Summary
Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.
Abstract
DNA-eiwit crosslinks (DPC's) zijn frequente, alomtegenwoordige en schadelijke DNA-laesies, die voortkomen uit endogene DNA-schade, enzymen (topoisomerases, methyltransferasen, enz.) die niet goed functioneren, of exogene agentia zoals chemotherapeutica en crosslinking-middelen. Zodra DPC's zijn geïnduceerd, worden verschillende soorten posttranslationele modificaties (PTM's) onmiddellijk aan hen geconjugeerd als vroege responsmechanismen. Het is aangetoond dat DPC's kunnen worden gewijzigd door ubiquitine, kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMO) en poly-ADP-ribose, die de substraten primen om hun respectieve aangewezen reparatie-enzymen te signaleren en, in sommige gevallen, de reparatie op opeenvolgende manieren te coördineren. Omdat PTM's snel transpireren en zeer omkeerbaar zijn, was het een uitdaging om PTM-geconjugeerde DPC's te isoleren en te detecteren die meestal op lage niveaus blijven. Hier wordt een immunoassay gepresenteerd om ubiquityleerde, SUMOylated en ADP-ribosylated DPC's (drug-induced topoisomerase DPCs en aldehyde-geïnduceerde niet-specifieke DPC's) in vivo te zuiveren en kwantitatief te detecteren. Deze test is afgeleid van de RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay die wordt gebruikt voor de isolatie van genomisch DNA dat DPC's bevat door ethanol precipitatie. Na normalisatie en nucleasevertering worden PTM's van DPC's, waaronder ubiquitylatie, SUMOylatie en ADP-ribosylatie, gedetecteerd door immunoblotting met behulp van hun overeenkomstige antilichamen. Deze robuuste test kan worden gebruikt om nieuwe moleculaire mechanismen te identificeren en te karakteriseren die enzymatische en niet-enzymatische DPC's repareren en heeft het potentieel om kleine molecuulremmers te ontdekken die zich richten op specifieke factoren die PTM's reguleren om DPC's te repareren.
Introduction
Genomische DNA-schade treedt op als gevolg van spontaan verval, interne schade en omgevingsfactoren1. De resulterende DNA-laesies bestaan uit beschadigde basen, mismatches, enkel- en dubbelstrengsbreuken, inter- en intrastreng crosslinks en DNA-eiwit crosslinks (DPC's). Een DPC wordt gevormd wanneer een chromatine-gebonden eiwit wordt gevangen op DNA door covalente koppeling. DPC's worden geïnduceerd door endogene DNA-laesies en reactieve metabolieten, evenals exogene middelen zoals chemotherapeutica en bifunctionele crosslinkingmiddelen. Onder bepaalde omstandigheden kan enzymdisfunctie ook leiden tot de vorming van DPC's2. Het enorme verschil in DPC-inductoren resulteert in een verschil in de identiteit van het covalent-gebonden eiwit, het chromosoomgebied waar de DPC wordt gevormd, het structuurtype van het DNA dat aan het eiwit is gekoppeld en de chemische eigenschap van de covalente koppeling tussen het eiwit en DNA 2,3,4.
Op basis van hun chemische aard worden DPC's over het algemeen ingedeeld in twee groepen: enzymatische DPC's en niet-enzymatische DPC's. Bepaalde enzymen zoals topoisomerases, glycosylasen en methyl / acyltransferasen werken door reversibele enzym-DNA covalente tussenproducten te vormen tijdens hun normale katalytische reacties. Dit zijn kortlevende enzym-DNA-tussenproducten en kunnen worden omgezet in langlevende enzymatische DPC's wanneer ze worden gevangen door endogene of exogene agentia, met name door chemotherapeutica3. Topoisomerase DPC's behoren tot de meest voorkomende enzymatische DPC's in eukaryote cellen, die kunnen worden gegenereerd door klinisch bruikbare topoisomeraseremmers (topotecan en irinotecan voor topoisomerase I [TOP1] en etoposide en doxorubicine voor topoisomerase II [TOP2]) en zijn de primaire therapeutische mechanismen van deze remmers 5,6. DNA-methyltransferasen (DNMT) 1, 3A en 3B zijn het doelwit van 5-aza-2'-deoxycytidine (ook bekend als decitabine) en vormen DPC's bij blootstelling aan het geneesmiddel7. Reactieve stoffen, evenals ultraviolet licht en ioniserende straling, induceren niet-enzymatische DPC's door niet-specifiek eiwitten te koppelen aan DNA. Reactieve aldehyden zoals aceetaldehyde en formaldehyde (FA) worden vaak gegenereerd als bijproducten van cellulair metabolisme, waaronder FA wordt geproduceerd bij micromolaire concentraties tijdens methanolmetabolisme, lipideperoxidatie en histondemethylatie. FA is ook een wereldwijd geproduceerde chemische stof met een hoog volume, waaraan veel mensen zowel ecologisch als beroepsmatig worden blootgesteld 8,9.
Zowel enzymatische als niet-enzymatische DPC's zijn zeer giftig voor cellen, omdat hun omvangrijke eiwitcomponenten op efficiënte wijze bijna alle op chromatine gebaseerde processen belemmeren, inclusief replicatie en transcriptie, wat leidt tot celcyclusstilstand en apoptose als ze niet worden hersteld. In de afgelopen twee decennia is de reparatie van DPC's krachtig bestudeerd en zijn verschillende eiwitten / routes geïdentificeerd als sleutelfactoren die DPC's direct repareren of hun reparatieprocessen moduleren. Het is bijvoorbeeld algemeen vastgesteld dat proteolyse van de eiwitmassa van een DPC een cruciale stap is in DPC-reparatie en dat proteolyse kan worden gekatalyseerd door de proteasen SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17 of het 26S-proteasoomcomplex 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 op een celtype- of cellulaire contextafhankelijke manier. Identificatie en karakterisering van deze proteasen zijn grotendeels gebaseerd op het in vivo complex van de enzym (ICE) assay28,29 en de snelle benadering van DNA adduct recovery (RADAR) assay30,31, die beide DNA-moleculen en hun covalent gebonden eiwitten isoleren uit vrije cellulaire eiwitten om de detectie van DPC's door slot-blot mogelijk te maken met behulp van antilichamen gericht op de crosslinked eiwitten. Ook werd de ingesloten agarose DNA-immunostaining (TARDIS) -test gebruikt als een middel om DPC's op het niveau van één cel te detecteren en te kwantificeren32. Momenteel kiezen onderzoekers de RADAR-test boven de ICE-test om DPC's te meten, omdat de ICE-test afhankelijk is van de zuivering van nucleïnezuren met behulp van cesiumchloridegradiënt ultracentrifugatie, wat extreem tijdrovend is, terwijl de RADAR-test nucleïnezuren neerslaat met ethanol binnen een veel kortere periode.
In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs naar voren gekomen dat meerdere posttranslationele modificaties (PTM's) betrokken zijn bij de signalering en rekrutering van DPC-gerichte proteasen 3,33,34,35. Bijvoorbeeld, zowel TOP1- als TOP2-DPC's bleken te worden geconjugeerd door kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMO) -2/3 en vervolgens SUMO-1 door het SUMO E3-ligase PIAS4, onafhankelijk van DNA-replicatie en transcriptie. De sequentiële SUMO-modificaties lijken een doelwit te zijn van ubiquitine, dat wordt afgezet op de SUMOylated TOP-DPC's en polymere ketens vormt door zijn lysine 48-residu door een SUMO-gericht ubiquitine-ligase genaamd RNF4. Vervolgens ontlokt het ubiquitinepolymeer een signaal aan en rekruteert het 26S-proteasoom naar TOP-DPCs23,36. Dezelfde SUMO-ubiquitine-route bleek onlangs te werken op DNMT1-DPC's en PARP-DNA-complexen voor hun reparatie37,38. Bovendien is SUMO-onafhankelijke ubiquitylatie door het ubiquitine E3-ligase TRAIP gemeld om DPC's te primen voor proteasomale afbraak op een replicatie-gekoppelde manier39. Net als bij de proteasomale afbraak van TOP-DPC's, vereist proteolyse van enzymatische en niet-enzymatische DPC's door de replicatie-gekoppelde metalloprotease SPRTN ook alomtegenwoordigheid van de DPC-substraten als een mechanisme om SPRTN40,41 in te schakelen. Afbakening van de rol van SUMOylation en ubiquitylatie vereist de detectie van DPC's die zijn gemarkeerd met deze PTM's. Aangezien de originele ICE-test en RADAR-test afhankelijk zijn van slot-blot / dot-blot-apparatuur om onverteerde DNA-monsters te meten, is geen van deze twee assays in staat om PTM-geconjugeerde DPC-soorten met verschillende molecuulgewichten op te lossen en te visualiseren. Om dit probleem op te lossen, verteerden we de DNA-monsters na hun zuivering door ethanolprecipitatie en monsternormalisatie met microkokkennuclease, een DNA- en RNA-endo-exonuclease om de verknoopte eiwitten vrij te geven, waardoor we de eiwitten en hun covalente PTM's konden oplossen met natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). De elektroforese stelde ons in staat om PTM-geconjugeerde DPC's te detecteren en te kwantificeren met behulp van specifieke antilichamen gericht op de PTM's. We noemden deze verbeterde methode aanvankelijk de DUST-assay, om de robuustheid ervan bij de detectie van ubiquityleerde en SUMOylated TOP-DPCste benadrukken 23. Later breidden we het gebruik van de test uit om ADP-ribosylering van TOP1-DPC's in vivo kwantitatief te beoordelen, met behulp van antilichamen tegen poly-ADP-ribosepolymeren20.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de test die alomtegenwoordige, SUMOylated en ADP-ribosylated DPC's detecteert en meet, die is geoptimaliseerd voor de gemodificeerde TOP-DPC's die worden geïnduceerd door hun remmers en niet-specifieke / niet-enzymatische DPC's die worden geïnduceerd door FA. Deze test isoleert PTM-geconjugeerde DPC's door cellen te lyseren met een chaotroop middel, DNA neer te slaan met ethanol en de anders verknoopte eiwitten en hun modifiers vrij te geven met microkokkennuclease. De anders DNA-gebonden eiwitten en hun PTM's worden gekwantificeerd door immunoblotting met behulp van specifieke antilichamen. Deze test effent een nieuwe weg om de moleculaire mechanismen op te helderen waarmee de cel zowel enzymatische als niet-enzymatische DPC's repareert. In het bijzonder maakt het gedetailleerde studies mogelijk van de inductie en kinetiek van PTM's die belangrijk zijn voor de regulatie van TOP-DPC-afbraak en -reparatie, en maakt het dus de ontdekking mogelijk van nieuwe factoren zoals E3-ligases die de PTM's dicteren, evenals remmers die zich op deze factoren richten. Aangezien sommige van de PTM's die verantwoordelijk zijn voor TOP-DPC-reparatie waarschijnlijk betrokken zijn bij de reparatie van DPC's geïnduceerd door andere chemotherapeutica, zoals op platina gebaseerde geneesmiddelen22, heeft deze test ook het potentieel voor toepassing op de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen en rationele optimalisatie van combinatorische therapieën met topoisomeraseremmers of op platina gebaseerde antineoplastics in patiëntcellen om behandelingsregimes te begeleiden.
Protocol
1. Celkweek en medicamenteuze behandeling in de humane embryonale nier 293 (HEK293) cellijn
- Bereid kweekmedium, Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% 2 mM L-glutamine en 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine.
- Zaai 1 x 10 6 cellen in een 60 mm plaat of een6-well plaat per behandelingsconditie plus controle.
- Behandel de cellen de volgende dag met DPC-inductoren naar keuze.
- Om TOP1-DPC's en hun alomtegenwoordigheid en SUMOylation te induceren, voegt u de TOP1-remmer camptothecine bij 20 μM toe aan de cellen en verzamelt u de cellen na 20, 60 en 180 minuten.
- Om TOP2α en β-DPC's en hun alomtegenwoordigheid en SUMOylatie te induceren, stelt u de cellen bloot om de TOP2-remmer etoposide bij 200 μM aan de cellen toe te voegen en verzamelt u de cellen op 20, 60 en 180 minuten.
- Om niet-enzymatische DPC's en hun alomtegenwoordigheid en SUMOylation te induceren, voegt u FA toe bij 1 mM en verzamelt u de cellen 2 uur na de blootstelling.
- Om de PARylatie van TOP1-DPC's te induceren, moet u de cellen gedurende 1 uur voorbehandelen om dePARylatie te blokkeren met poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) -remmer PDD00017273 bij 10 μM, gevolgd door co-behandeling met 20 μM camptothecine gedurende 20, 60 en 180 minuten.
2. Isolatie en normalisatie van DNA dat verknoopte eiwitten bevat
- Zuig de media na de behandeling snel op met een zuigpipet en spoel de cellen af met ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Lyseer de cellen onmiddellijk in 600 μL DNAzol-reagens met 1x proteaseremmer, 1 mM dithiothreitol (DTT) en 20 mM N-ethylmaleimide (remmer van deSUMOylating en deubiquitylating enzymen).
- Roer de plaat langzaam op een trillend platform gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voeg 1/2 volume 100% koude ethanol (0,3 ml) rechtstreeks toe aan de plaat en herhaal stap 2.2 totdat ondoorzichtig nucleïnezuuraggregaat zichtbaar wordt. Breng het cellysaat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en onderwerp de buis gedurende 15 minuten bij 4 °C aan een centrifugatie met maximale snelheid (20.000 x g) om het nucleïnezuur en zijn verknoopte eiwitten neer te slaan.
- Zuig het supernatant op met behulp van een zuigpipet en was de nucleïnezuurkorrel in 1 ml 75% ethanol gevolgd door 2 minuten centrifugeren van 20.000 x g bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op, draai met dezelfde snelheid naar beneden en verwijder de resterende vloeistof met behulp van een P20-pipet. Droog de pellet 5 minuten aan de lucht.
- Los de nucleïnezuurkorrel snel op in 0,1 ml ddH2O. Resuspendeer de pellet door herhaald pipetteren en incubeer vervolgens in een waterbad van 37 °C totdat de pellet opzwelt tot ten minste drie keer groter (ongeveer 30 minuten).
- Soniceer de monsters met een ultrasone processorsonde met een amplitude van 30% gedurende 10 s om de pellet volledig op te lossen.
- Optionele stap: Behandel de monsters met RNase A/T1 mengsel (10 μg RNase A en 25 U RNase T1) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat en twee volumes ijskoude 100% ethanol toe aan de buis, gevolgd door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 10 minuten om het DNA op te halen. Verwijder het supernatant en los het neergeslagen DNA op in 0,1 ml ddH2O.
- Optionele stap: Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 20.000 x g en breng het supernatant over in een nieuwe buis.
- Kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van een ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectrometer. De typische DNA-opbrengst is ongeveer 600-800 ng / μL. De A260/A280-verhouding moet na RNA-verwijdering worden verlaagd van 2,0-2,1 naar 1,8-1,9.
- Pas de concentratie van het DNA aan op 400-500 ng/μL in 0,12 ml ddH 2 O. Breng 20 μL van het monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis als onverteerde DNA-belastingscontrole (zie stap2.4).
- Om het DNA opgelost in de resterende 100 μL ddH 2 O te verteren, voegt u 2.000 geleenheden microkokkennuclease samen met 1/10 volume (~ 11 μL) 10x calciummicrokokkennucleasereactiebuffer toe aan het monster. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
3. Western blotting van verteerde DNA-monsters
- Voeg 4x Laemmli monsterbuffer toe en kook het monster vervolgens 5 min.
- Laad 5-6 μg verteerd monster (~ 15 μL) op 4% -20% polyacrylamidegel, gevolgd door SDS-PAGE42 om ongewijzigde en PTM-geconjugeerde DPC's op te lossen.
- Om FA-geïnduceerde niet-enzymatische DPC-soorten te detecteren, incubeer je de gel met Coomassie blue vlek 's nachts bij kamertemperatuur. Was de gel met ddH 2 O gedurende2uur en verkrijg een beeld met behulp van een beeldvormingssysteem.
- Breng de gel over en incubeer de membranen een nacht bij 4 °C met de juiste verdunningen van primaire antilichamen in de blokkeringsbuffer.
- Om alomtegenwoordigheid te detecteren, maakt u een 1:100 verdunning van anti-ubiquitine-antilichaam.
- Om SUMO-1 of SUMO-2/3 modificatie te detecteren, maakt u een 1:250 verdunning van anti-SUMO-1 of anti-SUMO-2/3 antilichaam.
- Om ADP-ribosylatie te detecteren, maakt u een 1:500 verdunning van anti-PAR-antilichaam.
- Om totale TOP1-, TOP2α- of TOP2β-DPC's te detecteren, maakt u een 1:500 verdunning van anti-TOP1, anti-TOP2α of anti-TOP2β antilichaam.
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over antilichaamverdunning.
- Incubeer een 1x PBS-T (0,1% tween 20) gewassen membraan met een secundair antilichaam verdund 5.000-voudig in blokkerende buffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Ontwikkel het membraan met enhanced chemiluminescence (ECL) reagens en verkrijg een beeld met behulp van het beeldvormingssysteem.
4. Slot-blotting van onverteerde DNA-monsters
- Verdun het onverteerde DNA-monster van 20 μL in 180 μL natriumfosfaatbuffer (25 mM, pH 6,6).
- Snijd het nitrocellulosemembraan (0,45 μm) en balanceer gedurende 5 minuten in de natriumfosfaatbuffer.
- Monteer het slot-blot-apparaat volgens de instructies van de fabrikant en sluit het aan op een vacuümsysteem.
- Was de putjes met natriumfosfaatbuffer door het vacuüm aan te brengen. Zorg ervoor dat er geen lekken van de putten is.
- Stop het vacuüm en belast 200 μL DNA per monster (1 μg). Vul de lege putten met 200 μL natriumfosfaatbuffer.
- Breng het vacuüm aan.
- Wanneer alle putten volledig leeg zijn, stopt u het vacuüm, laadt u 200 μL natriumfosfaatbuffer in elke put en herhaalt u stap 4.6.
- Haal het membraan en blok met 5% blokkeringsbuffer gedurende 0,5 uur bij kamertemperatuur.
- Sonde met anti-dubbelstrengs DNA (dsDNA) antilichaam bij een verdunning van 1:5.000 's nachts bij 4 °C.
- Was 3x met 1x PBS-T en incubeer met 1:5.000 verdund mierikswortelperoxidase (HRP)-gebonden anti-muis secundair antilichaam.
- Ontwikkel het membraan met enhanced chemiluminescence (ECL) reagens en verkrijg een beeld met behulp van het beeldvormingssysteem.
5. Densitometrische analyse
- Bereken met behulp van ImageJ de verhouding van de intensiteit van elke band / uitstrijkje ten opzichte van de intensiteit van de sleuf van onverteerd DNA en normaliseer de verhouding tot die van cellen zonder / vóór medicamenteuze behandeling.
Representative Results
De representatieve resultaten in figuur 1 tonen de vorming en kinetiek van geneesmiddelgeïnduceerde TOP1-DPC's en hun SUMOylatie en alomtegenwoordigheid. TOP1 splitste één streng van de DNA-duplex en vormde een enzym-DNA-covalent tussenproduct, top1-splitsingscomplex (TOP1cc) genoemd. De behandeling van camptothecine (CPT), een TOP1-remmer, gebonden aan en gestabiliseerd TOP1cc, wat leidt tot de vorming van langlevende TOP1-DPC's. TOP1-DPC's werden geïnduceerd en piekten 20 minuten na blootstelling aan CPT. Tegelijkertijd werden TOP1-DPC's gewijzigd door SUMO-2/3, die ook 20 minuten na CPT-behandeling piekte. Omdat SUMO-2 en SUMO-3 95% sequentie-identiteit delen, onderscheidt het antilichaam het ene niet van het andere. Na 60 minuten namen TOP1-DPC's en hun SUMO-2/3-modificatie af, vergezeld van het hoogtepunt van hun SUMO-1-modificatie en alomtegenwoordigheid. Na de 60 minuten durende medicamenteuze behandeling begonnen de niveaus van TOP1-DPC SUMO-1-modificatie en alomtegenwoordigheid af te nemen. Bij zoogdieren α TOP2-isozymen en β werken door een DNA-dubbelstrengsbreuk te introduceren, evenals door de vorming van een voorbijgaand en omkeerbaar enzym-DNA-covalent complex (TOP2cc). TOP2-remmers, zoals etoposide (ETOP), zetten TOP2cc om in TOP2-DPC's en induceren hun SUMOylatie en alomtegenwoordigheid. Verwant aan de kinetiek van TOP1-DPC's en hun PTM's, bereikten TOP2α- en β-DPC's en hun SUMO-2/3-modificatie een piek na 20 min, waarna ze begonnen af te nemen; ondertussen piekten hun SUMO-1- en ubiquitinemodificaties op 60 minuten (figuur 2). Het is aangetoond dat de klaring van TOP-DPC's het gevolg is van proteasomale afbraak, en de klaring van TOP-DPC SUMOylatie en ubiquitylatie is waarschijnlijk te wijten aan recycling door respectievelijk deSUMOylatie en deubiquitylatie door hun omkerende enzymen. De experimenten in figuur 3 onderzochten FA-geïnduceerde niet-enzymatische DPC's en hun PTM's. Er werd waargenomen dat de DPC's en hun SUMO-2/3, SUMO-1 en ubiquitylatie zich vormden en accumuleerden op een FA-dosisafhankelijke manier. Ten slotte werd de PARylatie van TOP1-DPC's kwantitatief gedetecteerd met een anti-PAR-antilichaam met dezelfde methode (figuur 4). TOP1-DPC PARylation was niet detecteerbaar tenzij een PARG-remmer aan de cel werd toegevoegd, wat suggereert dat PARylation snel optreedt en zeer dynamisch is. In overeenstemming met de vorige bevinding leek de remming van dePARylatie door PARGi TOP1-DPC's te accumuleren, waarschijnlijk door proteolytische afbraak te blokkeren.
Figuur 1: Kwantitatieve analyses van vorming en kinetiek van TOP1-DPC's en hun SUMOylatie en ubiquitylatie bij CPT-behandeling in HEK293-cellen. (A) HEK293-cellen werden behandeld met 20 μM CPT gedurende aangegeven perioden. Callysaten werden geoogst en onderworpen aan de gemodificeerde RADAR-test en western blotting met geïndiceerde antilichamen. Onverteerde DNA-monsters werden onderworpen aan slot-blotting met behulp van anti-dsDNA-antilichamen als belastingscontrole. (B) Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en uitgezet met Prism-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve analyses van de vorming en kinetiek van TOP2-DPC's en hun SUMOylatie en ubiquitylatie bij ETOP-behandeling in HEK293-cellen. (A) HEK293-cellen werden behandeld met 200 μM ETOP gedurende aangegeven perioden. Callysaten werden geoogst en onderworpen aan de gemodificeerde RADAR-test en western blotting met geïndiceerde antilichamen. Onverteerde DNA-monsters werden onderworpen aan slot-blotting met behulp van anti-dsDNA-antilichamen als belastingscontrole. (B) Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en uitgezet met Prism-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantitatieve analyses van niet-enzymatische DPC's en hun SUMOylatie en ubiquitylatie bij FA-behandeling in HEK293-cellen. (A) HEK293-cellen werden behandeld met FA van geïndiceerde concentraties gedurende 2 uur. Callysaten werden geoogst en onderworpen aan de gemodificeerde RADAR-test en western blotting met geïndiceerde antilichamen. Onverteerde DNA-monsters werden onderworpen aan slot-blotting met behulp van anti-dsDNA-antilichamen als belastingscontrole. (B) Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en uitgezet met Prism-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantitatieve analyses van TOP1-DPC's en hun PARylation bij CPT-behandeling in HEK293-cellen. (A) HEK293-cellen werden voorbehandeld met 10 μM PARGi gedurende 1 uur en vervolgens geco-behandeld met CPT gedurende aangegeven perioden. Callysaten werden geoogst en onderworpen aan de gemodificeerde RADAR-test en western blotting met geïndiceerde antilichamen. Onverteerde DNA-monsters werden onderworpen aan slot-blotting met behulp van anti-dsDNA-antilichamen als belastingscontrole. (B) Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en uitgezet met Prism-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De beschreven methode maakt het meten van enzymatische en niet-enzymatische DNA-eiwit crosslinks in zoogdiercellen mogelijk en is de enige geschikte benadering voor het bestuderen van hun alomtegenwoordigheid, SUMOylation en ADP-ribosylatie. Slot-blotting na de ICE- of RADAR-test maakt de snelle detectie van specifieke enzymatische DPC's zoals TOP-DPC's mogelijk met behulp van hun antilichamen. Een kanttekening bij deze methode is echter het onvermogen om eiwitten van verschillende molecuulgewichten te scheiden, waardoor het onmogelijk is om de grootte van PTM-geconjugeerde DPC's te bepalen. De beschreven methode lost het probleem op door verknoopte eiwitten vrij te geven met microkokkennuclease, dat DNA afbreekt tot oligonucleotiden met terminale 3'-fosfaten, waardoor volledige scheiding van de eiwitten (geconjugeerd met oligonucleotiden) door SDS-PAGE mogelijk wordt. DPC's gemodificeerd met ubiquitine, SUMO of ADP-ribose monomeren en polymeren van verschillende groottes kunnen daarom worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door antilichamen die zich richten op deze PTM's, waardoor gedetailleerd onderzoek van hun vorming en kinetiek mogelijk is. Om reproduceerbaarheid te garanderen en statistische significantie te berekenen, zijn biologische replicaties van de experimenten vereist.
Een van de meest voorkomende problemen van deze test is een lage DNA-opbrengst na ethanolprecipitatie. Aan de ene kant kan de DNA-opbrengst worden verhoogd met meer uitgangsmateriaal (cellen). Aan de andere kant kan het incuberen van cellysaten met ethanol in een platte plaat in plaats van een Eppendorf-buis de aggregatie van DNA-moleculen aanzienlijk verbeteren en zo hun neerslag vergemakkelijken. Niet-specifieke signalen die worden waargenomen in monsters zonder medicamenteuze behandelingen kunnen wijzen op niet-covalente eiwitbesmetting. Als dit het geval is, kan men overwegen om DNA-pellets te wassen met een hoge zoutbuffer om de verontreinigingen te verwijderen voorafgaand aan ultrasoonapparaat. Het wordt ook aanbevolen om DNA-monsters na ultrasoonapparaat en microkokkennucleasevertering af te spinnen en alle onoplosbare te verwijderen. In het geval van een slecht of geen signaal kunnen verschillende mogelijke oplossingen worden geprobeerd. Ten eerste kan men de laadhoeveelheid DNA voor SDS-PAGE en immunoblotting verhogen. Om SUMOylated en ubiquitylated DPC-soorten detecteerbaar te maken, wordt aanbevolen om ten minste 4 μg DNA op de gel te laden. Ten tweede kan men de medicijnconcentraties verhogen om hogere niveaus van DPC's en de bijbehorende PTM's te induceren. Ten derde wordt voorgesteld om vlekken met primaire antilichamen nog een dag te incuberen als banden / uitstrijkjes zwak lijken te zijn. Een incubatie van 2 dagen kan het signaal aanzienlijk versterken en vermindert zo de biologische variabiliteit van onafhankelijke experimenten23. Membraanstrippen voor herkleuring resulteert onvermijdelijk in het verlies van een bepaalde hoeveelheid PTM-geconjugeerde DPC-soorten die al in lage abundantie zijn. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om afzonderlijke gels uit te voeren voor ubiquitine- en SUMO-detectie in plaats van één vlek opnieuw te onderzoeken. Bovendien moeten DNA-pellets worden gewassen met 75% ethanol om het resterende DNAzol dat guanidinezout bevat te verwijderen voordat het wordt opgelost in H2O of andere oplosmiddelen, wat anders kristallisatie van het monster veroorzaakt na toevoeging van Laemmli-laadbuffer.
De workflow van de beschreven methode is veel tijdsefficiënter in vergelijking met de omslachtige ICE-test, omdat deze afhankelijk is van snelle ethanolprecipitatie in plaats van de tijdrovende cesiumchloride-ultracentrifugatie om genomisch DNA te isoleren. Tegen een prijs brengt zuivering op basis van ethanol een lage hoeveelheid eiwitverontreinigingen met zich mee die normaal gesproken verwaarloosbaar zijn voor immunodetectie. Als het echter gaat om analytische studies, zoals op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse of sequencing van de volgende generatie die nauwkeurigheid en precisie vereisen, is centrifugatie van cesiumchloridedichtheidgradiënt nog steeds een betrouwbaardere benadering voor het isoleren van zuiver DNA met een hoge abundantie. Deze methode kan mogelijk ook worden toegepast op de profilering van modificatieplaatsen op verknoopte eiwitten en de bepaling van koppelingstypen van poly-ubiquitylatie en poly-SUMOylation met behulp van de juiste op massaspectrometrie gebaseerde methoden.
Van belang is dat deze test de identificatie en karakterisering mogelijk maakt van factoren die PTM's reguleren voor DPC-reparatie. Onbevooroordeelde high-throughput screeningsmethoden (RNA-interferentie en CRISPR) zijn bijvoorbeeld krachtige hulpmiddelen om ubiquitine E3-ligases, SUMO E3-ligases en hun bijbehorende cofactoren te ontdekken die de cytotoxiciteit van DPC-inductoren verminderen. De beschreven methode maakt moleculaire validatie van deze eiwitten mogelijk door te bepalen of ze cellen helpen DPC-inductoren te overleven door de DPC's te repareren. Nieuwe kleinmolecuulremmers gericht op deze eiwitten, bijvoorbeeld geïdentificeerd door virtuele screening, kunnen ook worden gevalideerd met behulp van dit protocol. Aangezien topoisomeraseremmers tot de meest voorgeschreven chemotherapeutica behoren, kan deze robuuste test worden ontwikkeld als een hulpmiddel voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die synergetisch werken met klinische topoisomeraseremmers.
Disclosures
De auteur verklaart geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
| 4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
| anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
| Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
| ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
| Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
| DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
| Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
| Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
| HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
| Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
| Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
| Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
| Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
| Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
| Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
| Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
| Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
| Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
- Weickert, P., Stingele, J.
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
- Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
- Ruggiano, A., Ramadan, K.
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
- Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
- Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
- Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
- Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
- Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
- Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
- Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
- Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
- Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
- Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
- Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
- Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
- Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
- Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N.
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
- Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
- Kuhbacher, U., Duxin, J. P.
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
- Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
- Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
- Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
- Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
- Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
