Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Summary

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Abstract

Makrophagen stellen eine entscheidende Verteidigungslinie dar und sind dafür verantwortlich, das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben zu verhindern. Die konidiale Phagozytose ist ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse ermöglicht, die an Makrophagen-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts von internalisierten Konidien. Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Die Evasion der Phagozytose und die Flucht der Phagosomen sind Mechanismen der Pilzvirulenz. Hier berichten wir über die Methoden, die für die Analyse der Phagozytose, der Clearance und der Lebensfähigkeit von T. stromaticum conidia verwendet werden können, einem Pilz, der als biologisches Schädlingsbekämpfungs- und Biodüngemittel verwendet wird und in der Lage ist, menschliche Infektionen zu induzieren. Das Protokoll besteht aus 1) Trichoderma-Kultur, 2) Waschen zur Gewinnung von Konidien, 3) der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung der Polysaccharose-Lösungsmethode und der Differenzierung der PBMCs in Makrophagen, 4) einer In-vitro-Phagozytose-Methode unter Verwendung runder Glasdeckgläser und Färbung und 5) einem Clearance-Assay zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien nach Konidienphagozytose. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken verwendet werden können, um die Effizienz der Pilzbeseitigung von Makrophagen zu messen.

Introduction

Die Gattung Trichoderma (Ordnung: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) besteht aus ubiquitären, saprophytischen Pilzen, die Parasiten anderer Pilzarten sind und in der Lage sind, eine Reihe kommerziell nützlicher Enzyme zu produzieren¹. Diese Pilzarten werden für die Herstellung von heterologen Proteinen², die Herstellung von Zellulose³, Ethanol, Bier, Wein und Papier⁴, in der Textilindustrie⁵, der Lebensmittelindustrie⁶ und in der Landwirtschaft als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel ^7,8

Protocol

Ethische Überlegungen und menschliche Subjekte
Alle in dieser Studie beschriebenen Experimente mit Menschen wurden gemäß der Deklaration von Helsinki und den brasilianischen Bundesgesetzen durchgeführt und von der Ethikkommission der Staatlichen Universität Santa Cruz genehmigt (Projektkennung: 550.382/ 2014).

Menschliches peripheres Blut wurde von gesunden Freiwilligen aus der Stadt Ilhéus, Bahia, Brasilien, entnommen, die keinen beruflichen Aktivitäten ausgesetzt waren, die mit dem untersuchten Pilz in Verbindung standen. Personen mit berichteten gesundheitlichen Problemen oder der Einnahme von Medikamenten wurden ausg....

Results

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Wir haben die Phagozytose von T. stromaticum conidia verwendet, um die Lebensfähigkeit der Konidien nach Phagozytose zu beurteilen, da die Evasion der Phagozytose und das Entweichen von Phagosomen Mechanismen der Pilzvirulenz sind. Forscher sollten diese Techniken als einen der ersten Assays durchführen, wenn sie eine Spezies von klinischem Interesse unter.......

Discussion

Für verschiedene pilzliche Krankheitserreger, darunter Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans und andere, ist die Konidial- oder Hefephagozytose ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse in Makrophagen-Erreger-Interaktionen sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts der internalisierten Konidien ermöglicht 14,39,40. Die Phagozytose ist der .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Zentrifugenröhrchen	Corning	CLS431470	15 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, konischer Boden mit Deckel, einzeln steril
24-Well Zellkulturplatte mit flachem Boden Kasvi		K12-024	Aus Polystyrol mit alphanumerischer Kennzeichnung; Die Zellkulturplatte ist DNase-, RNase- und pyrogenfrei und frei von zytotoxischen Substanzen; Sterilisiert durch Gammastrahlung;
Zellkultur-CO2-Inkubator	Sanyo	303082	Ein CO2-Inkubator dient dazu, körperähnliche Bedingungen zu schaffen und zu kontrollieren und so das in vitro Wachstum und die Proliferation verschiedener Zelltypen zu ermöglichen.
Zentrifuge Mikroröhrchen (Eppendorf-Typ) 1,5 mL	Capp	5101500	Hergestellt aus Polypropylen, mit einer am Röhrchen befestigten Kappe zum Öffnen und Schließen mit nur einer Hand. Es hat eine polierte Innenseite gegen Proteinanhaftung und für die Sichtbarkeit der Probe, da es frei von DNase, RNase und Pyrogenen
ist Zirkuläres Deckglas 15 mm	Olen	K5-0015	Kreisförmige Deckgläser werden für Mikroskopietechniken in Zellkulturen verwendet. Hergestellt aus supertransparentem, durchscheinendem Glas; mit einer Dicke von 0,13 mm
II Typ B2 (Total Exhaust) Biosicherheitswerkbänke	Esco Lifesciences Gruppe	2010274	Airstream Klasse II Typ B2 (AB2) bieten Produkt-, Bediener- und Umweltschutz und eignen sich für Arbeiten mit Spuren von giftigen Chemikalien und Arbeitsstoffen, die den biologischen Sicherheitsstufen I, II oder III zugeordnet sind. In einem Schrank der Klasse II Typ B2 wird die gesamte Zu- und Abluft nach der HEPA/ULPA-Filterung ohne Rückführung über die Arbeitsfläche an die äußere Umgebung abgeführt.
Dextrose-Kartoffel-Agar-Medium	Merck	145	Kartoffel-Dextrose-Agar wird bei der Kultivierung und Zählung von Hefen und Pilzen verwendet
EDTA-Vakuum-Blutentnahmeröhrchen	FirstLab	FL5-1109L	EDTA ist das empfohlene Antikoagulans für hämatologische Routinen, da es das beste Antikoagulans zur Erhaltung der Zellmorphologie ist.
Entellan	Merck	1.07961	Fixiermittel; Entellan ist ein wasserloses Eindeckmedium für die dauerhafte Einbettung in der Mikroskopie.
Fötales Kälberserum	Gibco	A2720801	Fötales Kälberserum (FBS) ist a  Universelle Wachstumsergänzung von Zell- und Gewebekulturmedien. FBS ist ein natürlicher Cocktail aus den meisten Faktoren, die für die Anhaftung, das Wachstum und die Proliferation von Zellen erforderlich sind und für die meisten Arten von menschlichen und tierischen Zellen (einschließlich Insektenzellen) wirksam sind.
Flaticon			Datenbank mit Bildern
Glycerin	Merck	24900988	Das Kryoprotektivum Glycerin wird zum Einfrieren von Zellen und Sporen verwendet
Histopaque-1077			Polysaccharose-Lösung
Bild J			Bildanalysesoftware
Mikroskopie-Objektträger	Precision	7105	Objektträger für die Mikroskopie 26 x 76 mm Matt geläppt Dicke 1,0 bis 1,2 mm. Hergestellt aus speziellem optischem Glas und verpackt mit Seidenpapiertrenner mit hochwertiger Transparenz ohne Unvollkommenheiten
Mini-Zentrifuge	Prism	C1801	Die Prism Mini-Zentrifuge wurde so konzipiert, dass sie extrem kompakt ist und einen außergewöhnlich geringen Platzbedarf hat. Enthält 2 austauschbare Schnellwechselrotoren, die sich bis zu 6000 U/min drehen. Eine elektronische Bremse sorgt für eine schnelle Verzögerung und der selbstöffnende Deckel ermöglicht einen einfachen Zugang zur Probe, wodurch die Handhabungszeit verkürzt wird.
Neubauer Kammer	Kasvi	K5-0011	Die Neubauer Zählkammer dient zum Zählen von Zellen oder anderen Schwebstoffen.
Panoptic schnell	Laborclin	620529	Laborclin's panoptic fast c ist ein Kit für die Schnellfärbung in der Hämatologie
Penicillin/Streptomycin Lösung - 10.000U	LGC- Biotechnologie	BR3011001	Antibiotikum wird verwendet, um eine mögliche Kontamination durch Manipulationen außerhalb der laminaren Strömung zu vermeiden.
Petrischale 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Einweg-Petrischale; Hergestellt aus hochtransparentem Polystyrol (PS); flacher Boden; Glatt; Maße: 90 x 15 mm.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010001	PBS ist eine Kochsalzlösung auf Wasserbasis mit einer einfachen Formulierung. Es ist isotonisch und für die meisten Zellen ungiftig. Es enthält Natriumchlorid- und Phosphatpuffer und ist so formuliert, dass es einen osmotischen Schock verhindert und gleichzeitig den Wasserhaushalt der lebenden Zellen aufrechterhält.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML Pipette mit 3 mL Fassungsvermögen, hergestellt aus transparentem Polyethylen niedriger Dichte (LDPE) und einzeln steril
Kühlzentrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	Die Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Kühlzentrifuge ist eine gekühlte Zentrifuge mit dem benutzerfreundlichen Bedienfeld, das eine einfache Voreinstellung der Geschwindigkeit, des RCF-Werts, Laufzeit  Temperatur und Laufprofil. Die Megafuge 16R erreicht Höchstgeschwindigkeiten von  15.200 U/min und maximale RZB von 25.830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, mit L-Glutamin und 25 mM HEPES, ohne Natriumbicarbonat, Pulver, geeignet für Zellkultur
Die Einkanal-Mikropipetten	Eppendorf	Z683809	Einkanal-Mikropipetten werden zum präzisen Transfer und zur Messung sehr kleiner Mengen von Flüssigkeiten eingesetzt.
Spitze für Mikropipette	Corning	4894	Kapazität von 10 & Mikro; L und 1.000 µ L Autoklavierbares
triokulares inverses Mikroskop	LABOMED	VU-7125500	Es ermöglicht Ihnen, Zellen in Röhrchen und Flaschen zu beobachten, ohne sie öffnen zu müssen, wodurch Kontaminationsprobleme vermieden werden.