Summary
Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.
Abstract
De term nanoschijf verwijst naar een discreet type nanodeeltje dat bestaat uit een tweelaags lipide, een steigereiwit en een geïntegreerd bioactief middel. Nanoschijven zijn georganiseerd als een schijfvormige lipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door het steigereiwit, meestal een lid van de uitwisselbare apolipoproteïnefamilie. Talrijke hydrofobe bioactieve stoffen zijn efficiënt opgelost in nanoschijven door hun integratie in het hydrofobe milieu van de lipide bilayer van het deeltje, wat een grotendeels homogene populatie deeltjes oplevert in het bereik van 10-20 nm in diameter. De formulering van nanoschijven vereist een nauwkeurige verhouding van individuele componenten, een geschikte sequentiële toevoeging van elke component, gevolgd door badsonificatie van het formuleringsmengsel. Het amfipathische scaffold-eiwit maakt spontaan contact met en reorganiseert het gedispergeerde dubbellaagse mengsel van lipide / bioactieve stof om een discrete, homogene populatie van nanoschijfdeeltjes te vormen. Tijdens dit proces gaat het reactiemengsel over van een ondoorzichtig, troebel uiterlijk naar een geklaard monster dat, wanneer het volledig is geoptimaliseerd, geen neerslag oplevert bij centrifugeren. Karakteriseringsstudies omvatten de bepaling van de oplosefficiëntie van bioactieve stoffen, elektronenmicroscopie, gelfiltratiechromatografie, ultraviolet zichtbare (UV / Vis) absorptiespectroscopie en / of fluorescentiespectroscopie. Dit wordt normaal gesproken gevolgd door een onderzoek naar biologische activiteit met behulp van gekweekte cellen of muizen. In het geval van nanoschijven die een antibioticum bevatten (d.w.z. het macrolide polyeenantibioticum amfotericine B), kan hun vermogen om de groei van gist of schimmels te remmen als functie van concentratie of tijd worden gemeten. Het relatieve gemak van formulering, veelzijdigheid met betrekking tot componenten, deeltjesgrootte op nanoschaal, inherente stabiliteit en waterige oplosbaarheid maakt talloze in vitro en in vivo toepassingen van nanoschijftechnologie mogelijk. In dit artikel beschrijven we een algemene methodologie om nanoschijven die amfotericine B bevatten te formuleren en te karakteriseren als het hydrofobe bioactieve middel.
Introduction
Ontluikende discoïdale lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL's) zijn van nature voorkomende voorlopers van het veel overvloedigere bolvormige HDL dat aanwezig is in de menselijke bloedsomloop. Deze ontluikende deeltjes, ook wel pre-ß HDL genoemd, bezitten unieke en onderscheidende structurele eigenschappen1. Inderdaad, in plaats van te bestaan als een sferoïdaal deeltje, zijn ontluikende HDL's schijfvormig. Uitgebreide structurele karakteriseringsstudies op natuurlijke en gereconstitueerde discoïdale HDLs hebben aangetoond dat ze bestaan uit een fosfolipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door een amfipathisch uitwisselbaar apolipoproteïne (apo), zoals apoA-I. In het metabolisme van menselijke lipoproteïneën bouwen circulerende ontluikende HDL's lipiden op uit perifere cellen en rijpen ze tot bolvormige HDLs in een proces dat afhankelijk is van belangrijke eiwitmediatoren, waaronder de ATP-bindingscassettetransporter A1 en lecithine: cholesterolacyltransferse2. Dit proces vertegenwoordigt een cruciaal onderdeel van de omgekeerde cholesteroltransportroute die wordt beschouwd als beschermend tegen hartaandoeningen. Gewapend met deze kennis en het vermogen om discoïdale HDLs te reconstitueren, hebben onderzoekers deze deeltjes gebruikt als een therapeutische interventie om atherosclerose3 te behandelen. In wezen bevordert de infusie van gereconstitueerd HDL (rHDL) bij patiënten cholesterolefflux uit plaqueafzettingen en brengt het terug naar de lever voor omzetting in galzuren en uitscheiding uit het lichaam. Verschillende biotechnologie/farmaceutische bedrijven volgen deze behandelingsstrategie4.
Tegelijkertijd heeft het vermogen om deze deeltjes in het laboratorium te genereren geleid tot een vlaag van onderzoeksactiviteiten die heeft geleid tot nieuwe toepassingen en nieuwe technologieën. Een prominente toepassing betreft het gebruik van rHDL-deeltjes als een miniatuurmembraan om transmembraaneiwitten te huisvesten in een native-achtige omgeving5. Tot op heden zijn honderden eiwitten met succes opgenomen in discoïdale rHDL, en onderzoek heeft aangetoond dat deze eiwitten zowel inheemse conformatie als biologische activiteit behouden als receptoren, enzymen, transporters, enz. Van deze deeltjes, aangeduid als "nanodiscs", is ook aangetoond dat ze vatbaar zijn voor structurele karakterisering, vaak met een hoge resolutie6. Deze benadering van onderzoek naar transmembraaneiwitten wordt erkend als superieur aan studies met detergentenmicellen of liposomen en vordert als gevolg daarvan snel. Het is belangrijk om te erkennen dat er twee verschillende methoden zijn gemeld die in staat zijn om een rHDL te vormen. De "cholaatdialyse" methode13 is populair voor toepassingen die verband houden met de opname van transmembraaneiwitten in de rHDL bilayer5. In wezen omvat deze formuleringsmethode het mengen van een tweelaagse fosfolipide, een steigereiwit en het transmembraaneiwit van belang in een buffer die het detergent natriumcholaat (of natriumdeoxycholaat; micelmolecuulgewicht [MW] van 4.200 Da) bevat. Het reinigingsmiddel lost de verschillende reactiecomponenten effectief op, waardoor het monster kan worden gedialyseerd tegen buffergebrek aan reinigingsmiddel. Tijdens de dialysestap, als het wasmiddel uit het monster wordt verwijderd, vormt zich spontaan een rHDL. Wanneer deze benadering wordt gebruikt om een transmembraaneiwit van belang in de val te lokken, worden de productdeeltjes nanodiscs5 genoemd. Pogingen om deze methode te gebruiken om hydrofobe bioactieve stoffen met kleine moleculen (MW <1.000 Da) op te nemen, zijn echter grotendeels mislukt. In tegenstelling tot transmembraaneiwitten kunnen bioactieve stoffen met kleine moleculen samen met het wasmiddel uit de dialysezak ontsnappen, waardoor hun opname-efficiëntie in rHDLs sterk afneemt. Dit probleem werd opgelost door detergentia weg te laten uit het formuleringsmengsel14. In plaats daarvan worden de componenten achtereenvolgens aan een waterige buffer toegevoegd, te beginnen met de tweelaagse die lipide vormt, waardoor een stabiel bioactief middel wordt gevormd dat rHDL bevat, een nanoschijf genoemd. Anderen hebben rHDL gebruikt voor de opname en het transport van in vivo beeldvormende middelen7. Meer recent zijn gespecialiseerde rHDL, bestaande uit een apolipoproteïnesteiger en de anionische glycerofosfolipide, cardiolipine, gebruikt in ligandbindingsstudies. Deze deeltjes bieden een platform voor studies naar de interactie van cardiolipine met verschillende in water oplosbare liganden, waaronder calcium, cytochroom c en het antikankermiddel doxorubicine8.
De focus van deze studie ligt op de formulering van rHDL die een stabiel opgenomen hydrofoob bioactief middel (d.w.z. nanoschijf) bezitten. Het vermogen van deze middelen om te integreren in het lipidemilieu van discoïdale rHDL-deeltjes verleent ze effectief waterige oplosbaarheid. Als zodanig hebben nanoschijven het potentieel voor in vivo therapeutische toepassingen. Bij het formuleren van nanoschijven zijn specifieke incubatie- / reactieomstandigheden vereist om met succes discrete hydrofobe bioactieve stoffen in het productdeeltje op te nemen, en het doel van dit rapport is om gedetailleerde praktische informatie te bieden die kan worden gebruikt als een fundamentele sjabloon voor het maken van nieuwe nanoschijfdeeltjes voor specifieke toepassingen. In de context van dit manuscript zijn de termen nanodisc en nanodisk dus niet uitwisselbaar. Terwijl nanodisc verwijst naar een rHDL geformuleerd om een transmembraaneiwit te bevatten dat is ingebed in zijn lipide bilayer5, verwijst de term nanodisk naar een rHDL geformuleerd om hydrofobe bioactieve stoffen met een laag molecuulgewicht (< 1.000 Da) op te nemen, zoals amfotericine B14.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de verwerving van geschikte steigereiwitten. Het is mogelijk om steigereiwitten te kopen van fabrikanten [bijv. apoA-I (SRP4693) of apoE4 (A3234)], maar de kosten kunnen een beperkende factor zijn. Een voorkeursbenadering is om recombinante steigereiwitten tot expressie te brengen in Escherichia coli. Protocollen zijn gepubliceerd voor humaan apoA-I9, apoE410, evenals het insect hemolymfe-eiwit apolipophorin-III11. Voor de hierin beschreven experimenten werd gebruik gemaakt van recombinant humaan apoE4 N-terminale (NT) domein (aminozuren 1-183). De nucleotidesequentie die codeert voor menselijk apoE4-NT werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pET-22b (+) expressievector direct grenzend aan de vectorgecodeerde pelB-leidersequentie. Dit construct leidt tot de expressie van een pelB leader sequence-apoE4-NT fusie-eiwit. Na eiwitsynthese leidt de bacteriële pelB-leidersequentie het nieuw gesynthetiseerde eiwit naar de periplasmatische ruimte waar leider peptidase de pelB-sequentie splitst. Het resulterende apoE4-NT-eiwit, zonder sequentietags of staarten, ontsnapt vervolgens aan de bacteriën en hoopt zich op in het kweekmedium11,12, waardoor de verwerking stroomafwaarts wordt vereenvoudigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformatie, expressie en zuivering van steigereiwitcomponent
- BL21 bacteriële transformatie met apoE4-NT bevattend plasmide
- Ontdooi een buisje BL21 (DE3) competente cellen op ijs gedurende 10 min.
- Zodra al het ijs is gesmolten, mengt u voorzichtig en voorzichtig pipet 50 μL van de cellen in een transformatiebuis op ijs.
- Voeg 5 μL met 50 ng plasmide-DNA (voor sequentie, zie aanvullende tabel 1) toe aan het celmengsel. Veeg voorzichtig vier of vijf keer over de buis om te mengen. Niet vortexen.
- Leg het mengsel 30 minuten op ijs.
- Hitteschok het mengsel bij precies 42 °C gedurende 10 s.
- Plaats 5 min op het ijs.
- Pipetteer 950 μL S.O.C. medium in de buis bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis gedurende 60 minuten in een schudincubator van 37 °C met een oscillatie ingesteld op 250 tpm.
- Meng de cellen grondig door te vegen en om te keren en verspreid vervolgens 100 μL celoplossing op een 20 ml Luria Bouillon + Agar-selectieplaat behandeld met ampicilline in een concentratie van 0, 1 mg / ml.
- Incubeer 's nachts bij 37 °C, of totdat zichtbare kolonies zijn gegroeid.
- Breng met behulp van een elektronische pipettor 25 ml steriel NZCYM-medium over in een steriele erlenmeyer van 250 ml bij kamertemperatuur en voeg ampicilline toe aan een uiteindelijke werkconcentratie van 0,1 mg / ml.
- Breng met behulp van een steriele inentingslus één individuele kolonie over van de selectieplaat met de op de juiste wijze getransformeerde bacteriestam en voeg deze rechtstreeks toe aan de kolf met 25 ml NZCYM-media + ampicilline.
- Plaats de 25 ml NZCYM-zaadkweekkolf in een schudincubator van 37 °C met orbitale oscillatie ingesteld op 250 tpm.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om deze zaadcultuur 's nachts te kweken om een geschikte bacteriële concentratie te bereiken (~ 1,5-2,0 optische dichtheidseenheden), zoals gemeten met behulp van een spectrofotometer die is ingesteld op golflengte = 600 nm. - Breng 250 ml steriel NZCYM-medium over in vier verbijsterde kolven van 1 l en voeg het ampicilline-antibioticum toe tot een werkconcentratie van 0,1 mg / ml.
- Breng onder steriele omstandigheden 5 ml verzadigde zaadcultuur over in elk van de vier cultuurkolven van 250 ml en plaats deze in een broedmachine voor schudden op 37 °C met orbitale oscillatie ingesteld op 250 tpm.
OPMERKING: Op dit punt zal de cultuur worden aangeduid als een expansiecultuur en zal exponentiële groei worden gevolgd met behulp van een UV1800-spectrofotometer. De groei mag doorgaan totdat de optische kweekdichtheid bij 600 nm (OD600) een waarde tussen 0,6-0,8 bereikt. - Zodra de expansiecultuur de gewenste OD600-waarde van 0,6-0,8 heeft bereikt, voegt u 59,6 mg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan elke cultuur van 250 ml met kolf voor een eindconcentratie van 1 mM om eiwitexpressie te induceren. Op dit punt wordt de expansiecultuur de expressiecultuur genoemd. Begin met uitdrukken gedurende een periode van 5 uur.
- Verwijder aan het einde van de expressieperiode van 5 uur de vier kolven uit de broedmachine en pipetteer 125 ml in zes centrifugeflessen van 250 ml (totaal 750 ml).
- Balanceer elke centrifugefles om ervoor te zorgen dat de totale massa binnen ±0,5 mg van elkaar ligt.
OPMERKING: Deze stap is essentieel om een veilige werking van het centrifugeapparaat te garanderen. - Bereid het centrifugeapparaat voor door eerst de aan/uit-schakelaar in de aan-stand te zetten. Klik op de knop met het label "Set/Actual" en pas de parameters aan naar "JA-14", "9.400 x g", 20.00 min en 4 °C met behulp van de bijbehorende wijzerplaten.
- Laad de zes gebalanceerde centrifufloodlessen in een centrifugerotor van de juiste grootte en plaats ze in de centrifuge om ervoor te zorgen dat eventuele specifieke veiligheidsparameters worden gevolgd.
OPMERKING: Ga door met deze stap totdat alle bacteriële celkweek is gecentrifugeerd en supernatanten zijn verzameld. - Filter het geïsoleerde bacteriële supernatant door een vacuümfiltratie of een gelijkwaardig apparaat dat is uitgerust met een filter van 0,45 micron om achtergebleven vuil te verwijderen.
- Heparinezuivering van het recombinante apoE4-NT steigereiwit
OPMERKING: De kolomzuiveringsprocedure wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur.- Breng de Hi-trap Heparine-kolom in evenwicht door 10 kolomvolumes (50 ml) van 10 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,2 en eluteren met een snelheid van 5 ml / min toe te passen.
- Breng apoE4-NT verrijkt medium aan op de kolom met een snelheid van 2,5 ml/min totdat het volledige volume van 1 L medium is aangebracht en gooi de doorstroming weg.
- Was de kolom met 10 kolomvolumes (50 ml) van 10 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,2, en gooi de doorstroming weg.
- Elueer het gewenste apoE4-NT-eiwit door drie kolomvolumes (15 ml) elutiebuffer (10 mM natriumfosfaatbuffer + 1,5 M NaCl, pH 7,2) op de kolom aan te brengen en verzamel het eluaat.
- Dialyse van apoE4-NT eluate
- Bereid een gedeelte dialysebuizen voor (de afmetingen van de gebruikte dialysebuizen waren 22 cm lang, 12 mm inwendige diameter en 10.000 MWCO) door gedurende 10 minuten grondig te weken in gedestilleerd gedeïoniseerd (ddi) water.
- Bereid 1 l fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (10 mM natriumfosfaat + 150 mM NaCl, pH 7,2) in een plastic bekerglas van 1 l of gelijkwaardig.
- Klem met behulp van een dialyslangklem het ene uiteinde van de doorweekte dialyseslang vast, zodat de klem vastzit en er geen vloeistof kan ontsnappen.
- Steek een smalle nektrechter in het open uiteinde van de dialysebuis en giet de 15 ml apoE4-NT eluate in de dialysebuis.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om bij deze stap te controleren op eventuele lekken. - Verwijder de trechter en klem het uiteinde van de dialyseslang vast met een andere dialysebuisklem.
- Plaats een schuimdialyse-drijfveer op een van de afgesloten uiteinden van de dialysebuis en plaats de geassembleerde dialyseslang in het bekerglas met 1 L PBS-buffer.
- Plaats een magnetische roerstaaf in de bodem van het bekerglas en stel de roerregelaar in op "laag", zodat er geen vortex wordt gevormd.
- Nadat de dialyse is voltooid, decanteert u het retentaat in een conische buis van 50 ml en bewaart u deze bij -20 °C.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om deze dialyse 's nachts bij 4 °C uit te voeren.
2. Formulering van bioactieve stof die nanoschijven bevat
- Bereiding van fosfolipide-aliquot
- Weeg 5 mg van een geschikt fosfolipide (bijv. dimyristoylfosfatidylcholine [DMPC]) af en breng het over in een glazen reageerbuis.
- Los de 5 mg fosfolipide op door 300 μL CHCl 3 en 100 μL CH 3 OH toe te voegen voor een totale verhoudingvan3:1 v/v.
- Verdamp het organische oplosmiddel door de glazen reageerbuis gedurende 10-15 minuten onder een zachte stroom N2-gas te plaatsen, zodat zich een dunne film van gedroogd fosfolipide vormt langs de wanden van het onderste deel van de buis.
- Lyofilisatie van fosfolipide aliquots
- Bereid fosfolipide aliquots voor lyofilisatie door de opening van de glazen reageerbuis te bedekken met parafilm.
- Perforeer de parafilm met een naald van 24 G ongeveer 10-15 keer.
- Plaats de geperforeerde aliquots in een geschikte lyofilisatiecontainer en zorg ervoor dat het rubberen deksel correct is afgesloten.
- Bevestig de lyofilisatiecontainer aan het vacuümspruitstuk aan de bovenkant van de lyofilisatiemachine en zorg ervoor dat alle andere kleppen goed gesloten zijn.
- Schakel de lyofilisatiemachine in door de aan/uit-schakelaar om te draaien en op de vacuüminitialisatieknop te drukken.
- Nadat het systeem het totale vacuüm heeft bereikt, klikt u op de knop voor koelinitialisatie om het vriesdroogproces te starten.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat monsters 's nachts lyofibliseren.
- Formulering van amfotericine-B (amp-B) nanoschijven
- Pipetteer 0,45 ml PBS aan de gelyofiliseerde fosfolipide aliquot en vortex gedurende ~ 30 s om het lipide te verspreiden.
OPMERKING: Het resulterende monster ziet er ondoorzichtig en troebel uit. - Pipetteer 50 μL van een stockampB-oplossing van 20 mg/ml (20 mg ampB opgelost in 1 ml dimethylsulfoxide [DMSO], opgeslagen bij -20 °C in een gesloten amberkleurig vat) in het gedispergeerde fosfolipidemonster en de vortex.
OPMERKING: Bij het selecteren van een oplosmiddel dat moet worden gebruikt bij het bereiden van een stamoplossing van het hydrofobe bioactieve middel, zijn de twee overkoepelende overwegingen 1) de oplosbaarheid van het bioactieve middel en 2) de mengbaarheid van het oplosmiddel met de waterige buffer die in de formulering wordt gebruikt. Terwijl DMSO vaak wordt gebruikt 15,16,17,18,19, dimethylformamide 20,21 of tetrahydrofuran 22 zijn ook met succes gebruikt 23. - Pipetteer 0,5 ml apoE4-NT steigereiwit (concentratie van ~ 4 mg / ml) naar de glazen reageerbuis met het gedispergeerde fosfolipide en ampB. Het uiteindelijke volume van het monster moet ongeveer 1 ml zijn.
- Soniceer het monster bij 24 °C totdat de oplossing helder is (meestal 10-15 min).
- Pipetteer 0,45 ml PBS aan de gelyofiliseerde fosfolipide aliquot en vortex gedurende ~ 30 s om het lipide te verspreiden.
- Nanodisk centrifugatie
- Breng de geklaarde ampB-nanoschijfoplossing over in een steriele microcentrifugebuis van 1,7 ml.
- Plaats de buis in een tafelmodel microcentrifuge rotor met de toevoeging van een balansbuis die recht tegenover elkaar is geplaatst.
- Draai de rotordop vast en sluit het centrifugedeksel.
- Programmeer de centrifuge om gedurende 10 minuten te draaien bij ~ 11.000 x g met behulp van de overeenkomstige wijzerplaten aan de voorkant van de microcentrifuge-eenheid.
OPMERKING: Op dit punt kan een pellet zichtbaar zijn. Deze pellet bestaat uit niet-geïncorporeerd fosfolipide en/of ampB. - Verwijder het supernatant en breng het over in een andere schone microcentrifugebuis van 1,7 ml.
- Dialyse van ampB-nanodisk monster
- Bereid een gedeelte van dialysebuizen voor (de afmetingen van de gebruikte dialysebuizen waren 3 cm lang, 16 mm inwendige diameter en 10.000 MWCO) door gedurende 10 minuten grondig in ddi-water te weken.
- Bereid een PBS-bufferoplossing van 1 l (10 mM natriumfosfaat + 150 mM NaCl, pH 7,2) in een plastic bekerglas van 1 l of gelijkwaardig.
- Klem met behulp van een dialyslangklem het ene uiteinde van de doorweekte dialyseslang vast, zodat de klem vastzit en er geen vloeistof kan ontsnappen.
- Steek een smalle nektrechter in het open uiteinde van de dialysebuis en breng het ampB-nanoschijfmonster over in de dialysebuis.
- Verwijder de trechter en klem het uiteinde van de dialyseslang vast met een andere dialysebuisklem.
- Plaats een schuimdialyse-drijfveer op een van de afgesloten uiteinden van de dialysebuis en plaats de geassembleerde dialyseslang in het bekerglas met de 1 L PBS-buffer.
- Plaats een magnetische roerstaaf in de bodem van het bekerglas en stel de roerregelaar in op "laag", zodat er geen vortex wordt gevormd. Laat de dialyse 's nachts doorgaan bij 4 °C.
3. Spectrale analyse van ampB-nanoschijfmonsters
- Spectrofotometer initialisatie gevolgd door auto blank
- Schakel de spectrofotometer in door de aan / uit-schakelaar om te draaien en maak verbinding met een overeenkomstige ondersteuningscomputer door op de knop met het label "PC Control" te drukken.
- Open op de ondersteuningscomputer de software met het label "UVProbe 2.61" en maak verbinding met de spectrofotometer door op de knop met het label "Verbinden" in de linkerbenedenhoek te klikken.
- Klik op de knop met het label Spectrum op de bovenste werkbalk in de UVProbe-software.
- Klik op de knop Methode op de bovenste werkbalk.
- Klik op het tabblad Meting en voer "500" in het tekstvak Start in onder "Golflengtebereik (nm)" en "300" in het tekstvak "Einde".
- Klik op het vervolgkeuzemenu naast het tabblad met het label Scansnelheid en stel dit in op Gemiddeld.
- Bereid een blanco monster door 1 ml DMSO over te brengen in twee kwartscuvetten (QS 1.000).
- Laad beide cuvetten in de respectievelijke monsterpoorten van de spectrofotometer, klik op Autoblank en neem een spectrum op van 300-500 nm door in de linkerbenedenhoek op Start te klikken.
- Voorbereiding en spectrale analyse van de ampB-standaard
- Bereid 20 μg/ml ampB-standaard door de cuvet uit de voorste monsterpoort te verwijderen en 20 μl van een 1 mg/ml ampB-stamoplossing (20 μg ampB-totaal) toe te voegen.
- Plaats de cuvette terug in de monsterpoort van de spectrofotometer en klik op Start om de absorptie van het monster op te nemen.
- Verwijder de cuvette uit de monsterpoort en decanteer de vloeibare inhoud in een correct geëtiketteerde afvalcontainer.
- Spoel de cuvette grondig af met drie wasbeurten van gedeïoniseerd water gevolgd door drie wasbeurten met 70% ethanol.
- Voorbereiding en spectrale analyse van verstoord ampB-nanoschijfmonster
- Bereid een verstoord ampB-nanoschijfmonster (met 20 μg/ml als ampB) door 20 μL van een 1 mg/ml ampB-nanoschijfvoorraad in 1 ml DMSO te pipetteren. Incubeer gedurende ten minste 1 minuut voorafgaand aan het opnemen van het spectrum.
- Plaats de cuvette in de voorste monsterpoort van de spectrofotometer en klik op Start om de absorptie van het monster op te nemen.
- Voorbereiding en spectrale analyse van een PBS-buffer blanco
- Bereid een PBS-buffer blanco voor door 1 ml PBS-buffer over te brengen in twee kwartscuvetten (QS 1.000).
- Laad de cuvetten in de respectievelijke monsterpoorten van de spectrofotometer, klik op Autoblank en registreer het spectrum van 300-500 nm.
- Voorbereiding en spectrale analyse van een niet-verstoord ampB-nanoschijfmonster
- Bereid een niet-verstoord ampB-nanoschijfmonster (met 20 μg/ml als ampB) door de cuvette uit de voorste monsterpoort te verwijderen en 20 μl van een ampB-nanoschijfmonster van 1 mg/ml in de PBS-buffer te brengen.
- Plaats de cuvette terug in de monsterpoort van de spectrofotometer, klik op Start en neem het monsterspectrum op.
OPMERKING: Al het chemische afval moet worden verwijderd in een correct geëtiketteerde afvalcontainer volgens geaccepteerde richtlijnen.
4. Analyse van de levensvatbaarheid van gist
OPMERKING: Gist levensvatbaarheidstests werden uitgevoerd om de biologische activiteit van ampB te evalueren en te bepalen of het proces van formulering of opname in nanoschijven, de gistgroeiremmingsactiviteit beïnvloedde.
- Formuleer twee ampB-nanoschijfmonsters (eindvolume = 1 ml) om 1 mg ampB per 5 mg DMPC en 0,1 mg ampB per 5 mg DMPC te bevatten volgens de eerder beschreven methode (2,3-2,4.1).
OPMERKING: Om een 1 mg/ml en 0,1 mg/ml ampB per 5 mg DMPC te maken, pipet 50 μL en 5 μL, respectievelijk, van een 20 mg/ml ampB in DMSO-voorraad in elke monsterflacon. - Bereiding van een verzadigde gistcultuur
- Breng 25 ml steriel gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium over in een steriele conische buis van 50 ml.
- Gebruik een steriele inentingslus om een enkele Saccharomyces cerevisiae (BY4741) kolonie over te brengen in het 25 ml YPD-medium.
- Kweek de gist in een schuddende incubator ingesteld op 30 °C, met oscillatie ingesteld op 200 tpm gedurende 18 uur.
- Bereiding van individuele groeiremmingstestmonsters
- Breng 5 ml steriel YPD-medium over in 30 steriele kweekbuizen van 13 ml.
- Behandel drie sets kweekbuizen door 20, 10 en 5 μL van het 1 mg/ml ampB-nanoschijfmonster toe te voegen, wat respectievelijk 20, 10 en 5 μg ampB vertegenwoordigt.
- Behandel drie sets kweekbuizen door 20, 10 en 5 μl van het 0,1 mg / ml ampB-nanoschijfmonster toe te voegen, wat respectievelijk 2, 1 en 0,5 μg ampB vertegenwoordigt.
- Behandel vier sets kweekbuizen door 20 μL PBS, DMSO, controle rHDL (geen ampB) of 20 μg ampB in DMSO toe te voegen.
OPMERKING: Elke set kweekbuizen vertegenwoordigt een onafhankelijke replicatie. Daarom resulteert het volgen van deze methode in een totale n-waarde van n = 3.
- Initialisatie van de levensvatbaarheidstest van gist
- Start het experiment door elk monster te enten met 100 μL (2% vol/vol) van de verzadigde gistcultuur
- Kweek de gist met behulp van een schudincubator ingesteld op 30 °C, met oscillatie ingesteld op 200 tpm gedurende maximaal 18 uur.
- Metingen van de levensvatbaarheid van gist
- Schakel de spectrofotometer in door de aan/uit-schakelaar om te draaien, klik vervolgens op de knop Ga naar WL en stel de waarde in op 600 nm.
- Breng 1 ml steriel YPD-medium over in twee plastic cuvetten, laad in de respectieve monsterpoorten op de spectrofotometer en klik op Autoblank.
- Breng 1 ml van elk monster over in een plastic cuvette, zorg ervoor dat u cuvetten elke keer vervangt en laad de cuvette in de voorste monsterpoort van de spectrofotometer.
- Meet en registreer de optische dichtheid van elk monster bij 600 nm en gooi elke verbruikte cuvette weg in een correct geëtiketteerde biohazard afvalcontainer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bioactief middel nanoschijf formuleringsproces
In de beschreven ampB-nanoschijfformuleringsprocedure wordt de reactie als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder (figuur 1). Deze verandering geeft aan dat nanoschijven zijn gevormd en dat het bioactieve middel is opgelost. Vaak absorberen bioactieve stoffen licht in het zichtbare golflengtegebied (bijv. AmpB, curcumine, luteïne, co-enzym Q10) en in deze gevallen neemt het monster de kleur van het bioactieve middel aan. Zodra de monsterklaring is voltooid (meestal 5-20 minuten van de ultrasoonapparaat van het bad), wordt het monster overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,7 ml en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 11.000 x g om onoplosbaar materiaal te pelleteren. De afwezigheid van een zichtbare pellet kan worden beschouwd als een sterk bewijs dat het bioactieve middel in de nanoschijven is opgenomen. Aan de andere kant geeft het uiterlijk van een pellet aan dat gedeeltelijke of geen opname van bioactieve stoffen heeft plaatsgevonden. Indien nodig of nuttig, kunnen controleformuleringen die alleen het tweelaagse lipide- en scaffoldeiwit bevatten, parallel worden uitgevoerd en kan de mate van verduidelijking van beide monsters visueel en kwantitatief worden vergeleken met behulp van een spectrofotometer. In ieder geval wordt het monster na centrifugatie van een bioactief middel dat nanoschijven bevat, gedialyseerd tegen PBS of een andere geschikte buffer om sporen van oplosmiddel te verwijderen.
Analyse van de oplosefficiëntie van bioactieve stoffen
Om te illustreren hoe monsterabsorptie kan worden gebruikt om de oplosbaarheidsefficiëntie te bepalen, kunnen ampB-nanoschijven worden gebruikt. In eerste instantie wordt een spectrum van ampB verzameld in DMSO. Dit wordt bereikt door 20 μL uit een 1 mg/ml stockoplossing van ampB (in DMSO) toe te voegen aan een cuvette die 980 μl DMSO bevat. Het spectrum wordt vervolgens geregistreerd in het zichtbare golflengtebereik van 300-500 nm op een UV/Vis-spectrofotometer (figuur 2). Dit spectrum, verkregen in DMSO-oplosmiddel, levert drie onderscheidende absorptiemaxima op bij 372 nm, 392 nm en 415 nm, pieken die wijzen op ampB. Vervolgens wordt een absorptiespectrum van ampB-nanoschijven in PBS verzameld. Om dit spectrum te verkrijgen, wordt 20 μL ampB-nanoschijven in PBS toegevoegd aan 980 μL PBS en wordt het spectrum geregistreerd. Dit spectrum zal naar verwachting heel anders zijn, met een enkele grote absorptiepiek op een kortere golflengte, dan het spectrum waargenomen in DMSO25. Dit resultaat is te wijten aan het feit dat in PBS de ampB-nanoschijfdeeltjesstructuur intact blijft, met individuele ampB-moleculen beperkt en beperkt tot het binnenste van het hydrofobe milieu van de nanoschijfbilaag. Omdat ampB-moleculen in het monster zich in de nabijheid van andere ampB-moleculen bevinden, kunnen complexen / structuren van hogere orde zich vormen, wat resulteert in een dramatische verandering in de spectrale eigenschappen van ampB. Om de spectra van ampB geformuleerd in nanoschijven direct te vergelijken met stock ampB, wordt een 20 μL aliquot van gedialyseerde ampB-nanoschijven (in PBS) toegevoegd aan 980 μL DMSO. In dit geval leidt het DMSO-oplosmiddel tot verstoring van de structuur van de nanoschijfdeeltjes, zodat ampB geïntegreerd in de lipide bilayer van het nanoschijfmonster vrijkomt en vrij oplosbaar wordt in het DMSO-oplosmiddel. Het absorptiespectrum van dit monster moet sterk lijken op, zo niet identiek zijn aan het hierboven beschreven spectrum van voorraadversterkerB. Dit resultaat levert direct bewijs dat ampB aanwezig is en dat de chemische eigenschappen ervan niet zijn veranderd door het proces van nanoschijfformulering. In dit geval wordt verwacht dat dezelfde drie absorptiemaxima zullen worden gedetecteerd.
Biologische activiteit van ampB-nanoschijven
Om de biologische activiteit van ampB-nanoschijven te beoordelen, werden gistgroeiremmingstests uitgevoerd. De giststam BY4741 (een afstammeling van S. cerevisiae S288C stam) werd gebruikt. Na de behandeling werd de optische dichtheid van elk gistmonster gemeten bij 600 nm op een UV-1800 UV/Vis-spectrofotometer (figuur 3). De opname van drie controlemonsters (PBS, DMSO en rHDL) toonde aan dat andere nanoschijfcomponenten dan ampB geen waarneembaar effect hebben op de gistgroei. De positieve controle (20 μg ampB in DMSO) bevestigde dat ampB een efficiënte remmer van gistgroei is. Wanneer ampB-nanoschijven werden getest, werd bewijs van ampB-concentratieafhankelijke groeiremmingsactiviteit verkregen. Sekwestratie van ampB in het lipidemilieu van nanoschijfdeeltjes zorgt dus voor een verhoogde oplosbaarheid in waterige buffers, met behoud van krachtige biologische activiteit.
Figuur 1: Effect van badsonificatie op nanoschijfformulering en monsteruiterlijk. Een ampB-nanodisk (ampB-ND) monster werd bereid door 5 mg DMPC in 0,75 ml PBS te dispergeren, 1 mg ampB aan het monster toe te voegen uit een 20 mg/ml stamoplossing in DMSO, gevolgd door de toevoeging van 2 mg steigereiwit in 0,5 ml PBS (uit een 4 mg/ml stockoplossing). (A) DMPC-dispersie in PBS. (B) DMPC-dispersie in PBS na toevoeging van 1 mg ampB. (C) nanoschijfoplossing die DMPC-, ampB- en scaffold-eiwit bevat na ultrasoonapparaat in bad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: UV/Vis-absorptiespectroscopie van ampB-monsters. (A) ampB in DMSO. (B) ampB-nanoschijven (ampB-ND) in PBS. (C) ampB-nanoschijven in DMSO. Spectra werden verzameld op een UV/Vis spectrometer. Het ampB-gehalte van ampB-nanoschijfmonsters kan worden bepaald door een bekend aliquot over te brengen naar een oplossing van DMSO en de absorptie te meten bij 416 nm (ampB-extinctiecoëfficiënt bij 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van ampB op de groei van S. cerevisiae. Gist werd gekweekt bij 30 °C in afwezigheid en aanwezigheid van ampB. Controlemonsters zonder ampB omvatten PBS alleen en rHDL. Als positieve controle werd ampB toegediend in DMSO. Testformuleringen omvatten ampB-nanoschijven (ampB-ND) bij de aangegeven concentraties ampB. Na incubatie werden de optische dichtheidswaarden van het individuele monster bepaald bij 600 nm. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweeweg ANOVA-meervoudige vergelijking met een post-hoctest van Tukey. De gerapporteerde waarden zijn de gemiddelde ± standaardfout (n = 3), representatief voor drie onafhankelijke experimenten. ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bioactief middel | Molecuulgewicht (Da) | Oplosmiddel | Referentie |
| Amfotericine B | 924.1 | DMSO | 15 |
| All-trans retinoïnezuur | 300.4 | DMSO | 16 |
| Curcumine | 368.4 | DMSO | 17 |
| Nutlin 3a | 581.5 | DMSO | 21 |
| Co-enzym Q10 | 863.3 | Dimethylformamide | 20 |
| Luteïne | 568.9 | Tetrahydrofuraan | 22 |
| Sphingadieen | 297.5 | DMSO | 19 |
| Docetaxel 1 | 807.9 | - | 23 |
| 10-hydroxycamptothecine | 364.4 | DMSO | 18 |
| Simvastatine1 Zoekertjes | 418.5 | - | 24 |
| 1 Geselecteerd bioactief stof oplosmiddel werd gedroogd met fosfolipide in plaats van te worden toegevoegd aan gedispergeerde fosfolipide in buffer. | |||
Tabel 1: Bioactieve stoffen die met succes in nanoschijven zijn opgenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formulering van een bioactief middel dat nanoschijven bevat, biedt een handige methode om anders onoplosbare hydrofobe verbindingen op te lossen. Omdat de nanoschijven van het bioactieve middel van het product volledig oplosbaar zijn in waterige media, bieden ze een nuttige toedieningsmethode voor een breed scala aan hydrofobe moleculen (tabel 1). Deze omvatten kleine moleculen, natuurlijke en synthetische drugs, fytonutriënten, hormonen, enz. De formuleringsstrategie volgt meestal een standaardprotocol dat rekening moet houden met de oplosbaarheidseigenschappen van het bioactieve middel in organische oplosmiddelen. Naast het selecteren van een geschikt organisch oplosmiddel om het bioactieve middel op te lossen, zijn twee extra parameters vereist, het bereiken van een ~ 20 mg / ml stamoplossing en mengbaarheid van het oplosmiddel met waterige oplossingen. Dit is nodig omdat het mogelijk maakt om een aanzienlijke hoeveelheid bioactief middel aan het formuleringsmengsel toe te voegen zonder overtollig organisch oplosmiddel in te brengen. Mengbaarheid is belangrijk omdat fasescheiding de opname van bioactieve stoffen in de nanoschijf van het product voorkomt.
Door het bioactieve middel onmiddellijk na tweelaagse fosfolipidedispersie in de buffer van keuze te introduceren, kunnen deze componenten met elkaar interageren voordat het steigereiwit wordt toegevoegd. Voorafgaand aan en onmiddellijk na toevoeging van steigereiwit verschijnt het monster als een ondoorzichtige suspensie. Zodra de drie componenten (fosfolipide, bioactief middel en steigereiwit, in een verhouding van 5/1/2 w / w / w) echter zijn toegevoegd en het monster gedurende een voldoende lange periode wordt onderworpen aan badsonificatie bij de juiste temperatuur, verandert het uiterlijk van troebel naar helder. Als het bioactieve middel gekleurd is, zal het geklaarde monster die kleur aannemen. Het is dus gemakkelijk om de vorming van nanoschijven te detecteren door visuele inspectie.
Hoewel DMPC handig is en vaak wordt gebruikt als fosfolipide bij uitstek voor veel toepassingen, met bepaalde bioactieve stoffen, is deze fosfolipide bestand tegen nanoschijfformulering. Co-enzym Q10 nanoschijven werden bijvoorbeeld alleen gevormd wanneer eifosfatidylcholine (PC) werd gebruikt19, en evenzo voor de xanthofyl, luteïne22. Dus, terwijl DMPC vaak het fosfolipide van keuze is, is dit niet universeel. De reden waarom co-enzym Q10 en luteïne de voorkeur geven aan ei-pc kan te wijten zijn aan hun uitgebreide hydrofobe regio's, een voorkeur voor bilayers met onverzadigde vetzuren of een andere factor. Wanneer ei-pc wordt gebruikt, wordt de temperatuur van ultrasoonapparaat verhoogd tot 45 ° C tijdens ultrasoonapparaat om volledige monsterklaring te bereiken. Eenmaal geformuleerd, worden nanoschijven die bioactieve agentia bevatten gecentrifugeerd om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Er moet echter worden opgemerkt dat normaal gesproken geen neerslag ontstaat zodra optimale omstandigheden zijn bepaald en gevolgd. Vervolgens wordt het monster 's nachts tegen buffer gedialyseerd om de kleine hoeveelheid organisch oplosmiddel te verwijderen die samen met het bioactieve middel aan de formuleringsmix is toegevoegd. Na dialyse kan de nanoschijf van het product gedurende langere tijd bij 4 °C worden bewaard. Als het opgenomen bioactieve middel gevoelig is voor oxidatie, moet het nanoschijfmonster worden opgeslagen in een gesloten vat onder N2-gas .
Er zijn verschillende methoden gebruikt om te karakteriseren en te valideren dat nanoschijven daadwerkelijk zijn gevormd. Misschien wel de meest precieze methode is elektronenmicroscopie26,27. Deze techniek geeft informatie over deeltjesmorfologie, diameter en heterogeniteit van populatiegrootte. Deze methode wordt als definitief beschouwd voor de vorming van nanoschijven. Een verwante methode, atoomkrachtmicroscopie, is ook gebruikt om de eigenschappen van bioactieve agent-bevattende nanoschijvente onderzoeken 17,24,28. Voor praktische doeleinden is snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC) gelfiltratiechromatografie echter handig en meestal voldoende om de grootte (~ 200.000 Da) en homogeniteit van een bepaald bioactief middel nanoschijfmonster20,22 te karakteriseren. Zodra is vastgesteld dat nanoschijven van bioactieve stoffen zijn gevormd, is het ook belangrijk en nuttig om de oplosbaarheidsefficiëntie van het bioactieve middel te bepalen. Als het bioactieve middel karakteristieke absorptie-eigenschappen heeft bij een bepaalde golflengte, dan is UV/Vis-absorptiespectroscopie een handige methode. Een potentieel complicerende factor is de absorptie van steigereiwit bij 280 nm. Als een bepaald bioactief middel echter op een andere golflengte absorbeert, is dit geen probleem. Als een extinctiecoëfficiënt bekend is voor het bioactieve agens van belang, dan is het mogelijk om nauwkeurig de hoeveelheid bioactief middel opgelost in nanoschijven te bepalen. Anders kan een standaardcurve worden gebruikt die is afgeleid van spectra van bekende hoeveelheden van het bioactieve middel in een geschikt oplosmiddel. Alternatieve methoden zijn fluorescentiespectroscopie17,22 of high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) analyse20,24.
Het basisformuleringsproces dat wordt beschreven voor bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten, is geschikt voor een breed scala aan toepassingen. Nanoschijven met contrastmiddelen zijn bijvoorbeeld gebruikt in medische beeldvormingsstudies om de progressie van de ziekte te diagnosticeren en te beoordelen29. Een andere benadering is om lipide gemodificeerde eiwitten te integreren in de dubbellaag van nanoschijven. Lalefar et al. hebben bijvoorbeeld met succes het "Wnt" -eiwit in nanoschijven opgenomen via het inbrengen van het covalent gebonden oliezuurgedeelte30. Wnt-nanoschijven bleken vervolgens een in water oplosbaar Wnt-transportmiddel te vormen dat ex vivo expansie van hematopoëtische stamcellen kan bevorderen. In een andere studie construeerden Crosby et al. een scaffold eiwit chimaera bestaande uit apoA-I gefuseerd tot een single chain variable antibody fragment (scFv) gericht tegen het B-celoppervlakantigeen CD2031. Latere formulering van curcumine nanoschijven met α-CD20 scFv·apoA-I als de scaffold component verleende targeting aan B-cellen, waardoor de toediening van bioactieve stoffen werd verbeterd. Deze strategie biedt een nieuwe benadering om de toxiciteit geassocieerd met chemotherapeutische middelen te minimaliseren door ze specifiek op het doelceltype te richten. In een ander voorbeeld werd het synthetische kationische lipide 1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propaanchloride (DMTAP) opgenomen in de dubbellaag van nanoschijven32. Deze formuleringsstrategie verleende effectief een positief ladingskarakter aan het dubbellaagse oppervlak van de nanoschijf en bevorderde daardoor een stabiele bindingsinteractie met kort interfererend (si) RNA. siRNA-verrijkte DMTAP-nanoschijven bleken vervolgens biologische activiteit te bezitten in doelgen knockdown-studies. In nog een ander voorbeeld zijn nanoschijven geformuleerd met cardiolipine als enige fosfolipidecomponent. Van dit unieke anionische glycerofosfolipide is bekend dat het verschillende liganden bindt, waaronder het tweewaardige mineraal calcium, het hemoproteïne cytochroom c, het anthracycline antikankermiddel doxorubicine en anderen33,34,35,36. Cardiolipine nanoschijven zijn gebruikt om deze bindingsinteracties in detail te karakteriseren door gebruik te maken van de oplosbaarheidseigenschappen van nanoschijven, hun nanoschaalgrootte en de aanwezigheid van een toegankelijke cardiolipine bilayer8. Op basis van deze en andere toepassingen is het duidelijk dat nanoschijftechnologie een veelzijdig platform is voor een veelheid aan toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R37 HL-64159).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
- Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
- Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.
- Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
- Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
- Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
- Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
- Fox, C. A., Ryan, R. O.
- Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
- Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
- Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
- Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
- Jonas, A.
- Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
- Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
- Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O.
- Ghosh, M., et al.
- Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
- Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
- Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
- Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
- Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
- Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
- Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
- Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O.
- Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
- Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
- Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
- Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
- Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
- Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
- Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O.
- Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
- Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
- Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).
