Method Article

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

DOI:

10.3791/65231

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Abstract

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Makrophagen stellen eine entscheidende Verteidigungslinie dar und sind dafür verantwortlich, das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben zu verhindern. Die konidiale Phagozytose ist ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse ermöglicht, die an Makrophagen-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts von internalisierten Konidien. Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Die Evasion der Phagozytose und die Flucht der Phagosomen sind Mechanismen der Pilzvirulenz. Hier berichten wir über die Methoden, die für die Analyse der Phagozytose, der Clearance und der Lebensfähigkeit von T. stromaticum conidia verwendet werden können, einem Pilz, der als biologisches Schädlingsbekämpfungs- und Biodüngemittel verwendet wird und in der Lage ist, menschliche Infektionen zu induzieren. Das Protokoll besteht aus 1) Trichoderma-Kultur, 2) Waschen zur Gewinnung von Konidien, 3) der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung der Polysaccharose-Lösungsmethode und der Differenzierung der PBMCs in Makrophagen, 4) einer In-vitro-Phagozytose-Methode unter Verwendung runder Glasdeckgläser und Färbung und 5) einem Clearance-Assay zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien nach Konidienphagozytose. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken verwendet werden können, um die Effizienz der Pilzbeseitigung von Makrophagen zu messen.

Introduction

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Die Gattung Trichoderma (Ordnung: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) besteht aus ubiquitären, saprophytischen Pilzen, die Parasiten anderer Pilzarten sind und in der Lage sind, eine Reihe kommerziell nützlicher Enzyme zu produzieren1. Diese Pilzarten werden für die Herstellung von heterologen Proteinen2, die Herstellung von Zellulose3, Ethanol, Bier, Wein und Papier4, in der Textilindustrie5, der Lebensmittelindustrie6 und in der Landwirtschaft als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel 7,8 verwendet. Neben dem industriellen Interesse an diesen Pilzarten hat die steigende Zahl von Infektionen beim Menschen einigen Trichoderma-Arten den Status opportunistischer Krankheitserreger verliehen9.

Trichoderma spp. wächst schnell in der Kultur, mit anfänglich weißen und watteartigen Kolonien, die sich grünlich-gelb bis dunkelgrün verfärben10. Sie sind an ein breites Spektrum von pH- und Temperaturbedingungen angepasst, und die opportunistischen Arten sind in der Lage, bei physiologischem pH-Wert und Temperaturen zu überleben und so verschiedene menschliche Gewebe zu besiedeln 11,12,13. Wichtig ist, dass der Anstieg der Infektionsrate von Trichoderma spp. mit Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden kann, und diese sind nicht gut untersucht. Darüber hinaus sind Studien, die sich auf das Verständnis der Immunantwort gegen opportunistische Trichoderma-Arten konzentrieren, noch selten.

Während einer Infektion stellen Makrophagen zusammen mit Neutrophilen die Verteidigungslinie dar, die für die Phagozytose verantwortlich ist, und verhindern so das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben. Mit Hilfe von Mustererkennungsrezeptoren, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren und C-Typ-Lektinrezeptoren, phagozytieren Makrophagen Pilze und verarbeiten sie zu Phagolysosomen, wodurch ein Atemausbruch, die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und die Zerstörung der phagozytozytierten Mikroorganismen gefördert werden14. Der Mechanismus der Phagozytose kann jedoch durch verschiedene mikrobielle Strategien, wie z. B. die Größe und Form der Pilzzellen, beeinflusst und umgangen werden. das Vorhandensein von Kapseln, die die Phagozytose behindern; Verringerung der Anzahl der Phagozytose-induzierenden Rezeptoren; der Umbau der Struktur der Aktinfasern im Zytoplasma; Behinderung der Bildung von Pseudopodien; und Phagosom oder Phagolysosom entweichen nach dem Phagozytoseprozess14.

Viele Krankheitserreger, darunter Cryptococcus neoformans, nutzen Makrophagen als Nische, um im Wirt zu überleben, sich zu verbreiten und Infektionen zu induzieren15. Der Phagozytose- und Clearance-Assay wird verwendet, um die Immunantwort gegen Krankheitserreger zu bewerten und die mikrobiellen Strategien zu identifizieren, die eingesetzt werden, um das angeborene Immunsystem zu umgehen 15,16,17. Diese Art von Technik kann auch verwendet werden, um die differentielle Kinetik von Phagozytose, verzögerter Phagosomenversauerung und oxidativem Ausbruch zu untersuchen, die zu einer reduzierten Pilzabtötung führen18.

Verschiedene Methoden können verwendet werden, um die Phagozytose, das Überleben der Pilze und die Umgehung des Phagosomenreifungsprozesses zu bewerten. Dazu gehören die Fluoreszenzmikroskopie, mit der die Phagozytose, die zelluläre Lage und die während der Phagozytose produzierten Moleküle beobachtetwerden 19; Durchflusszytometrie, die quantitative Daten zur Phagozytose liefert und zur Bewertung der verschiedenen am Prozess beteiligten Marker verwendet wird20,21; intravitale Mikroskopie, die zur Beurteilung des mikrobiellen Einfangs und der Phagosomenreifung verwendet wird22; Antikörper-vermittelte Phagozytose, die verwendet wird, um die Spezifität des Phagozytoseprozesses für einen Krankheitserreger zu beurteilen23; und andere 24,25,26,27.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendet eine gängige, kostengünstige und direkte Methode, bei der ein optisches Mikroskop und ein Plattenwachstumsassay verwendet werden, um die Phagozytose und Abtötung von Pilzkonidien zu beurteilen. Dieses Protokoll bietet den Lesern Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung des Phagozytose- und Clearance-Assays mit mononuklearen Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut, die T. stromaticum ausgesetzt sind. PBMCs wurden verwendet, weil Trichoderma-Konidien als biologischer Schädlingsbekämpfungsmittel gegen Phytopathogene und als Biodünger für Pflanzenkulturen weltweit eingesetzt werden und mehrere Infektionen beim Menschen verursacht haben, die als Trichodermose bezeichnet werden. Darüber hinaus gibt es bisher nur zwei Arbeiten, die sich mit der Interaktion zwischen Trichoderma conidia und dem menschlichen Immunsystem befassen, in denen wir Neutrophile28 und Autophagie in Makrophagen29 untersucht haben. Dieser Artikel zeigt zunächst, wie die Phagozytose der Konidien von T. stromaticum durch PBMC-abgeleitete Makrophagen untersucht werden kann, und dann, wie die Lebensfähigkeit der verschlungenen Konidien mit einfachen mikroskopiebasierten Techniken beurteilt werden kann. Dieses Protokoll kann Untersuchungen zur Makrophagen-assoziierten Immunantwort oder zu Mechanismen im Zusammenhang mit der Modulation des Immunsystems weiter erleichtern.

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Protocol

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Ethische Überlegungen und menschliche Subjekte
Alle in dieser Studie beschriebenen Experimente mit Menschen wurden gemäß der Deklaration von Helsinki und den brasilianischen Bundesgesetzen durchgeführt und von der Ethikkommission der Staatlichen Universität Santa Cruz genehmigt (Projektkennung: 550.382/ 2014).

Menschliches peripheres Blut wurde von gesunden Freiwilligen aus der Stadt Ilhéus, Bahia, Brasilien, entnommen, die keinen beruflichen Aktivitäten ausgesetzt waren, die mit dem untersuchten Pilz in Verbindung standen. Personen mit berichteten gesundheitlichen Problemen oder der Einnahme von Medikamenten wurden ausgeschlossen. Alle Probanden erklärten sich freiwillig zur Teilnahme bereit und unterschrieben eine Einverständniserklärung, bevor sie in diese Studie aufgenommen wurden.

1. Herstellung der Reagenzien und Lösungen

HINWEIS: Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Lösungen vor, bevor Sie fortfahren. In der Materialtabelle (TOM) finden Sie Informationen zum Reagenz und zum Materiallieferanten.

  1. Bereiten Sie 1x (PBS) eine ausgewogene sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung zu.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde kein endotoxinfreies PBS verwendet.
  2. Bereiten Sie Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium vor und gießen Sie 20 ml in jede Petrischale für die T. stromaticum-Kultur . Bereiten Sie sechs Platten mit PDA für jeden Spender vor und verwenden Sie eine Platte für jede Erkrankung: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h. Verwenden Sie außerdem drei Platten für jede Kontrolle: drei für die Trichoderma-Kontrolle und drei für die R10-Medium-Kontrolle. Verwenden Sie Petrischalen von 60 mm x 15 mm oder 100 mm x 15 mm für eine optimale Konidienerholung.
  3. 100% Glycerin sterilisieren.
  4. Bereiten Sie ein R10-Medium für die Zellkultur vor: RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Antibiotikum (Penicillin/Streptomycin).
  5. Sterilisieren Sie destilliertes Wasser für die Zelllyse.
  6. Bereiten Sie Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 für den Färbeprozess vor.
    HINWEIS: Falls erforderlich, stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und Lösungen von 0,1 M/L NaOH und 0,1 M/L HCl ein.
  7. Rundes Deckglas (13 mm) und Pinzette sterilisieren.

2. Kultur und Verarbeitung von Trichoderma stromaticum

  1. Herstellung eines Mutterstocks (M1) von T. stromaticum:
    ANMERKUNG: Ein Muttertier (M1) ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Versuche aus der Kultur derselben frischen Generation (F1) durchgeführt werden.
    1. Züchten Sie ein T. stromaticum-Inokulum in Petrischalen mit PDA bei 28 °C im Dunkeln für 7-10 Tage, bis die Konidien beobachtet werden und die Kultur grün wird.
    2. Waschen Sie die Kultur von T. stromaticum. Geben Sie 3-5 ml PBS mit einer Pipette auf die Kulturoberfläche. Sammeln Sie das PBS von der Platte und geben Sie es erneut über die Kultur, um die Konidien mit der Pipette allmählich zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang so oft wie nötig, bis die Aufhängung dunkelgrün wird.
      HINWEIS: Alternativ wird ein sanftes Waschen der Kultur durch Zugabe von 3-5 ml PBS auf die Platte und anschließende Durchführung einer kreisenden Bewegung empfohlen, bis die Suspension grün wird, um die Konidien zurückzugewinnen. Durch wiederholtes Pipettieren können mehr Konidien gesammelt werden.
    3. Die gewonnene Suspension von der Platte wird mit einer Pipette in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.3 so oft wie nötig, um mehr Konidien zu erhalten.
    4. Die Suspension wird bei 1.160 x g für 5 min bei 12 °C zentrifugiert und das Pellet in 5 ml PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Schritt (2.1.4) dreimal, um eine hyphenfreie Aufhängung zu erhalten.
      HINWEIS: Um das Pellet richtig zu resuspendieren, wird nach der Zentrifugation ein kurzes Vortexen empfohlen.
    5. Resuspendieren Sie das fertige Pellet in 2-3 ml PBS und zählen Sie die Konidien in einer Neubauer-Kammer mit einer Verdünnung von 1:100 oder 1:1.000.
      HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen kann eine Endkonzentration von 2 x 108 Konidien/ml aus der Kultur gewonnen werden. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien mit der Trypanblau-Ausschlussmethode ist optional.
    6. Aliquotieren Sie die Suspension in sterile 1,5-ml-Röhrchen, indem Sie 0,5 ml der Konidiensuspension (aus Schritt 2.1.5) in jedes Röhrchen geben. Fügen Sie dann 0,5 ml steriles 100%iges Glycerin hinzu, um M1-Vorräte zu erhalten. Kurz vortexen, die Röhrchen identifizieren und bei −20 °C oder −80 °C lagern.
  2. Kultivierung von T. stromaticum und Gewinnung von Konidien für das Experiment
    1. Platte 10 μl der M1-Suspension (hergestellt in Schritt 2.1) in PDA bei 28 °C im Dunkeln für 7-10 Tage, bis die Konidien beobachtet werden und die Kultur grün wird, um die frische F1-Generation zu erhalten.
      HINWEIS: Um eine frische T. stromaticum-Kultur für das Experiment zu gewährleisten, ist die für das Pilzwachstum und die für die Makrophagendifferenzierung erforderliche Zeit zu bewerten.
    2. Sammeln Sie die Konidien und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.4.
    3. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 2-3 ml PBS. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Konidien mit der Trypanblau-Ausschlussmethode oder zählen Sie die Konidien wie in Schritt 2.1.5 beschrieben.

3. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

ANMERKUNG: Die PBMCs werden nach der Dichtebarrierenmethode unter Verwendung einer Polysaccharoselösung mit einer Dichte von 1,077 g/ml30 erhalten.

  1. Aliquotieren Sie 15 ml der Polysaccharoselösung in ein 50-ml-Röhrchen für jede Spenderprobe, die entnommen wird.
  2. Entnehmen Sie 20 ml Blut von jedem Spender mit drei bis vier EDTA-Röhrchen. Rekrutieren Sie mindestens vier Spender pro Experiment. Das Blut der Spender darf nicht gepoolt werden. Verwenden Sie stattdessen jede Probe separat als biologisches Replikat. Für jeden Spender wird das Blut in ein 50-ml-Röhrchen überführt und PBS hinzugefügt, um ein Endvolumen von 35 ml zu erhalten.
  3. Die Blutspritze (Schritt 3.2) wird langsam entlang der Wand des Röhrchens mit der Polysaccharoselösung (Schritt 3.1) übertragen, um eine zweiphasige Suspension zu bilden.
    HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich das Blut mit der Polysaccharoselösung vermischt, fügen Sie das Blut langsam hinzu. Es wird empfohlen, mindestens 7 ml Blut von jedem Spender für die PBMC-Isolierung zu verwenden.
  4. Das Röhrchen mit der biphasischen Suspension wird sofort bei 1.600 x g für 30 min bei 24 °C zentrifugiert. Programmieren Sie die Zentrifugation der PBMCs: Verwenden Sie die Beschleunigung 1 und die Verzögerung 0, um ein abruptes Stoppen der Zentrifugation zu vermeiden.
  5. Beobachten Sie die Bildung eines weißen Rings, der die PBMCs nach der Zentrifugation enthält. Die roten Blutkörperchen und Granulozyten befinden sich in der unteren Schicht, die nächste Schicht enthält die Polysaccharoselösung und die PBMCs befinden sich im weißen Ring zwischen der Polysaccharoselösung und dem Plasma (obere Schicht). Sammeln Sie den weißen Ring, indem Sie vorsichtig mit einer Pipette oder einer sterilen Pasteur-Pipette absaugen, um keine roten Blutkörperchen, Plasma oder Polysaccharoselösung auffangen, und in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
  6. Geben Sie PBS in das 15-ml-Röhrchen, das die PBMCs enthält, um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Die Suspension wird homogenisiert und das Röhrchen bei 1.600 x g für 30 Minuten bei 24 °C zentrifugiert.
  7. Die Zellen werden dreimal bei 1.600 x g für 5 Minuten bei 24 °C mit 10 ml PBS gewaschen. Anschließend wird das endgültige Pellet in 2 ml R10-Medium resuspendiert.
  8. Beurteilen Sie die Zellviabilität mit der Trypanblau-Ausschlussmethode und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer.

4. Phagozytose-Kinetik

HINWEIS: Die mononukleär abgeleiteten Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes werden mit T. stromaticum conidia bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1:10 oder nur R10-Medium als Kontrolle behandelt. Die Multiplizität der Infektion (MOI) stellt das Verhältnis der zu den Infektionszielen hinzugefügten Infektionserreger dar und wird als absolute Zahlen dargestellt: MOI = Erreger:Ziele31. Hier verwenden wir 1 T. stromaticum conidia (Wirkstoff) für 10 Makrophagen (Targets). Anschließend werden die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für verschiedene Zeiträume (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) inkubiert. Als nächstes wird ein rundes Deckglas aus Glas verwendet, um die adhärenten Makrophagen, die am Phagozytoseprozess beteiligt sind, unter dem Mikroskop sichtbar zu machen. Es wird eine experimentelle Abbildung zur Verfügung gestellt (Abbildung 1).

HINWEIS: Es wird empfohlen, 24-Well-Platten zu verwenden.

  1. Behandlung von humanen Makrophagen mit T. stromaticum-Konidien
    1. Geben Sie ein steriles rundes Deckglas (13 mm) mit einer sterilen Pinzette in jede Vertiefung.
    2. Passen Sie das Volumen der in den Schritten 3.7-3.8 erhaltenen Zellsuspension auf die Platte 8 x 105 Zellen pro Vertiefung auf ein Endvolumen von 1 ml mit R10-Medium an. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die Zellmorphologie zu beurteilen.
      HINWEIS: Die Zellen müssen im Medium suspendiert sein und eine abgerundete Morphologie aufweisen.
    3. Die Zellen werden bei 37 °C unter einer 5%igenCO2-Atmosphäre für 7 Tage inkubiert und das Medium alle 2 Tage durch frisches R10-Medium ersetzt, um die Monozyten in Makrophagen zu differenzieren32. Beobachten Sie die Zellmorphologie mit einem inversen Mikroskop. Die Makrophagen weisen eine spindelförmige Morphologie mit abgeflachten und ausgedehnten Formen auf; Ein erhöhtes zytoplasmatisches Verhältnis und das Vorhandensein von Pseudopodien können ebenfalls beobachtet werden. Suchen Sie nach anhaftenden mononuklearen Makrophagen.
      HINWEIS: Ein sehr kleiner Anteil undifferenzierter Monozyten kann im Medium suspendiert bleiben.
    4. Entfernen Sie das Medium jeder Vertiefung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS, um Ablagerungen und nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    5. Die in Schritt 2.2 hergestellte Suspension wird verwendet, um eine neue Suspension von T. stromaticum conidia in einer Endkonzentration von 8 x 104 Konidien/ml in R10-Medium herzustellen.
    6. Man fügt 1 ml der in Schritt 4.1.5 hergestellten Konidiensuspension in jede Behandlungsvertiefung (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) hinzu, um ein Trägheitsmoment von 1:10 zu erhalten. Zu den Kontrollen nur 1 ml R10-Medium in die Vertiefung geben.
    7. Die Makrophagen werden 3 h lang mit T. stromaticum conidia bei 37 °C unter einer 5%igen CO2 -Atmosphäre getestet. Entfernen Sie nach 3 Stunden das Medium und waschen Sie die Zellen, um die nicht phagozytierten Konidien zu entfernen.
    8. Geben Sie 1 ml R10-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für verschiedene Zeiten (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) bei 37 °C unter einer 5%igen CO2 -Atmosphäre.
  2. Färbung und Analyse
    1. Nach Abschluss der entsprechenden Inkubation (Schritt 4.1.8) wird das Medium aus jeder Vertiefung entnommen und 1 ml PBS in diese Vertiefung gegeben.
    2. Entfernen Sie die runden Glasdeckgläser mit einer sterilen Pinzette und einer Nadel zum Färben mit einem Färbeset aus den Vertiefungen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Färbung auch mit der Mai-Grünwald-Giemsa-Färbung33 erfolgen.
    3. Geben Sie zu jedem der runden Deckgläser Fleckenfixateur (5 s), Farbstoff 1 (5 s), Farbstoff 2 (2 s) und gepuffertes Wasser pH 7,0 (5 s), die Bestandteile des Färbekits. Warten Sie, bis sie trocken sind, und fixieren Sie die Deckgläser mit einem Passiermittel auf einem Objektträger.
    4. Quantifizieren Sie das Ergebnis: Zählen Sie insgesamt 100 Makrophagen (Mø) für jede Zeitbedingung. Zählen Sie mit einem Lichtmikroskop die Anzahl der Makrophagen mit phagozytierten Konidien mit einem 100-fachen Objektiv und Immersionsöl (Gleichung [1]).
      figure-protocol-1 (1)
    5. Ermitteln Sie die Anzahl der phagozytierten Konidien pro Makrophage: Korrelieren Sie die in 100 Makrophagen vorhandenen Konidien dividiert durch die Anzahl der Makrophagen mit mindestens einem phagozytierten Konidium (Gleichung [2])34.
      figure-protocol-2 (2)
      HINWEIS: Um die Konidien auszuwerten und zu zählen, kann die ImageJ-Software verwendet werden35.
    6. Fotografieren Sie die Phagozytose von jeder Probe und jeder Zeitbedingung mit 40x- und 100x-Objektiven, um die Ergebnisse zu präsentieren.

figure-protocol-3
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Phagozytose- und Konidialviabilitätstests unter Verwendung von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut. (1-10) Phagozytose-Assay: Das T. stromaticum muss in PDA gezüchtet werden, und die Konidien werden durch Waschen der Platte mit PBS gewonnen. Die PBMCs sollten mit der Dichtebarrieremethode unter Verwendung des beschriebenen Protokolls isoliert, in 24-Well-Platten mit sterilen Rundglas-Deckgläsern für 7 Tage zur Differenzierung in Makrophagen kultiviert und dann mit einem MOI von 1:10 mit unterschiedlichen Zeitintervallen behandelt werden. Die runden Deckgläser aus Glas werden entfernt und mit dem Färbekit gefärbt und die Ergebnisse lichtmikroskopisch analysiert. (1-8,11-13) Conidia Viability Assay: Nach der Isolierung werden die PBMCs in 24-Well-Platten ohne runde Deckgläser für 7 Tage zur Differenzierung in Makrophagen kultiviert und dann mit einem MOI von 1:10 für verschiedene Zeitintervalle behandelt. Die Zellen müssen durch Inkubation mit destilliertem Wasser lysiert werden; Die Suspension wird dann zentrifugiert, und dann wird das resuspendierte Pellet in PDA plattiert, um die Wachstumskinetik von Trichoderma zu analysieren. Diese Abbildung wurde anhand einer Bilddatenbank erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Conidialer Viabilitätstest nach Phagozytose

HINWEIS: Es wird eine experimentelle Entwurfsabbildung bereitgestellt (Abbildung 1).

HINWEIS: Verwenden Sie 24-Well-Platten.

  1. Fordern Sie die vom Menschen stammenden Makrophagen mit T. stromaticum conidia heraus.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.8, um die Monozyten zu differenzieren, und behandeln Sie die Makrophagen mit T. stromaticum conidia.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine runden Deckgläser aus Glas in den Vertiefungen. Verwenden Sie die gleichen Zeitintervalle, die für die Bestimmung der Phagozytosekinetik verwendet werden, damit die Phagozytose mit der konidialen Lebensfähigkeit korreliert werden kann.
    2. Den Einfluss des R10-Mediums auf das Wachstum von T. stromaticum zu bewerten, indem Wells mit der in Schritt 4.1.5 hergestellten Suspension (R10-Medium + Konidien) als Kontrolle verwendet werden.
  2. Konidialer Viabilitätstest
    1. Entfernen Sie das Medium nach jeder Inkubationszeit (3 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden und 120 Stunden) und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um die Konidien zu entfernen, die nicht phagozytiert wurden.
      HINWEIS: Die Kontrolle, die R10-Medium + Konidien enthält, sollte nicht gewaschen werden.
    2. Geben Sie 0,5 ml steriles destilliertes Wasser in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 für 30 Minuten. Nach dieser Zeit beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert wurden.
    3. Sammeln Sie die Suspension und füllen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen um. Zentrifugieren Sie die Suspension mit einer Minizentrifuge bei 6.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    4. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, resuspendieren Sie das Pellet in 10 μl sterilem destilliertem Wasser und inokulieren Sie 10 μl der Suspension bei 28 °C im Dunkeln in die PDA-haltige Platte.
    5. Bereiten Sie eine Positivkontrolle für das Wachstum von T. stromaticum vor: Verwenden Sie die Suspension von T. stromaticum conidia (Schritt 2.2), um eine neue Suspension mit einer Endkonzentration von 8 x 106 Konidien/ml herzustellen. Platte 10 μl dieser Suspension in PDA bei 28 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: 10 μl dieser Suspension enthalten die gleiche Anzahl von Konidien (8 x 104), die zur Infektion der mononuklearen Makrophagen im Blut verwendet wurde. Der Unterschied zwischen dieser Positivkontrolle und der in Schritt 5.1.2 erwähnten besteht darin, dass die oben in Schritt 5.1.2 erwähnte Kontrolle verwendet wird, um den möglichen Einfluss des R10-Mediums auf das Trichoderma-Wachstum während der Zeit der Phagozytose zu bewerten. Diese Positivkontrolle in Schritt 5.2.5 unter Verwendung der in PBS gesammelten Suspension von T. stromaticum conidia stellt eine Kontrolle für das Trichoderma-Wachstum ohne den Einfluss von R10-Medium dar, um das natürliche Wachstum des Pilzes widerzuspiegeln. Mit dieser Kontrolle kann beurteilt werden, ob das R10-Medium das Trichoderma-Wachstum beeinflusst.
    6. Beobachten Sie jeden Tag die Wachstumskinetik von T. stromaticum in PDA und fotografieren Sie die Kultur.
    7. Analyse: Zur Bewertung der Ergebnisse können zwei Punkte herangezogen werden: 1) die Zeit (in Tagen), die die Kultur benötigt, um die gesamte Kulturplatte zu besetzen, und 2) die Zeit (in Tagen) bis zum Auftreten der charakteristischen grünen Pigmentierung der T. stromaticum conidia in Kultur.

6. Statistische Analyse

  1. Verwenden Sie einen Kruskal-Wallis-Test, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den 8 Gruppen/Behandlungen zu ermitteln. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. In den Abbildungen gibt # die statistische Signifikanz bei p < 0,05 an.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Wir haben die Phagozytose von T. stromaticum conidia verwendet, um die Lebensfähigkeit der Konidien nach Phagozytose zu beurteilen, da die Evasion der Phagozytose und das Entweichen von Phagosomen Mechanismen der Pilzvirulenz sind. Forscher sollten diese Techniken als einen der ersten Assays durchführen, wenn sie eine Spezies von klinischem Interesse unter...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für verschiedene pilzliche Krankheitserreger, darunter Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans und andere, ist die Konidial- oder Hefephagozytose ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse in Makrophagen-Erreger-Interaktionen sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts der internalisierten Konidien ermöglicht 14,39,40. Die Phagozytose ist der ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte vorliegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von folgenden brasilianischen Finanzierungsinstitutionen unterstützt: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) mit Zuschüssen RED0011/2012 und RED008/2014. U.R.S., J.O.C. und M.E.S.M. erkennen das Stipendium der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) bzw. der FAPESB an.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL ZentrifugenröhrchenCorningCLS43147015 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, konischer Boden mit Deckel, einzeln steril
24-Well Zellkulturplatte mit flachem Boden KasviK12-024Aus Polystyrol mit alphanumerischer Kennzeichnung; Die Zellkulturplatte ist DNase-, RNase- und pyrogenfrei und frei von zytotoxischen Substanzen; Sterilisiert durch Gammastrahlung;
Zellkultur-CO2-InkubatorSanyo303082Ein CO2-Inkubator dient dazu, körperähnliche Bedingungen zu schaffen und zu kontrollieren und so das in vitro Wachstum und die Proliferation verschiedener Zelltypen zu ermöglichen.
Zentrifuge Mikroröhrchen (Eppendorf-Typ) 1,5 mLCapp5101500Hergestellt aus Polypropylen, mit einer am Röhrchen befestigten Kappe zum Öffnen und Schließen mit nur einer Hand. Es hat eine polierte Innenseite gegen Proteinanhaftung und für die Sichtbarkeit der Probe, da es frei von DNase, RNase und Pyrogenen
ist Zirkuläres Deckglas 15 mmOlenK5-0015Kreisförmige Deckgläser werden für Mikroskopietechniken in Zellkulturen verwendet. Hergestellt aus supertransparentem, durchscheinendem Glas; mit einer Dicke von 0,13 mm
II Typ B2 (Total Exhaust) BiosicherheitswerkbänkeEsco Lifesciences Gruppe2010274Airstream Klasse II Typ B2 (AB2) bieten Produkt-, Bediener- und Umweltschutz und eignen sich für Arbeiten mit Spuren von giftigen Chemikalien und Arbeitsstoffen, die den biologischen Sicherheitsstufen I, II oder III zugeordnet sind. In einem Schrank der Klasse II Typ B2 wird die gesamte Zu- und Abluft nach der HEPA/ULPA-Filterung ohne Rückführung über die Arbeitsfläche an die äußere Umgebung abgeführt.
Dextrose-Kartoffel-Agar-MediumMerck145Kartoffel-Dextrose-Agar wird bei der Kultivierung und Zählung von Hefen und Pilzen verwendet
EDTA-Vakuum-BlutentnahmeröhrchenFirstLabFL5-1109LEDTA ist das empfohlene Antikoagulans für hämatologische Routinen, da es das beste Antikoagulans zur Erhaltung der Zellmorphologie ist.
EntellanMerck1.07961 Fixiermittel; Entellan ist ein wasserloses Eindeckmedium für die dauerhafte Einbettung in der Mikroskopie.
Fötales KälberserumGibcoA2720801Fötales Kälberserum (FBS) ist a  Universelle Wachstumsergänzung von Zell- und Gewebekulturmedien. FBS ist ein natürlicher Cocktail aus den meisten Faktoren, die für die Anhaftung, das Wachstum und die Proliferation von Zellen erforderlich sind und für die meisten Arten von menschlichen und tierischen Zellen (einschließlich Insektenzellen) wirksam sind.
Flaticon  Datenbank mit Bildern
GlycerinMerck24900988Das Kryoprotektivum Glycerin wird zum Einfrieren von Zellen und Sporen verwendet
Histopaque-1077Polysaccharose-Lösung
Bild J  Bildanalysesoftware
Mikroskopie-ObjektträgerPrecision7105Objektträger für die Mikroskopie 26 x 76 mm Matt geläppt Dicke 1,0 bis 1,2 mm. Hergestellt aus speziellem optischem Glas und verpackt mit Seidenpapiertrenner mit hochwertiger Transparenz ohne Unvollkommenheiten
Mini-ZentrifugePrismC1801Die Prism Mini-Zentrifuge wurde so konzipiert, dass sie extrem kompakt ist und einen außergewöhnlich geringen Platzbedarf hat. Enthält 2 austauschbare Schnellwechselrotoren, die sich bis zu 6000 U/min drehen. Eine elektronische Bremse sorgt für eine schnelle Verzögerung und der selbstöffnende Deckel ermöglicht einen einfachen Zugang zur Probe, wodurch die Handhabungszeit verkürzt wird.
Neubauer KammerKasviK5-0011Die Neubauer Zählkammer dient zum Zählen von Zellen oder anderen Schwebstoffen.
Panoptic schnell Laborclin620529Laborclin's panoptic fast c ist ein Kit für die Schnellfärbung in der Hämatologie
Penicillin/Streptomycin Lösung - 10.000ULGC- Biotechnologie BR3011001Antibiotikum wird verwendet, um eine mögliche Kontamination durch Manipulationen außerhalb der laminaren Strömung zu vermeiden.
Petrischale 90 x 15 mm SmoothCralplast18248Einweg-Petrischale; Hergestellt aus hochtransparentem Polystyrol (PS); flacher Boden; Glatt; Maße: 90 x 15 mm.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific10010001PBS ist eine Kochsalzlösung auf Wasserbasis mit einer einfachen Formulierung. Es ist isotonisch und für die meisten Zellen ungiftig. Es enthält Natriumchlorid- und Phosphatpuffer und ist so formuliert, dass es einen osmotischen Schock verhindert und gleichzeitig den Wasserhaushalt der lebenden Zellen aufrechterhält.
Pipette Pasteur 3 mL SterileAccumaxAP-3-B-SSTERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML Pipette mit 3 mL Fassungsvermögen, hergestellt aus transparentem Polyethylen niedriger Dichte (LDPE) und einzeln steril
KühlzentrifugeThermo ScientificTS-HM16RDie Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Kühlzentrifuge ist eine gekühlte Zentrifuge mit dem benutzerfreundlichen Bedienfeld, das eine einfache Voreinstellung der Geschwindigkeit, des RCF-Werts, Laufzeit  Temperatur und Laufprofil. Die Megafuge 16R erreicht Höchstgeschwindigkeiten von  15.200 U/min und maximale RZB von 25.830 x g.
RPMI-1640 MediumMerckMFCD00217820HEPES Modification, mit L-Glutamin und 25 mM HEPES, ohne Natriumbicarbonat, Pulver, geeignet für Zellkultur
Die Einkanal-MikropipettenEppendorfZ683809Einkanal-Mikropipetten werden zum präzisen Transfer und zur Messung sehr kleiner Mengen von Flüssigkeiten eingesetzt.
Spitze für MikropipetteCorning4894Kapazität von 10 & Mikro; L und 1.000 µ L Autoklavierbares
triokulares inverses MikroskopLABOMEDVU-7125500Es ermöglicht Ihnen, Zellen in Röhrchen und Flaschen zu beobachten, ohne sie öffnen zu müssen, wodurch Kontaminationsprobleme vermieden werden.
Klasse Die Biosicherheitswerkbänke der

References

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