钟。
- 在42°C下对混合物进行热冲击10秒。
- 放在冰上5分钟。
- 在室温下将 950 μL S.O.C. 培养基移液到管中。
- 将管置于37°C振荡培养箱中60分钟，振荡设置为250rpm。
- 通过轻弹和倒置将细胞彻底混合，然后将 100 μL 细胞溶液铺在用氨苄青霉素处理的 20 mL Luria 肉汤 + 琼脂选择板上，浓度为 0.1 mg/mL。
- 在37°C孵育过夜，或直到可见菌落生长。
- 使用电动移液器，在室温下将 25 mL 无菌 NZCYM 培养基转移到无菌的 250 mL 锥形烧瓶中，并加入氨苄西林至终工作浓度为 0.1 mg/mL。
- 使用无菌接种环，从含有适当转化的细菌菌株的选择板中转移一个单独的菌落，并直接添加到含有25mL NZCYM培养基+氨苄青霉素的烧瓶中。
- 将25mL的NZCYM种子培养瓶放入37°C振荡培养箱中，轨道振荡设置为250rpm。
注意：建议将该种子培养物生长过夜以达到合适的细菌浓度（~1.5-2.0光密度单位），使用设置为波长= 600nm的分光光度计测量。 - 将 250 mL 无菌 NZCYM 培养基转移到四个 1 L 挡板烧瓶中，并加入氨苄青霉素抗生素至工作浓度为 0.1 mg/mL。
- 在无菌条件下，将5mL饱和种子培养物转移到四个含有250mL培养瓶的培养瓶中，并置于37°C振荡培养箱中，轨道振荡设置为250rpm。
注意：此时，培养物将被称为扩增培养物，并且将使用UV1800分光光度计监测指数生长。允许生长继续进行，直到600nm（OD600）的培养光密度达到0.6-0.8之间的值。 - 一旦扩增培养物达到所需的OD 600值0.6-0.8，向每个250ml 含有培养瓶的培养物中加入59.6mg异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），终浓度为1mM以诱导蛋白质表达。此时，扩展区域性称为表达式区域性。开始表达5小时。
- 在5小时表达期结束时，从振荡培养箱中取出四个烧瓶，并将125mL移液到六个250ml离心瓶（总共750mL）中。
- 平衡每个离心瓶，以确保总质量在彼此之间的±0.5 mg以内。
注意：此步骤对于确保离心机设备的安全操作至关重要。 - 首先将电源开关翻转到打开位置来准备离心机设备。单击标有“设置/实际”的按钮，然后使用相应的拨盘将参数调整为“JA-14”、“9，400 x g”、20.00 分钟和 4 °C。
- 将六个平衡离心瓶装入适当尺寸的离心机转子中，然后放入离心机中，确保遵循任何特定的安全参数。
注意：继续此步骤，直到所有细菌细胞培养物离心并收集上清液。 - 通过真空过滤或装有0.45微米过滤器的等效设备过滤分离的细菌上清液，以去除任何残留的碎屑。
- 肝素纯化重组apoE4-NT支架蛋白
注意：色谱柱纯化过程在室温下进行。- 通过应用 10 柱体积 （50 mL） 的 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）并以 5 mL/min 的速率洗脱来平衡 Hi-trap 肝素柱。
- 以2.5 mL/min的速率将apoE4-NT富集培养基涂于色谱柱上，直到应用了整个1 L体积的培养基并丢弃流出物。
- 用 10 柱体积 （50 mL） 的 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）洗涤色谱柱，并丢弃流出物。
- 通过向色谱柱上应用三柱体积（15 mL）洗脱缓冲液（10 mM磷酸钠缓冲液+ 1.5 M NaCl，pH 7.2）洗脱所需的apoE4-NT蛋白并收集洗脱液。
- apoE4-NT洗脱液的透析
- 通过在蒸馏去离子（DDI）水中彻底浸泡10分钟，准备一段透析管（使用的透析管尺寸为22厘米长，12毫米内径和10，000 MWCO）。
- 在 1 L 塑料烧杯或等效物中制备 1 L 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（10 mM 磷酸钠 + 150 mM NaCl，pH 7.2）。
- 使用透析管夹，夹住浸泡透析管的一端，确保夹紧，没有液体逸出。
- 将一个狭窄的颈部漏斗插入透析管的开口端，并将 15 mL 的 apoE4-NT 洗脱液倒入透析管中。
注意：在此步骤中必须检查是否有任何泄漏。 - 拆下漏斗并用另一个透析管夹夹住透析管的末端。
- 将泡沫透析浮子放在透析管的密封端之一上，并将组装好的透析管放入装有1LPBS缓冲液的烧杯中。
- 将磁力搅拌棒放入烧杯底部，并将搅拌控制调整为“低”，确保不会形成涡流。
- 透析结束后，将截留物倒入50mL锥形管中并储存在-20°C。
注意：建议在4°C下进行透析过夜。
2. 含纳米盘的生物活性剂的配方
- 磷脂等分试样的制备
- 称取 5 mg 适当的磷脂（例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 [DMPC]）并转移到玻璃试管中。
- 通过加入 300 μL CHCl 3 和 100 μL CH 3 OH 溶解 5 mg 磷脂，总比例为3：1 v/v。
- 通过将玻璃试管置于温和的N2 气体流下10-15分钟来蒸发有机溶剂，使得沿管底部壁形成一层干燥的磷脂薄膜。
- 磷脂等分试样的冻干
- 通过用封口膜覆盖玻璃试管开口来制备用于冻干的磷脂等分试样。
- 使用24 G针刺穿封口膜约10-15次。
- 将穿孔的等分试样放入适当的冻干容器中，并确保橡胶盖正确密封。
- 将冻干容器连接到位于冻干机顶部的真空歧管上，并确保所有其他阀门都紧闭。
- 通过拨动电源开关并按下真空初始化按钮打开冻干机。
- 系统达到全真空后，单击制冷初始化按钮开始冷冻干燥过程。
注意：建议让样品冻干过夜。
- 两性霉素-B（amp-B）纳米盘的配方
- 将 0.45 mL PBS 移液到冻干的磷脂等分试样中并涡旋 ~30 秒以分散脂质。
注意：所得样品将呈现不透明和浑浊。 - 将 50 μL 的 20 mg/mL 储备液 ampB 溶液（20 mg ampB 溶解在 1 mL 二甲基亚砜 [DMSO] 中，储存在 -20 °C 的密闭琥珀色容器中）移入分散的磷脂样品中并涡旋。
注意：在选择用于制备疏水性生物活性剂储备溶液的溶剂时，两个首要考虑因素是1）生物活性剂的溶解度和2）溶剂与配方中使用的水性缓冲液的混溶性。虽然DMSO经常用于15，16，17，18，19，二甲基甲酰胺20，21或四氢呋喃22也已成功使用23。 - 将 0.5 mL 的 apoE4-NT 支架蛋白（浓度为 ~4 mg/mL）移液到含有分散磷脂和 ampB 的玻璃试管中。样品的最终体积应约为 1 mL。
- 浴在24°C下超声处理样品，直到溶液澄清（通常为10-15分钟）。
- 将 0.45 mL PBS 移液到冻干的磷脂等分试样中并涡旋 ~30 秒以分散脂质。
- 纳米盘离心
- 将澄清的ampB-纳米盘溶液转移到无菌的1.7 mL微量离心管中。
- 将试管放入台式微量离心机转子中，并添加直接放置在对面的平衡管。
- 拧紧转子盖并关闭离心机盖。
- 使用位于微量离心机单元正面的相应刻度盘对离心机进行编程，使其以~11，000× g 旋转10分钟。
注意：此时，可能可以看到颗粒。该沉淀由未掺入的磷脂和/或ampB组成。 - 取出上清液并将其转移到另一个干净的 1.7 mL 微量离心管中。
- ampB-纳米盘样品的透析
- 通过在DDI水中彻底浸泡10分钟，准备一段透析管（使用的透析管尺寸为3厘米长，16毫米内径和10，000 MWCO）。
- 在 1 L 塑料烧杯或等效物中制备 1 L PBS 缓冲溶液（10 mM 磷酸钠 + 150 mM NaCl，pH 7.2）。
- 使用透析管夹，夹住浸泡透析管的一端，确保夹紧，没有液体逸出。
- 将一个狭窄的颈部漏斗插入透析管的开口端，并将 ampB 纳米盘样品转移到透析管中。
- 拆下漏斗并用另一个透析管夹夹住透析管的末端。
- 将泡沫透析浮子放在透析管的密封端之一上，并将组装好的透析管放入装有 1 L PBS 缓冲液的烧杯中。
- 将磁力搅拌棒放入烧杯底部，并将搅拌控制调整为“低”，确保不会形成涡流。允许透析在4°C下持续过夜。
3. ampB-纳米盘样品的光谱分析
- 分光光度计初始化，然后自动空白
- 通过翻转电源开关打开分光光度计，并通过按下标有“PC Control”的按钮连接到相应的支持计算机。
- 在支持计算机上，打开标有“UVProbe 2.61”的软件，然后单击左下角标有“连接”的按钮连接到分光光度计。
- 单击标有 光谱 在 UVProbe 软件的顶部工具栏上。
- 单击顶部工具栏上标有 方法 的按钮。
- 单击“ 测量 ”选项卡，然后在“波长范围（nm）”下的 “开始 ”文本框中输入“500”，在“结束”文本框中输入“300”。
- 单击标有“扫描速度”选项卡旁边的下拉菜单，然后将其设置为“中”。
- 通过将1ml DMSO转移到两个石英比色皿（QS 1.000）中来制备样品空白。
- 将两个比色皿装入分光光度计的相应样品端口，单击 自动空白，然后单击左下角的 “开始 ”记录 300-500 nm 的光谱。
- ampB标准品的制备和光谱分析
- 从前样品口取出比色皿并加入 20 μL 1 mg/mL ampB 储备溶液（总共 20 μg ampB），制备 20 μg/mL ampB 标准品。
- 将比色皿装回分光光度计的样品端口，然后单击 “开始” 以记录样品吸光度。
- 从样品口取出比色皿，将液体内容物倒入适当标记的废物容器中。
- 用去离子水彻底冲洗比色皿，然后用70%乙醇洗涤三次。
- 破碎的ampB-纳米盘样品的制备和光谱分析
- 通过将 20 μL 的 1 mg/mL ampB 纳米盘储备液移液到 1 mL DMSO 中，制备破碎的 ampB 纳米盘样品（含有 20 μg/mL 作为 ampB）。在记录光谱之前孵育至少1分钟。
- 将比色皿装入分光光度计的前样品端口，然后单击 “开始” 以记录样品吸光度。
- PBS缓冲液空白的制备和光谱分析
- 通过将 1 mL PBS 缓冲液转移到两个石英比色皿 （QS 1.000） 中来制备空白 PBS 缓冲液。
- 将比色皿装入分光光度计的相应样品端口，单击 自动空白，然后记录 300-500 nm 的光谱。
- 无损ampB-纳米盘样品的制备和光谱分析
- 通过从前样品端口取出比色皿并将 20 μL 的 1 mg/mL ampB 纳米盘样品引入 PBS 缓冲液中，制备未中断的 ampB 纳米盘样品（含有 20 μg/mL 作为 ampB）。
- 将比色皿装回分光光度计的样品端口，单击 开始，然后记录样品光谱。
注意：所有化学废物应按照公认的准则在适当标记的废物容器中处理。
4. 酵母活力测定分析
注意：进行酵母活力测定以评估ampB的生物活性，并确定配制或掺入纳米盘的过程是否影响其酵母生长抑制活性。
- 按照先前描述的方法（2.3-2.4.1），配制两个ampB-纳米盘样品（最终体积= 1 mL），以每5mg DMPC含有1mg的ampB和每5mg DMPC含有0.1mg的ampB。
注意：要使每 5 mg DMPC 产生 1 mg/mL 和 0.1 mg/mL 安培 B，请分别将 50 μL 和 5 μL 的 20 mg/mL ampB DMSO 储备液移入每个样品瓶中。 - 饱和酵母培养物的制备
- 将 25 mL 无菌酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖 （YPD） 培养基转移到无菌 50 mL 锥形管中。
- 使用无菌接种环将单个 酿酒酵母 （BY4741） 菌落转移到 25 mL YPD 培养基中。
- 在30°C的振荡培养箱中培养酵母，振荡设置为200rpm18小时。
- 制备个体生长抑制测定样品
- 将 5 mL 无菌 YPD 培养基转移到 30 个无菌 13 mL 培养管中。
- 通过加入 20、10 和 5 μL 的 1 mg/mL ampB-纳米盘样品（分别代表 20、10 和 5 μg ampB）来处理三组培养管。
- 通过加入 20、10 和 5 μl 0.1 mg/mL ampB-纳米盘样品（分别代表 2、1 和 0.5 μg ampB）来处理三组培养管。
- 通过在 DMSO 中加入 20 μL PBS、DMSO、对照 rHDL（无 ampB）或 20 μg ampB 来处理四组培养管。
注意：每组培养管代表一个独立的重复。因此，遵循此方法会导致总体 n 值为 n = 3。
- 酵母活力测定初始化
- 通过向每个样品接种 100 μL（2% 体积/体积）饱和酵母培养物来启动实验
- 使用设置为30°C的振荡培养箱培养酵母，振荡设置为200rpm最多18小时。
- 酵母活力测量
- 通过翻转电源开关打开分光光度计，然后单击标有 转到 WL 并将值设置为 600 nm。
- 将 1 mL 无菌 YPD 培养基转移到两个塑料比色皿中，加载到分光光度计上的相应样品端口中，然后单击 自动空白。
- 将每个样品的 1 mL 转移到塑料比色皿中，确保每次更换比色皿并将比色皿装入分光光度计的前样品端口。
- 测量并记录每个样品在 600 nm 处的光密度，并将每个消耗的比色皿处理到正确标记的生物危害废物容器中。
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Representative Results
生物活性剂纳米盘配制工艺
在所描述的ampB-纳米盘配制程序中，当样品外观从浑浊转变为透明时，反应被认为是完成的（图1）。这种变化表明纳米盘已经形成并且生物活性剂已经溶解。通常，生物活性剂吸收可见波长区域的光（例如，ampB，姜黄素，叶黄素，辅酶Q10），在这些情况下，样品采用生物活性剂的颜色。样品澄清完成后（通常为浴超声处理5-20分钟），将样品转移到1.7ml微量离心管中，并以11，000× g 离心5分钟以沉淀不溶性物质。没有可见的颗粒可以被认为是生物活性剂已被掺入纳米盘的有力证据。另一方面，颗粒的出现表明部分或没有发生生物活性剂掺入。如果必要或有用，仅可以并行进行含有双层形成脂质和支架蛋白的对照制剂，并且使用分光光度计对两个样品的澄清程度进行目视和定量比较。在任何情况下，在离心含有纳米盘的生物活性剂后，将样品透析至PBS或其他适当的缓冲液上，以除去痕量的溶剂。
生物活性剂增溶效率分析
为了说明如何使用样品吸光度来确定增溶效率，可以使用ampB纳米盘。最初，在DMSO中收集ampB频谱。这是通过将 20 μL 从 1 mg/mL ampB（DMSO 中）储备溶液中加入到含有 980 μl DMSO 的比色皿中来实现的。然后在紫外/可见分光光度计上记录300-500nm的可见光波长范围内的光谱（图2）。该光谱在DMSO溶剂中获得，在372 nm，392 nm和415 nm处产生三个独特的吸光度最大值，这些峰指示ampB。随后，收集PBS中ampB纳米盘的吸光度光谱。为了获得该光谱，将PBS中的20μLampB纳米盘添加到980μLPBS中，并记录光谱。预计该光谱将与DMSO25中观察到的光谱有很大不同，在较短波长处有一个主吸光峰。这一结果是由于在PBS中，ampB-纳米盘颗粒结构保持完整，单个ampB分子被限制并限制在纳米盘双层的疏水环境的内部。由于样品中的ampB分子与其他ampB分子非常接近，因此可以形成高阶复合物/结构，从而导致ampB的光谱特性发生巨大变化。为了直接比较配制成纳米盘的ampB与储备ampB的光谱，将20 μL等分试样的透析ampB-纳米盘（PBS）添加到980μL DMSO中。在这种情况下，DMSO溶剂导致纳米盘颗粒结构的破坏，使得集成到纳米盘样品的脂质双层中的ampB被释放并变得易溶于DMSO溶剂。该样品的吸光度光谱应与上述储备ampB的光谱非常相似，如果不是完全相同的话。这一结果提供了直接证据，证明ampB的存在，并且其化学性质没有被纳米盘配方过程改变。在这种情况下，预计将检测到相同的三个吸光度最大值。
ampB-纳米盘的生物活性
为了评估ampB-纳米盘的生物活性，进行了酵母生长抑制测定。采用酵母菌株BY4741（ 酿酒酵母 S288C菌株的后代）。处理后，在UV-1800紫外/可见分光光度计上以600nm处测量每个酵母样品的光密度（图3）。纳入三个对照样品（PBS，DMSO和rHDL）表明，除ampB以外的纳米盘成分对酵母生长没有明显影响。阳性对照（DMSO中20μgampB）证实ampB是酵母生长的有效抑制剂。当测试ampB纳米盘时，获得了ampB浓度依赖性生长抑制活性的证据。因此，将ampB封存在纳米盘颗粒的脂质环境中可以增加水性缓冲液的溶解度，并保留有效的生物活性。
图1：浴超声处理对纳米盘配方和样品外观的影响。 通过将 5 mg DMPC 分散在 0.75 mL PBS 中，从 DMSO 中的 20 mg/mL 储备溶液向样品中加入 1 mg ampB 中，然后在 0.5 ml PBS（来自 4 mg/ml 储备溶液）中加入 2 mg 支架蛋白，制备 ampB-纳米盘 （ampB-ND） 样品。（A） 聚苯乙烯在PBS中的DMPC分散。（B）加入1mgampB后PBS中的DMPC分散体。（C）含有DMPC，ampB和支架蛋白的纳米盘溶液，经过浴超声处理。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：ampB 样品的紫外/可见吸光度光谱。 （A） DMSO 中的放大器 B。（B）PBS中的ampB-nanodisk（ampB-ND）。（C）DMSO中的ampB纳米盘。光谱在紫外/可见光谱仪上收集。ampB-纳米盘样品的ampB含量可以通过将已知等分试样转移到DMSO溶液中并测量416nm处的吸光度来确定（416nm处的ampB消光系数= 1.24 x 105 M-1 cm-1）。请点击此处查看此图的大图。
图3：ampB对 酿酒酵母生长的影响。 在不存在和存在ampB的情况下，酵母在30°C下培养。缺乏ampB的对照样本包括单独的PBS和rHDL。作为阳性对照，在DMSO中给予ampB。测试配方包括指定浓度的ampB纳米盘（ampB-ND）。孵育后，在600nm处测定单个样品的光密度值。使用双向方差分析多重比较与Tukey事后检验确定统计学显著性。报告的值是平均±标准误差（n = 3），代表三个独立实验。ns = 不显著。 请点击此处查看此图的大图。
| 生物活性剂 | 分子量（Da） | 溶剂 | 参考 |
| 两性霉素B | 924.1 | 二甲基亚胺 | 15 |
| 全反式 维甲酸 | 300.4 | 二甲基亚胺 | 16 |
| 姜黄素 | 368.4 | 二甲基亚胺 | 17 |
| 努特林 3a | 581.5 | 二甲基亚胺 | 21 |
| 辅酶Q10 | 863.3 | 二甲基甲酰胺 | 20 |
| 叶黄素 | 568.9 | 四 氢 呋喃 | 22 |
| 鞘二烯 | 297.5 | 二甲基亚胺 | 19 |
| 多西紫杉醇 1 | 807.9 | - | 23 |
| 10-羟基喜树碱 | 364.4 | 二甲基亚胺 | 18 |
| 辛伐他汀1 | 418.5 | - | 24 |
| 1 选定的生物活性剂溶剂用磷脂干燥，而不是加入到分散的磷脂缓冲液中。 | |||
表1：生物活性剂成功掺入纳米盘中。
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Discussion
含有纳米盘的生物活性剂的配制提供了一种溶解否则不溶的疏水化合物的便捷方法。由于产品生物活性剂纳米盘完全溶于水介质，因此它们为各种疏水分子提供了一种有用的递送方法（表1）。这些包括小分子、天然和合成药物、植物营养素、激素等。配方策略通常遵循标准方案，该方案必须考虑生物活性剂在有机溶剂中的溶解度特性。除了选择合适的有机溶剂来溶解生物活性剂外，还需要两个附加参数，即实现~20 mg/ml储备溶液和溶剂与水溶液的混溶性。这是必要的，因为它允许将大量的生物活性剂添加到配方混合物中，同时不引入过量的有机溶剂。混溶性很重要，因为相分离会阻止生物活性剂掺入产品纳米盘中。
在所选缓冲液中形成双层磷脂分散体后立即引入生物活性剂，允许这些组分在添加支架蛋白之前相互相互作用。在添加支架蛋白之前和之后，样品显示为不透明的悬浮液。然而，一旦加入三种成分（磷脂、生物活性剂和支架蛋白，以 5/1/2 w/w/w 的比例），并且样品在正确的温度下进行足够长时间的浴超声处理，其外观就会从浑浊变为透明。如果生物活性剂是有色的，澄清的样品将呈现该颜色。因此，通过目视检查很容易检测纳米盘的形成。
尽管DMPC很方便，并且经常用作许多应用的首选磷脂，但与某些生物活性剂一起，这种磷脂可以抵抗纳米盘配方。例如，辅酶Q10 纳米盘仅在使用蛋磷脂酰胆碱（PC）时形成19，同样用于叶黄素22。因此，虽然DMPC通常是首选的磷脂，但这并不是通用的。辅酶Q10 和叶黄素偏爱鸡蛋PC的原因可能是由于它们的疏水区域延长，偏爱具有不饱和脂肪酸的双层或其他因素。当使用蛋PC时，超声处理过程中超声温度升高到45°C，以实现样品完全澄清。一旦配制，将含有生物活性剂的纳米盘离心以除去不溶性物质。然而，应该注意的是，一旦确定并遵循最佳条件，通常不会形成沉淀物。随后，将样品在缓冲液中透析过夜，以除去与生物活性剂一起添加到制剂混合物中的少量有机溶剂。透析后，产物纳米盘可以在4°C下长时间储存。如果掺入的生物活性剂容易氧化，则纳米盘样品应储存在N2 气体下的密闭容器中。
已经使用了各种方法来表征和验证纳米盘实际上已经形成。也许最精确的方法是电子显微镜26，27。该技术提供有关颗粒形态、直径和种群大小异质性的信息。这种方法被认为是纳米盘形成的决定性方法。一种相关的方法，原子力显微镜，也已被用于研究含有生物活性剂的纳米磁盘17，24，28的性质。然而，出于实际目的，快速蛋白质液相色谱（FPLC）凝胶过滤色谱是方便的，并且通常足以表征给定生物活性剂纳米盘样品20，22的大小（~200，000Da）和均匀性。一旦确定生物活性剂纳米盘已经形成，确定生物活性剂的增溶效率也是重要和有用的。如果生物活性剂在给定波长下具有特征性的吸光度特性，则紫外/可见分光度计是一种方便的方法。一个潜在的复杂因素是支架蛋白在280nm处的吸光度。但是，如果给定的生物活性剂以不同的波长吸收，则这不是问题。如果已知目标生物活性剂的消光系数，则可以准确地确定溶解在纳米盘中的生物活性剂的量。否则，可以使用从适当溶剂中已知量的生物活性剂的光谱得出的标准曲线。替代方法包括荧光光谱17，22或高效液相色谱（HPLC）分析20，24。
所描述的含有纳米盘的生物活性剂的基本配方工艺适用于广泛的应用。例如，含有造影剂的纳米盘已被用于医学成像研究，以诊断和评估疾病的进展29。另一种方法是将脂质修饰的蛋白质整合到纳米盘的双层中。例如，Lalefar等人通过插入其共价结合的油酸部分30成功地将“Wnt”蛋白掺入纳米盘中。Wnt纳米盘随后被证明构成水溶性Wnt转运载体，能够促进造血干细胞的离体扩增。在另一项研究中，Crosby等人构建了一个支架蛋白嵌合体，该支架由apoA-I融合到针对B细胞表面抗原CD2031的单链可变抗体片段（scFv）组成。随后以α-CD20 scFv·apoA-I为支架组分配制姜黄素纳米片，赋予B细胞靶向性，从而增强生物活性剂递送。该策略提供了一种新方法，通过将化疗药物特异性地引导到靶细胞类型来最小化与化疗药物相关的毒性。在另一实例中，将合成的阳离子脂质1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基氯化铵丙烷（DMTAP）掺入到纳米盘32的双层中。该配方策略有效地赋予了纳米盘双层表面正电荷特性，从而促进了与短干扰（si）RNA的稳定结合相互作用。富集siRNA的DMTAP纳米盘随后在靶基因敲低研究中被证明具有生物活性。在另一个例子中，纳米盘已经配制成心磷脂作为唯一的磷脂成分。已知这种独特的阴离子甘油磷脂可结合各种配体，包括二价矿物质钙、血蛋白细胞色素c、蒽环类抗癌剂阿霉素等33，34，35，36。心磷脂纳米盘已被用于通过利用纳米盘的溶解度特性、其纳米级尺寸以及可访问的心磷脂双层8 的存在来详细表征这些结合相互作用。基于这些和其他应用，很明显，纳米磁盘技术是多种应用的多功能平台。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R37 HL-64159）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
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