Summary
ここでは、ナノディスクを含む生理活性剤の製造と特性評価について説明します。アムホテリシンBナノディスクは、プロトコルを段階的に記述するための例として取り上げられています。
Abstract
ナノディスクという用語は、二重層形成脂質、足場タンパク質、および統合された生理活性物質からなる離散型のナノ粒子を指す。ナノディスクは、円盤状の脂質二重層として編成され、その周囲は足場タンパク質、通常は交換可能なアポリポタンパク質ファミリーのメンバーによって外接される。多数の疎水性生物活性剤は、粒子の脂質二重層の疎水性環境への集積によってナノディスクに効率的に可溶化され、直径10〜20nmの範囲の粒子のほぼ均質な集団をもたらした。ナノディスクの製剤化は、個々の成分の正確な比率、各成分の適切な順次添加、続いて製剤混合物の浴超音波処理を必要とする。両親媒性足場タンパク質は、分散した二重層に自発的に接触して再編成し、脂質/生物活性物質混合物を形成して、離散的で均質なナノディスク粒子の集団を形成します。このプロセス中に、反応混合物は不透明で濁った外観から清澄化されたサンプルに移行し、完全に最適化されると、遠心分離時に沈殿物を生成しません。特性評価研究には、生物活性物質の可溶化効率、電子顕微鏡、ゲルろ過クロマトグラフィー、紫外可視(UV/Vis)吸光度分光法、および/または蛍光分光法の決定が含まれます。その後、通常、培養細胞やマウスを用いた生物活性の調査が行われます。抗生物質(すなわち、マクロライドポリエン系抗生物質アムホテリシンB)を保持するナノディスクの場合、濃度または時間の関数として酵母または真菌の増殖を阻害するそれらの能力を測定することができる。製剤化の相対的な容易さ、構成部品に対する汎用性、ナノスケールの粒子サイズ、固有の安定性、および水性溶解性により、ナノディスク技術の無数のin vitro および in vivo アプリケーションが可能になります。本稿では、疎水性生理活性剤としてアムホテリシンBを含むナノディスクを定式化し、特性評価するための一般的な方法論について説明します。
Introduction
新生円盤状高密度リポタンパク質(HDL)は、ヒト循環器系に存在するはるかに豊富な球状HDLの天然に存在する前駆細胞です。プレβHDLとも呼ばれるこれらの新生粒子は、独特で独特の構造特性を持っています1。実際、新生HDLは回転楕円体粒子として存在するのではなく、円盤状です。天然および再構成された円盤状HDLに関する広範な構造特性評価研究は、それらがアポA-Iなどの両親媒性交換可能なアポリポタンパク質(apo)によって周囲が外接するリン脂質二重層で構成されていることを明らかにしました。ヒトリポタンパク質代謝では、循環新生HDLは末梢細胞から脂質を生成し、ATP結合カセットトランスポーターA1やレシチン:コレステロールアシルトランスファーゼ2などの主要なタンパク質メディエーターに依存するプロセスで球状HDLに成熟します。このプロセスは、心臓病に対して保護的であると考えられているコレステロール逆輸送経路の重要な要素を表しています。この知識と円盤状HDLを再構成する能力を武器に、研究者はこれらの粒子をアテローム性動脈硬化症を治療するための治療的介入として採用しました3。本質的に、再構成されたHDL(rHDL)を患者に注入すると、プラーク沈着物からのコレステロール流出が促進され、胆汁酸への変換と体内からの排泄のために肝臓に戻されます。いくつかのバイオテクノロジー/製薬会社がこの治療戦略を追求しています4。
同時に、実験室でこれらの粒子を生成する能力は、新しいアプリケーションと新しい技術につながる研究活動の急増を引き起こしました。顕著な用途の1つは、天然様環境で膜貫通タンパク質を収容するためのミニチュアメンブレンとしてのrHDL粒子の使用です5。現在までに、何百ものタンパク質が円盤状rHDLにうまく取り込まれており、これらのタンパク質が受容体、酵素、トランスポーターなどとして天然の立体構造と生物学的活性の両方を保持していることが研究によって実証されています。「ナノディスク」と呼ばれるこれらの粒子は、多くの場合、高解像度で構造特性評価に適していることも示されています6。膜貫通タンパク質の研究に対するこのアプローチは、界面活性剤ミセルやリポソームを用いた研究よりも優れていると認識されており、その結果、急速に進歩しています。rHDLを形成することができる2つの異なる方法が報告されていることを認識することが重要です。「コール酸透析」法13 は、rHDL二重層5における膜貫通タンパク質の取り込みに関連する用途に普及している。本質的に、この製剤化方法は、界面活性剤コール酸ナトリウム(またはデオキシコール酸ナトリウム;ミセル分子量[MW]4,200Da)を含む緩衝液中で、リン脂質、足場タンパク質、および目的の膜貫通タンパク質を形成する二重層を混合することを含む。界面活性剤はさまざまな反応成分を効果的に可溶化し、界面活性剤が不足しているバッファーに対してサンプルを透析することができます。透析ステップでは、サンプルから界面活性剤が除去されると、rHDLが自発的に形成されます。このアプローチを使用して目的の膜貫通タンパク質をトラップする場合、生成物粒子はナノディスク5と呼ばれます。しかしながら、この方法を使用して低分子疎水性生物活性剤(MW <1,000 Da)を組み込む試みは、ほとんど成功していない。膜貫通タンパク質とは異なり、低分子生理活性物質は界面活性剤とともに透析バッグから逃げることができるため、rHDLへの取り込み効率が大幅に低下します。この問題は、配合混合物14から洗剤を省略することによって解決された。代わりに、成分は水性緩衝液に順次添加され、二重層形成脂質から始まり、ナノディスクと呼ばれるrHDLを含む安定な生理活性物質を形成する。その他は、 インビボ イメージング剤7の取り込みおよび輸送のためにrHDLを使用している。最近では、アポリポタンパク質足場とアニオン性グリセロリン脂質であるカルジオリピンからなる特殊なrHDLがリガンド結合研究に採用されています。これらの粒子は、カルジオリピンとカルシウム、シトクロムc、および抗癌剤ドキソルビシン8を含む様々な水溶性リガンドとの相互作用の研究のためのプラットフォームを提供する。
本研究の焦点は、安定に組み込まれた疎水性生理活性物質(すなわちナノディスク)を有するrHDLの製剤化にある。これらの薬剤が円盤状rHDL粒子の脂質環境に統合する能力は、それらに水溶性を効果的に付与します。このように、ナノディスクは in vivo 治療用途の可能性を秘めています。ナノディスクを製剤化する場合、個別の疎水性生物活性物質を生成物粒子にうまく取り込むためには、特定のインキュベーション/反応条件が必要であり、このレポートの目的は、特定のアプリケーションのための新規ナノディスク粒子を作成するための基礎テンプレートとして使用できる詳細な実用的な情報を提供することです。したがって、この原稿の文脈では、ナノディスクとナノディスクという用語は交換可能ではありません。ナノディスクは、その脂質二重層5に埋め込まれた膜貫通タンパク質を含むように処方されたrHDLを指すのに対し、ナノディスクという用語は、アムホテリシンB14などの低分子量(<1,000Da)疎水性生物活性剤を組み込むように処方されたrHDLを指す。
適切な足場タンパク質の獲得には、さまざまな方法が利用可能です。足場タンパク質をメーカー(apoA-I(SRP4693)やapoE4(A3234)など)から購入することは可能ですが、コストが制限要因となる場合があります。好ましいアプローチは、組換え足場タンパク質を大腸菌で発現させることである。ヒトapoA-I9、apoE410、ならびに昆虫血リンパタンパク質アポリポフォリン-III11についてのプロトコルが公開されている。本明細書に記載の実験の目的のために、組換えヒトapoE4N末端(NT)ドメイン(アミノ酸1〜183)を使用した。ヒトapoE4-NTをコードする塩基配列を合成し、ベクターコードされたpelBリーダー配列に直接隣接するpET-22b(+)発現ベクターに挿入した。この構築物は、pelBリーダー配列-apoE4-NT融合タンパク質の発現をもたらす。タンパク質合成に続いて、細菌のpelBリーダー配列は、新しく合成されたタンパク質をペリプラズム空間に誘導し、そこでリーダーペプチダーゼがpelB配列を切断します。得られたapoE4-NTタンパク質は、配列タグや尾部を持たず、その後細菌を逃がして培養培地11,12に蓄積し、下流の処理を簡素化します。
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Protocol
1. 足場タンパク質成分の変換・発現・精製
- apoE4-NT含有プラスミドによるBL21細菌形質転換
- BL21(DE3)コンピテントセルのチューブを氷上で10分間解凍します。
- すべての氷が溶けたら、50 μLの細胞を氷上の形質転換チューブに穏やかに注意深くピペットで混ぜます。
- 50 ngのプラスミドDNA(配列については、 補足表1を参照)を含む5 μLを細胞混合物に加えます。チューブを慎重に4〜5回フリックして混ぜます。ボルテックスしないでください。
- 混合物を氷上に30分間置きます。
- 混合物を正確に42°Cで10秒間ヒートショックします。
- 氷の上に5分間置きます。
- 950 μLのS.O.C.培地を室温でチューブにピペットで入れます。
- チューブを37°Cの振とうインキュベーターに60分間入れ、発振を250rpmに設定します。
- フリックと反転によって細胞を完全に混合し、100 μLの細胞溶液を0.1 mg/mLの濃度でアンピシリンで処理した20 mLのルリアブロス+寒天選択プレートに広げます。
- 37°Cで一晩、または目に見えるコロニーが成長するまでインキュベートします。
- 電子ピペッターを使用して、25 mLの滅菌NZCYM培地を室温で滅菌250 mLコニカルフラスコに移し、アンピシリンを最終使用濃度0.1 mg/mLまで加えます。
- 滅菌接種ループを使用して、適切に形質転換された細菌株を含む選択プレートから1つの個々のコロニーを移し、25 mLのNZCYM培地+アンピシリンを含むフラスコに直接加えます。
- 25 mLのNZCYM種培養フラスコを、軌道振動を250 rpmに設定した37°Cの振とうインキュベーターに入れます。
注:この種培養物を一晩増殖させて、波長= 600 nmに設定された分光光度計を使用して測定した適切な細菌濃度(~1.5-2.0光学濃度単位)に達することをお勧めします。 - 250 mLの滅菌NZCYM培地を4つの1 Lバッフルフラスコに移し、アンピシリン抗生物質を0.1 mg / mLの作業濃度まで加えます。
- 無菌条件下で、5 mLの飽和種培養物を4つの250 mL培養物を含むフラスコのそれぞれに移し、軌道振動を250 rpmに設定した37°Cの振とうインキュベーターに入れます。
注:この時点で、培養は拡大培養と呼ばれ、指数関数的成長はUV1800分光光度計を使用して監視されます。600nmにおける培養光学密度(OD600)が0.6〜0.8の間の値に達するまで増殖を進行させる。 - 拡張培養が所望のOD600 値0.6〜0.8に達したら、59.6 mgのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を各250 ml培養フラスコに最終濃度1 mMで添加し、タンパク質発現を誘導します。この時点で、拡大培養は発現培養と呼ばれる。5時間の間発現を開始する。
- 5時間の発現期間の終わりに、振とうインキュベーターから4つのフラスコを取り出し、125 mLを6本の250 ml遠心ボトル(合計750 mL)にピペットで入れます。
- 各遠心分離機ボトルのバランスを取り、総質量が互いに±0.5mg以内になるようにします。
注意: この手順は、遠心分離機の安全な操作を確保するために不可欠です。 - 最初に電源スイッチをオンの位置に切り替えて、遠心分離機を準備します。「設定/実績」というラベルの付いたボタンをクリックし、対応するダイヤルを使用してパラメータを「JA-14」、「9,400 x g」、20.00分、および4°Cに調整します。
- 6つのバランスのとれた遠心分離機ボトルを適切なサイズの遠心分離機ローターに入れ、遠心分離機に入れて、特定の安全パラメータが守られていることを確認します。
注:すべての細菌細胞培養物が遠心分離され、上清が収集されるまで、この手順を続けます。 - 分離された細菌上清を真空ろ過または0.45ミクロンフィルターを備えた同等の装置でろ過し、残留破片を除去します。
- 組換えapoE4-NT足場タンパク質のヘパリン精製
注:カラム精製手順は室温で行われます。- 10 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 7.2) を 10 mM カラム容量 (50 mL) 塗布し、5 mL/min の速度で溶出することにより、Hi-trap Heparin カラムを平衡化します。
- apoE4-NT濃縮培地を、1 L容量の培地全体が塗布されるまで2.5 mL/minの速度でカラムに塗布し、フロースルーを廃棄します。
- 10 mM リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.2 の 10 カラム容量 (50 mL) でカラムを洗浄し、フロースルーを廃棄します。
- 3カラム容量(15 mL)の溶出バッファー(10 mMリン酸ナトリウムバッファー+ 1.5 M NaCl、pH 7.2)をカラムに塗布して目的のapoE4-NTタンパク質を溶出し、溶出液を回収します。
- アポE4-NT溶出液の透析
- 蒸留脱イオン(ddi)水に10分間十分に浸漬し、透析チューブ(使用した透析チューブの寸法は長さ22cm、内径12mm、10,000MWCO)を片付けます。
- 1 Lのプラスチックビーカーまたは同等のものに1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10 mMリン酸ナトリウム+ 150 mM NaCl、pH 7.2)を準備します。
- 透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、クランプが固定され、液体が漏れないようにします。
- 細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、15 mLのapoE4-NT溶出液を透析チューブに注ぎます。
注意: このステップで漏れをチェックすることが不可欠です。 - 漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。
- 透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを1 LのPBSバッファーを含むビーカーに配置します。
- ビーカーの下部に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を「低」に調整して、渦が形成されないようにします。
- 透析が終了したら、リテンテートを50 mLのコニカルチューブにデカントし、-20°Cで保存します。
注:この透析は4°Cで一晩行うことをお勧めします。
2. ナノディスク含有生理活性物質の製剤化
- リン脂質アリコートの調製
- 5 mgの適切なリン脂質(例:.、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC])を計量し、ガラス試験管に移します。
- 300 μLのCHCl 3と100 μLのCH 3 OHを加えて、合計3:1 v / vの比率で5 mgのリン脂質を溶解します。
- ガラス試験管をN2 ガスの穏やかな流れの下に10〜15分間置き、乾燥したリン脂質の薄膜が管の底部の壁に沿って形成されるようにして有機溶媒を蒸発させる。
- リン脂質アリコートの凍結乾燥
- ガラス試験管の開口部をパラフィルムで覆うことによって、凍結乾燥用のリン脂質アリコートを調製する。
- 24 Gの針を使用してパラフィルムに約10〜15回穴を開けます。
- 穴あきアリコートを適切な凍結乾燥容器に入れ、ゴム製の蓋が正しく密閉されていることを確認します。
- 凍結乾燥容器を凍結乾燥機の上部にある真空マニホールドに取り付け、他のすべてのバルブがしっかりと閉じていることを確認します。
- 電源スイッチを切り替えて真空初期化ボタンを押して、凍結乾燥機の電源を入れます。
- システムが全真空に達したら、冷凍初期化ボタンをクリックして凍結乾燥プロセスを開始します。
注:サンプルを一晩凍結乾燥することをお勧めします。
- アムホテリシンB(amp-B)ナノディスクの製剤化
- 0.45 mLのPBSを凍結乾燥リン脂質アリコートにピペットし、ボルテックスで~30秒間、脂質を分散させます。
注:結果のサンプルは不透明で濁って見えます。 - 20 mg/mLストックampB溶液(20 mgのampBを1 mLのジメチルスルホキシド[DMSO]に溶解し、密閉された琥珀色の容器に-20°Cで保存)をピペットで分散したリン脂質サンプルとボルテックスに入れます。
注:疎水性生物活性剤のストック溶液を調製する際に使用する溶媒を選択する場合、2つの包括的な考慮事項は、1)生物活性物質の溶解度、および2)溶媒と製剤に使用される水性緩衝液との混和性です。DMSOはしばしば使用されるが15、16、17、18、19、ジメチルホルムアミド20、21またはテトラヒドロフラン22も首尾よく採用されている23。 - 0.5 mLのapoE4-NT足場タンパク質(濃度~4 mg/mL)を、分散したリン脂質とampBを含むガラス試験管にピペットで入れます。サンプルの最終容量は約1mLです。
- 溶液が透明になるまで(一般的に10〜15分)24°Cでサンプルを超音波処理します。
- 0.45 mLのPBSを凍結乾燥リン脂質アリコートにピペットし、ボルテックスで~30秒間、脂質を分散させます。
- ナノディスク遠心分離
- 清澄化したampBナノディスク溶液を滅菌済みの1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- 真向かいに配置されたバランスチューブを追加して、チューブを卓上マイクロ遠心ローターに配置します。
- ローターキャップを締め、遠心分離機の蓋を閉じます。
- マイクロ遠心分離機の前面にある対応するダイヤルを使用して、~11,000 x g で10分間回転するように遠心分離機をプログラムします。
注:この時点で、ペレットが見える場合があります。このペレットは、組み込まれていないリン脂質および/またはampBで構成されています。 - 上清を取り除き、別の清潔な1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- アンプBナノディスク試料の透析
- 透析チューブ(使用した透析チューブの寸法は長さ3cm、内径16mm、10,000MWCO)をDDI水に10分間十分に浸漬して準備します。
- 1 L PBS緩衝液(10 mM リン酸ナトリウム+ 150 mM NaCl、pH 7.2)を1 Lプラスチックビーカーまたは同等のものに調製します。
- 透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、クランプが固定され、液体が漏れないようにします。
- 細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、ampBナノディスクサンプルを透析チューブに移します。
- 漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。
- 透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを1 LのPBSバッファーを含むビーカーに配置します。
- ビーカーの下部に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を「低」に調整して、渦が形成されないようにします。透析を4°Cで一晩継続させます。
3. アンプBナノディスク試料のスペクトル解析
- 分光光度計の初期化とそれに続く自動ブランク
- 電源スイッチを切り替えて分光測色計の電源を入れ、「PC制御」というラベルの付いたボタンを押して対応するサポートコンピューターに接続します。
- サポートコンピューターで、「UVProbe 2.61」というラベルの付いたソフトウェアを開き、左下隅にある[接続]というラベルの付いたボタンをクリックして分光光度計に接続します。
- UVProbeソフトウェア内の上部のツールバーにある [スペクトル ]というラベルの付いたボタンをクリックします。
- 上部のツールバーの[ 方法 ]というラベルの付いたボタンをクリックします。
- [測定]タブをクリックし、[波長範囲(nm)]の下にある[開始]テキストボックスに「500」と入力し、[終了]テキストボックスに「300」と入力します。
- [スキャン速度]というラベルの付いたタブの横にあるドロップダウンメニューをクリックし、[中]に設定します。
- 1 mlのDMSOを2つの石英キュベット(QS 1.000)に移して、サンプルブランクを準備します。
- 両方のキュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードし、[ オートブランク]をクリックして、左下隅の[ 開始 ]をクリックして300〜500 nmのスペクトルを記録します。
- ampBスタンダードの調製とスペクトル解析
- 前面サンプルポートからキュベットを取り外し、20 μLの1 mg/mL ampBストック溶液(合計20 μg)を加えて、20 μg/mL ampB標準物質を調製します。
- キュベットを分光光度計のサンプルポートに戻し、[ 開始 ]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。
- キュベットをサンプルポートから取り出し、液体の内容物を適切なラベルの付いた廃棄物容器にデカントします。
- キュベットを脱イオン水で3回洗浄した後、70%エタノールで3回洗浄して完全にすすぎます。
- 破壊されたアンプBナノディスクサンプルの調製とスペクトル分析
- 1 mg/mL の ampB-ナノディスクストック 20 μL を 1 mL の DMSO にピペッティングして、破壊された ampB-ナノディスクサンプル (ampB として 20 μg/mL を含む) を調製します。スペクトルを記録する前に、少なくとも1分間インキュベートします。
- キュベットを分光光度計の前面サンプルポートにロードし、[ 開始 ]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。
- PBSバッファーブランクの調製とスペクトル分析
- 1 mLのPBSバッファーを2つの石英キュベット(QS 1.000)に移して、PBSバッファーブランクを調製します。
- キュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードし、 オートブランクをクリックして、300〜500nmのスペクトルを記録します。
- 非破壊アンプBナノディスクサンプルの調製とスペクトル分析
- 前面のサンプルポートからキュベットを取り出し、20 μLの1 mg/mL ampBナノディスクサンプルをPBSバッファーに導入することにより、非破壊アンプBナノディスクサンプル(ampBとして20 μg/mLを含む)を調製します。
- キュベットを分光光度計のサンプルポートに戻し、[ 開始]をクリックして、サンプルスペクトルを記録します。
注意: すべての化学廃棄物は、受け入れられたガイドラインに従って、適切にラベル付けされた廃棄物容器に廃棄する必要があります。
4.酵母生存率アッセイ分析
注:酵母生存率アッセイは、ampBの生物学的活性を評価し、製剤化またはナノディスクへの取り込みのプロセスが酵母増殖阻害活性に影響を与えるかどうかを判断するために実施されました。
- 前述の方法(2.3-2.4.1)に従って、DMPC5 mgあたり1 mgのampBとDMPC5 mgあたり0.1 mgのampBを含むように、2つのampBナノディスクサンプル(最終容量= 1 mL)を調製します。
注:DMPC5 mgあたり1 mg/mLおよび0.1 mg/mLのアンプBを作成するには、DMSOストック中の20 mg/mLアンプBをそれぞれ50 μLおよび5 μLピペットで各サンプルバイアルに入れます。 - 飽和酵母培養物の調製
- 25 mLの滅菌酵母エキス-ペプトン-デキストロース(YPD)培地を滅菌50 mLコニカルチューブに移します。
- 滅菌接種ループを使用して、単一の サッカロミセス・セレビシエ (BY4741)コロニーを25 mLのYPD培地に移します。
- 30°Cに設定した振とうインキュベーターで酵母を培養し、振動を200rpmに設定して18時間培養します。
- 個々の成長阻害アッセイサンプルの調製
- 5 mLの滅菌YPD培地を30本の滅菌済み13 mL培養チューブに移します。
- 1 mg/mL ampBナノディスクサンプルを20、10、5 μL(それぞれ20、10、5 μgのampB)を加えて、3セットの培養チューブを処理します。
- 0.1 mg/mL ampBナノディスクサンプルを20、10、5 μl(それぞれ2、1、0.5 μgのampB)を加えて、3セットの培養チューブを処理します。
- 20 μLのPBS、DMSO、コントロールrHDL(アンプBなし)、または20 μgのアンプBをDMSO中を加えて、4セットの培養チューブを処理します。
注:培養チューブの各セットは、独立した複製を表します。したがって、この方法に従うと、全体のn値はn = 3になります。
- 酵母生存率アッセイの初期化
- 各サンプルに100 μL(2% vol/vol)の飽和酵母培養液を接種して実験を開始します
- 30°Cに設定した振とうインキュベーターを使用して酵母を培養し、振動を200rpmに設定して最大18時間培養します。
- 酵母生存率測定
- 電源スイッチを切り替えて分光光度計の電源を入れ、[ Go To WL ]というラベルの付いたボタンをクリックして、値を600nmに設定します。
- 1 mLの滅菌YPD培地を2つのプラスチックキュベットに移し、分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードして、[ オートブランク]をクリックします。
- 各サンプル1 mLをプラスチックキュベットに移し、毎回キュベットを交換して、キュベットを分光光度計の前面サンプルポートにロードします。
- 各サンプルの光学密度を600 nmで測定して記録し、使用済みの各キュベットを適切にラベル付けされたバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。
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Representative Results
生理活性物質ナノディスク製剤化プロセス
説明したampB-nanodiskの製剤化手順では、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると、反応は完了したと見なされます(図1)。この変化は、ナノディスクが形成され、生理活性物質が可溶化されたことを示している。多くの場合、生物活性物質は可視波長領域の光(例えば、ampB、クルクミン、ルテイン、コエンザイムQ10)を吸収し、これらの場合、サンプルは生物活性物質の色を採用する。サンプルの清澄化が完了したら(通常、浴超音波処理の5〜20分)、サンプルを1.7mlのマイクロ遠心チューブに移し、11,000 x g で5分間遠心分離して、不溶性材料をペレット化します。目に見えるペレットがないことは、生理活性物質がナノディスクに取り込まれているという強力な証拠と見なすことができます。一方、ペレットの外観は、生理活性物質の取り込みが部分的またはまったく生じていないことを示す。必要または有用であれば、二重層形成脂質および足場タンパク質のみを含有する対照製剤を並行して行うことができ、かつ両方の試料の清澄化の程度を分光光度計を用いて目視および定量的に比較することができる。いずれの場合も、ナノディスクを含む生理活性物質の遠心分離に続いて、サンプルをPBSまたは別の適切なバッファーに対して透析して、微量の溶媒を除去します。
生理活性物質の可溶化効率の解析
サンプルの吸光度を使用して可溶化効率を決定する方法を説明するために、ampB-ナノディスクを使用できます。最初に、アンプBのスペクトルがDMSOで収集されます。これは、ampBの1 mg/mLストック溶液(DMSO中)から980 μlのDMSOを含むキュベットに20 μLを加えることによって達成されます。次に、スペクトルは、UV/Vis分光光度計で300〜500nmの可視波長範囲で記録されます(図2)。DMSO溶媒中で得られたこのスペクトルは、ampBを示す372 nm、392 nm、および415 nmで3つの特徴的な吸光度の最大値をもたらします。続いて、PBS中のampBナノディスクの吸光度スペクトルを収集する。このスペクトルを得るために、PBS中の20μLのampBナノディスクを980μLのPBSに加え、スペクトルを記録します。このスペクトルは、DMSO25で観察されたスペクトルとはかなり異なり、より短い波長に単一の主要な吸光度ピークがあると予想されます。この結果は、PBSでは、ampB-ナノディスク粒子構造がそのまま残っており、個々のampB分子がナノディスク二重層の疎水性環境の内部に閉じ込められて拘束されているためです。サンプル中のampB分子は他のampB分子に近接しているため、高次複合体/構造が形成され、ampBのスペクトル特性が劇的に変化します。ナノディスクに配合されたアンプBとストックアンプBのスペクトルを直接比較するために、透析されたアンプBナノディスク(PBS中)の20 μLアリコートを980 μLのDMSOに加えます。この場合、DMSO溶媒はナノディスク粒子構造の破壊をもたらし、ナノディスク試料の脂質二重層に集積されたampBが遊離し、DMSO溶媒に自由に溶解するようになる。このサンプルの吸光度スペクトルは、同一ではないにしても、上記のストックampBのスペクトルと非常によく似ているように見えるはずです。この結果は、ampBが存在し、その化学的性質がナノディスク製剤のプロセスによって変化していないという直接的な証拠を提供します。この場合、同じ3つの吸光度の極大が検出されることが予想される。
アンプBナノディスクの生物活性
ampB-ナノディスクの生物学的活性を評価するために、酵母増殖阻害アッセイを実施した。酵母株としてはBY4741( S. cerevisiae S288C株の子孫)を採用した。処理後、各酵母サンプルの光学密度をUV-1800 UV/Vis分光光度計で600 nmで測定しました(図3)。3つの対照サンプル(PBS、DMSO、およびrHDL)を含めると、ampB以外のナノディスク成分が酵母の増殖に識別可能な影響を及ぼさないことが示されました。ポジティブコントロール(DMSO中の20μgのampB)は、ampBが酵母増殖の効率的な阻害剤であることを確認しました。ampBナノディスクを試験したところ、ampB濃度依存的な増殖阻害活性の証拠が得られました。したがって、ナノディスク粒子の脂質環境におけるampBの隔離は、強力な生物学的活性の保持とともに、水性緩衝液溶解度の増加を可能にする。
図1:ナノディスク製剤およびサンプル外観に対する浴超音波処理の効果。 0.75 mLのPBSに5 mgのDMPCを分散させ、DMSO中の20 mg/mLストック溶液から1 mgのampBを加え、続いて0.5 mlのPBS(4 mg/mlストック溶液から)に2 mgの足場タンパク質を添加することにより、ampBナノディスク(ampB-ND)サンプルを調製しました。(A)PBS中のDMPC分散液。(B)1 mgのampBを添加した後のPBS中のDMPC分散液。(C)浴超音波処理後のDMPC、ampB、および足場タンパク質を含有するナノディスク溶液。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ampBサンプルのUV/Vis吸光度分光法。 (A)DMSO中のアンプB。(B)PBS中のアンプBナノディスク(ampB-ND)。(C)DMSO中のアンプBナノディスク。スペクトルはUV/Vis分光計で収集しました。ampBナノディスクサンプルのampB含有量は、既知のアリコートをDMSO溶液に移し、416 nmでの吸光度を測定することによって測定できます(416 nmでのampB吸光係数= 1.24 x 105 M-1 cm-1)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: S. cerevisiaeの増殖に対するampBの影響。 酵母は、ampBの非存在下および存在下で30°Cで培養した。ampBを欠く対照サンプルには、PBS単独およびrHDLが含まれていた。ポジティブコントロールとして、ampBをDMSOで投与した。試験製剤には、示された濃度のampBナノディスク(ampB-ND)が含まれていました。インキュベーション後、個々のサンプルの光学濃度値を600nmで決定した。統計的有意性は、テューキーの事後検定との二元配置分散分析多重比較を用いて決定した。報告された値は、3つの独立した実験を代表する標準誤差±平均値(n = 3)である。ns = 有意ではない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 生物活性剤 | 分子量(Da) | 溶媒 | 参考 |
| アムホテリシンB | 924.1 | ティッカー | 15 |
| オールトランス レチノイン酸 | 300.4 | ティッカー | 16 |
| クルクミン | 368.4 | ティッカー | 17 |
| ニュートリン3a | 581.5 | ティッカー | 21 |
| コエンザイムQ10 | 863.3 | ジメチルホルムアミド | 20 |
| ルテイン | 568.9 | テトラヒドロフラン | 22 |
| スフィンガジエン | 297.5 | ティッカー | 19 |
| ドセタキセル 1 | 807.9 | - | 23 |
| 10-ヒドロキシカンプトテシン | 364.4 | ティッカー | 18 |
| シンバスタチン1 | 418.5 | - | 24 |
| 1 選択された生理活性物質溶媒は、緩衝液中に分散したリン脂質に添加される代わりにリン脂質で乾燥した。 | |||
表1:ナノディスクへの生物活性物質の取り込みに成功。
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Discussion
ナノディスクを含む生理活性剤の製剤化は、そうでなければ不溶性の疎水性化合物を可溶化するための便利な方法を提供する。生成物の生理活性物質ナノディスクは水性媒体に完全に溶解するため、広範囲の疎水性分子に対する有用な送達方法を提供します(表1)。これらには、小分子、天然および合成薬、植物栄養素、ホルモンなどが含まれます。製剤戦略は通常、有機溶媒への生理活性物質の溶解特性を考慮しなければならない標準的なプロトコルに従います。生理活性物質を溶解するための適切な有機溶媒を選択することに加えて、~20 mg/mlのストック溶液を達成することと、溶媒と水溶液との混和性の2つの追加パラメータが必要です。これは、過剰な有機溶媒を導入しずに製剤混合物にかなりの量の生理活性物質を添加することを可能にするので必要である。相分離は製品ナノディスクへの生理活性物質の取り込みを妨げるため、混和性は重要です。
二重層形成リン脂質分散液の直後に生理活性物質を選択した緩衝液に導入すると、足場タンパク質を添加する前にこれらの成分が互いに相互作用することが可能になります。足場タンパク質添加の前および直後に、サンプルは不透明な懸濁液として現れます。しかし、3つの成分(リン脂質、生理活性剤、足場タンパク質、5/1/2 w / w / w比)が添加され、サンプルが十分な期間正しい温度で浴超音波処理を受けると、その外観は濁った状態から透明な状態に変わります。生理活性物質が着色されている場合、清澄化されたサンプルはその色を帯びます。これにより、ナノディスク形成を目視で検出することが容易となる。
DMPCは便利で、多くの用途に最適なリン脂質としてよく使用されますが、特定の生理活性剤とともに、このリン脂質はナノディスク製剤に抵抗します。例えば、コエンザイムQ10 ナノディスクは、卵ホスファチジルコリン(PC)が使用された場合にのみ形成され19、同様にキサントフィル、ルテイン22。したがって、DMPCはしばしば選択されるリン脂質ですが、これは普遍的ではありません。コエンザイムQ10 とルテインが卵PCを好む理由は、疎水性領域が拡張されているため、不飽和脂肪酸やその他の要因を含む二重層が好まれるためである可能性があります。卵PCが採用されている場合、超音波処理の温度は、完全なサンプル清澄化を達成するために超音波処理中に45°Cに上昇します。製剤化されると、生理活性物質含有ナノディスクを遠心分離して不溶性物質を除去する。ただし、通常、最適な条件が決定されて従うと、沈殿物は形成されないことに注意してください。続いて、サンプルをバッファーに対して一晩透析して、生理活性物質と共に製剤ミックスに添加した少量の有機溶媒を除去します。透析後、製品ナノディスクは4°Cで長期間保存できます。取り込まれた生物活性物質が酸化を受けやすい場合、ナノディスクサンプルはN2 ガス下の密閉容器に保管する必要があります。
ナノディスクが実際に形成されたことを特徴付け、検証するために、さまざまな方法が使用されてきました。おそらく最も正確な方法は電子顕微鏡法26,27です。この手法は、粒子の形態、直径、および集団サイズの不均一性に関する情報を提供します。この方法は、ナノディスク形成の決定的な方法と考えられています。関連する方法である原子間力顕微鏡法も、生理活性物質含有ナノディスクの特性を調べるために使用されています17、24、28。しかしながら、実用的な目的のためには、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)ゲル濾過クロマトグラフィーが便利であり、典型的には所与の生理活性物質ナノディスク試料のサイズ(~200,000Da)および均質性を特徴付けるのに十分である20,22。ナノディスクが形成された生物活性物質が決定されると、生物活性物質の可溶化効率を決定することも重要かつ有用である。生理活性物質が所与の波長で特徴的な吸光度特性を有する場合、UV/Vis吸光度分光法は便利な方法である。潜在的に複雑な要因の1つは、280 nmでの足場タンパク質の吸光度です。しかしながら、所与の生理活性物質が異なる波長で吸収する場合、これは問題ではない。目的の生物活性物質について吸光係数がわかっている場合、ナノディスクに可溶化された生物活性物質の量を正確に決定することが可能です。そうでなければ、適切な溶媒中の既知量の生理活性物質のスペクトルから導出された標準曲線を使用することができる。代替方法には、蛍光分光法17、22または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析20、24が含まれる。
ナノディスクを含有する生理活性剤について記載される基本的な製剤化プロセスは、広範囲の用途に適している。例えば、造影剤を含むナノディスクは、疾患29の進行を診断および評価するための医用画像研究において使用されてきた。別のアプローチは、脂質修飾タンパク質をナノディスクの二重層に統合することである。例えば、Lalefarらは、共有結合したオレイン酸部分30の挿入を介して「Wnt」タンパク質をナノディスクに組み込むことに成功した。Wntナノディスクは、続いて、造血幹細胞のex vivo拡大を促進することができる水溶性Wnt輸送ビヒクルを構成することが示された。別の研究では、クロスビーらは、B細胞表面抗原CD2031に対する一本鎖可変抗体断片(scFv)に融合したapoA−Iからなる足場タンパク質キメラを構築した。その後、足場成分としてα-CD20 scFv·apoA-Iを用いたクルクミンナノディスクの製剤化は、B細胞に標的を与え、それによって生理活性物質の送達を増強した。この戦略は、化学療法剤を標的細胞型に特異的に向けることにより、化学療法剤に関連する毒性を最小限に抑えるための新しいアプローチを提供します。別の例では、合成カチオン性脂質1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパンクロリド(DMTAP)をナノディスク32の二重層に取り込んだ。この製剤化戦略は、ナノディスク二重層表面に正電荷特性を効果的に付与し、それによって、短い干渉(si)RNAとの安定した結合相互作用を促進した。その後、siRNAに富むDMTAPナノディスクは、標的遺伝子ノックダウン研究で生物学的活性を有することが示されました。さらに別の例では、ナノディスクは、唯一のリン脂質成分としてカルジオリピンを用いて製剤化されている。このユニークなアニオン性グリセロリン脂質は、二価ミネラルカルシウム、ヘムタンパク質シトクロムc、アントラサイクリン系抗がん剤ドキソルビシンなど、さまざまなリガンドと結合することが知られています33、34、35、36。カルジオリピンナノディスクは、ナノディスクの溶解特性、それらのナノスケールサイズ、およびアクセス可能なカルジオリピン二重層の存在を利用して、これらの結合相互作用を詳細に特徴付けるために使用されてきました8。これらおよび他のアプリケーションに基づいて、ナノディスク技術が多数のアプリケーションのための汎用性の高いプラットフォームであることは明らかです。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(R37 HL-64159)からの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
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