Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65315
Automatic Translation
1
1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

В настоящем протоколе представлен модифицированный метод обнаружения и количественного определения ДНК-белковых сшивок (ДПК) и их посттрансляционных модификаций (ПТМ), включая убиквитилирование, SUMOylation и АДФ-рибозилирование, индуцированные ингибиторами топоизомеразы и формальдегидом, что позволяет изучать образование и репарацию ДПК и их ПТМ.

Abstract

ДНК-белковые сшивания (ДПК) — это частые, повсеместные и вредные повреждения ДНК, которые возникают в результате эндогенного повреждения ДНК, сбоев в работе ферментов (топоизомераз, метилтрансфераз и т. д.) или экзогенных агентов, таких как химиотерапевтические препараты и сшивающие агенты. После того, как ЦОД индуцированы, к ним оперативно привязываются несколько типов посттрансляционных модификаций (ПТМ) в качестве механизмов раннего реагирования. Было показано, что DPC могут модифицироваться убиквитином, малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO) и поли-АДФ-рибозой, которые подготавливают субстраты для передачи сигналов соответствующим назначенным ферментам репарации и, в некоторых случаях, координируют репарацию последовательным образом. Поскольку ПТМ возникают быстро и являются высокообратимыми, было сложно выделить и обнаружить ЦОД, сопряженные с ПТМ, которые обычно остаются на низких уровнях. Здесь представлен иммуноферментный анализ для очистки и количественного обнаружения убиквитилированных, SUMOylированных и АДФ-рибозилированных DPC (лекарственно-индуцированные топоизомеразные DPC и альдегид-индуцированные неспецифические DPC) in vivo. Этот анализ является производным от анализа RADAR (быстрый подход к восстановлению аддуктов ДНК), который используется для выделения геномной ДНК, содержащей DPC, путем осаждения этанола. После нормализации и расщепления нуклеаз ПТМ ДПК, включая убиквитилирование, SUMOylation и ADP-рибозилирование, выявляются методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител. Этот надежный анализ может быть использован для идентификации и характеристики новых молекулярных механизмов, которые восстанавливают ферментативные и неферментативные DPC, и имеет потенциал для обнаружения низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на конкретные факторы, регулирующие PTM для восстановления DPC.

Introduction

Повреждение геномной ДНК происходит из-за спонтанного распада, внутренних повреждений и факторов окружающей среды1. Образующиеся повреждения ДНК включают поврежденные основания, несоответствия, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы, меж- и внутрицепочечные сшивки, а также ДНК-белковые сшивания (ДПК). DPC образуется, когда связанный с хроматином белок захватывается на ДНК посредством ковалентного сцепления. ДПК индуцируются эндогенными повреждениями ДНК и реактивными метаболитами, а также экзогенными агентами, такими как химиотерапевтические препараты и бифункциональные сшивающие агенты. При определенных обстоятельствах ферментная дисфункция также может привести к образованиюЦОД2. Огромная разница в индукторах DPC приводит к различию в идентичности ковалентно-связанного белка, области хромосомы, где образуется DPC, типе структуры ДНК, сшитой с белком, и химических свойствах ковалентной связи между белком и ДНК 2,3,4.

В зависимости от их химической природы ЦОД обычно подразделяются на две группы: ферментативные ДПК и неферментативные ДПК. Некоторые ферменты, такие как топоизомеразы, гликозилазы и метил/ацилтрансферазы, действуют, образуя обратимые ковалентные промежуточные продукты фермент-ДНК во время их нормальных каталитических реакций. Они являются короткоживущими промежуточными продуктами фермент-ДНК и могут быть преобразованы в долгоживущие ферментативные ДПК при их захвате эндогенными или экзогенными агентами, в частности химиотерапевтическими препаратами3. Топоизомеразные ДПК являются одними из наиболее частых ферментативных ДПК в эукариотических клетках, которые могут быть продуцированы клинически полезными ингибиторами топоизомеразы (топотекан и иринотекан для топоизомеразы I [TOP1] и этопозид и доксорубицин для топоизомеразы II [TOP2]) и являются первичными терапевтическими механизмами этих ингибиторов 5,6. ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ) 1, 3А и 3В являются мишенью 5-аза-2'-дезоксицитидина (также известного как децитабин) и образуют ДПК при воздействии препарата7. Реактивные агенты, а также ультрафиолетовое излучение и ионизирующее излучение индуцируют неферментативные ДПК, неспецифически сшивая белки с ДНК. Реактивные альдегиды, такие как ацетальдегид и формальдегид (ЖК), часто образуются как побочные продукты клеточного метаболизма, среди которых ЖК образуются в микромолярных концентрациях во время метаболизма метанола, перекисного окисления липидов и деметилирования гистонов. Кроме того, FA является химическим веществом для производства в больших объемах, производимым во всем мире, воздействию которого подвергаются многие люди как в экологическом, так и в профессиональном плане.

Как ферментативные, так и неферментативные DPC очень токсичны для клеток, поскольку их громоздкие белковые компоненты эффективно препятствуют почти всем процессам, связанным с хроматином, включая репликацию и транскрипцию, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу, если их не восстановить. За последние два десятилетия репарация ЦОД была интенсивно изучена, и несколько белков/путей были идентифицированы как ключевые факторы, которые либо непосредственно восстанавливают ЦОД, либо модулируют процессы их репарации. Например, было хорошо установлено, что протеолиз белковой массы DPC является ключевым этапом репарации DPC, и что протеолиз может быть катализирован протеазами SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 или26S протеасомным комплексом 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 в зависимости от типа клетки или клеточного контекста. Идентификация и характеристика этих протеаз в значительной степени опирались на комплекс in vivo ферментного анализа (ICE)28,29 и быстрый подход к восстановлению аддукта ДНК (RADAR)30,31, оба из которых выделяют молекулы ДНК и их ковалентно-связанные белки из свободных клеточных белков, что позволяет обнаруживать DPC с помощью щелевой блотины с использованием антител, нацеленных на сшитые белки. Кроме того, в качестве средства обнаружения и количественного определения ДПК на уровнеодной клетки 32 был использован метод иммуноокрашивания агарозной ДНК (ТАРДИС). В настоящее время исследователи выбирают анализ RADAR вместо анализа ICE для измерения DPC, поскольку анализ ICE основан на очистке нуклеиновых кислот с помощью градиентного ультрацентрифугирования хлорида цезия, что чрезвычайно трудоемко, в то время как анализ RADAR осаждает нуклеиновые кислоты с использованием этанола в течение гораздо более короткого периода времени.

В последние годы появляется все больше доказательств того, что множественные посттрансляционные модификации (ПТМ) участвуют в передаче сигналов и рекрутировании DPC-таргетированных протеаз 3,33,34,35. Например, было обнаружено, что TOP1- и TOP2-DPC конъюгируются малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO)-2/3, а затем SUMO-1 лигазой SUMO E3 PIAS4, независимо от репликации и транскрипции ДНК. Последовательные модификации SUMO, по-видимому, являются мишенью убиквитина, который депонируется в SUMOylated TOP-DPC и образует полимерные цепи через свой остаток лизина 48 с помощью убиквитин-лигазы, нацеленной на SUMO, называемой RNF4. Впоследствии полимер убиквитина вызывает сигнал и рекрутирует протеасому 26S в TOP-DPC23,36. Недавно было показано, что один и тот же путь SUMO-убиквитин действует на DNMT1-DPC, а также на комплексы PARP-ДНК для их репарации37,38. Кроме того, сообщалось, что SUMO-независимое убиквитилирование убиквитин-E3-лигазой TRAIP подготавливает ДПК к протеасомальной деградации репликационно-связанным образом39. Подобно протеасомальной деградации TOP-DPC, протеолиз ферментативных и неферментативных DPC с помощью репликационно-связанного металлопротеазного SPRTN также требует убиквитилирования субстратов DPC в качестве механизма вовлечения SPRTN40,41. Разграничение роли SUMOylation и убиквитилирования требует обнаружения DPC, помеченных этими PTM. Поскольку исходный анализ ICE и анализ RADAR полагаются на аппарат slot-blot/dot-blot для измерения непереваренных образцов ДНК, ни один из этих двух анализов не может разрешить и визуализировать PTM-сопряженные виды DPC с разной молекулярной массой. Чтобы решить эту проблему, мы расщепляли образцы ДНК после их очистки путем осаждения этанола и нормализации образца микрококковой нуклеазой, эндоэкзонуклеазой ДНК и РНК для высвобождения сшитых белков, что позволило нам разрешать белки, а также их ковалентные ПТМ с помощью электрофореза в додецилсульфатном полиакриламидном геле натрия (SDS-PAGE). Электрофорез позволил обнаружить и количественно определить ПТМ-конъюгированные ДПК с использованием специфических антител, нацеленных на ПТМ. Первоначально мы назвали этот усовершенствованный метод анализом DUST, чтобы подчеркнуть его надежность в обнаружении убиквитилированных и SUMOylated TOP-DPC23. Позже мы расширили использование анализа для количественной оценки АДФ-рибозилирования TOP1-DPC in vivo, используя антитела против полимеров поли-АДФ-рибозы20.

Здесь представлен подробный протокол для анализа, который обнаруживает и измеряет убиквитилированные, SUMOylированные и АДФ-рибозилированные DPC, который был оптимизирован для модифицированных TOP-DPC, индуцируемых их ингибиторами, и неспецифических/неферментативных DPC, индуцированных FA. Этот анализ изолирует PTM-конъюгированные DPC путем лизиза клеток хаотропным агентом, осаждения ДНК этанолом и высвобождения сшитых белков и их модификаторов с помощью микрококковой нуклеазы. Белки, связанные с ДНК, и их ПТМ количественно определяют методом иммуноблоттинга с использованием специфических антител. Этот анализ открывает новые возможности для выяснения молекулярных механизмов, с помощью которых клетка восстанавливает как ферментативные, так и неферментативные ДПК. В частности, он позволяет детально изучить индукцию и кинетику ПТМ, важных для регуляции деградации и репарации TOP-DPC, и, таким образом, позволяет открыть новые факторы, такие как Е3-лигазы, диктующие ПТМ, а также ингибиторы, нацеленные на эти факторы. Поскольку некоторые из PTM, ответственных за репарацию TOP-DPC, вероятно, участвуют в репарации DPC, индуцированных другими химиотерапевтическими препаратами, такими как препараты на основе платины22, этот анализ также имеет потенциал для применения для открытия новых лекарств и рациональной оптимизации комбинаторной терапии ингибиторами топоизомеразы или противоопухолевыми препаратами на основе платины в клетках пациента для определения схем лечения.

Protocol

1. Клеточная культура и медикаментозная обработка в клеточной линии эмбриональной почки человека 293 (HEK293)

  1. Приготовьте питательную среду, модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% L-глутамином 2 мМ и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина.
  2. Посев 1 x 10 6 клеток в 60-миллиметровую пластину или 6-луночную пластину для каждого условия обработки плюс контроль.
  3. На следующий день обработайте клетки индукторами DPC по выбору.
    1. Чтобы индуцировать TOP1-DPC и их убиквитилирование и SUMOylation, добавляют к клеткам ингибитор TOP1 камптотецин в дозе 20 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
    2. Чтобы индуцировать TOP2α и β-DPCs, а также их убиквитилирование и SUMOylation, подвергают клетки добавлению этопозида ингибитора TOP2 при 200 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
    3. Для индуцирования неферментативных ДПК и их убиквитилирования и SUMOylation добавляют ФА в дозе 1 мМ и собирают клетки через 2 ч после экспозиции.
    4. Чтобы индуцировать PARylation TOP1-DPC, предварительно обрабатывают клетки в течение 1 ч для блокировки деPARylation ингибитором поли(АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) PDD00017273 при 10 мкМ с последующей совместной обработкой 20 мкМ камптотецином в течение 20, 60 и 180 мин.

2. Выделение и нормализация ДНК, содержащей сшитые белки

  1. После обработки быстро аспирируйте среду с помощью всасывающей пипетки и промойте клетки ледяным 1-кратным фосфатным буфером (PBS). Немедленно лизируйте клетки в 600 мкл реагента ДНКзол, содержащего 1x ингибитор коктейля протеазы, 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 20 мМ N-этилмалеимид (ингибитор деСУМОилирующих и деубиквитилирующих ферментов).
  2. Медленно перемешивайте пластину на вибрационной платформе в течение 10 минут при температуре 4 °C.
  3. Добавьте 1/2 объема 100% холодного этанола (0,3 мл) непосредственно в планшет и повторяйте шаг 2.2 до тех пор, пока не станет виден непрозрачный агрегат нуклеиновых кислот. Переложите клеточный лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и подвергните пробирку центрифугированию с максимальной скоростью (20 000 x g) в течение 15 минут при 4 °C для осаждения нуклеиновой кислоты и ее сшитых белков.
  4. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью всасывающей пипетки и промывают гранулы нуклеиновых кислот в 1 мл 75% этанола с последующим центрифугированием в течение 2 минут по 20 000 x g при 4 °C.
  5. Отсасывайте надосадочную жидкость, откручивайте с той же скоростью и удаляйте оставшуюся жидкость с помощью пипетки P20. Высушите гранулу на воздухе в течение 5 минут.
  6. Быстро растворите гранулу нуклеиновой кислоты в 0,1 мл ddH2O. Повторно суспендируйте гранулу путем повторного пипетирования, затем инкубируйте на водяной бане с температурой 37 °C, пока гранула не набухнет, по крайней мере, в три раза больше (примерно 30 минут).
  7. Продуцируйте образцы ультразвуковым процессорным зондом с амплитудой 30% в течение 10 с до полного растворения гранулы.
  8. Необязательный этап: Обработать образцы смесью РНКазы А/Т1 (10 мкг РНКазы А и 25 ЕД РНКазы Т1) и инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Добавьте в пробирку 1/10 объема 3 М ацетата натрия и два объема ледяного 100% этанола с последующим центрифугированием при 20 000 x g в течение 10 мин для извлечения ДНК. Удалите надосадочную жидкость и растворите осажденную ДНК в 0,1 мл ddH2O.
  9. Дополнительный этап: центрифугируют образец в течение 5 мин при 20 000 x g и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку.
  10. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью спектрометра в ультрафиолетовом диапазоне (UV-Vis). Типичный выход ДНК составляет около 600-800 нг/мкл. Соотношение А260/А280 должно быть снижено с 2,0-2,1 до 1,8-1,9 после удаления РНК.
  11. Доведите концентрацию ДНК до 400-500 нг/мкл в 0,12 мл ddH 2 O. Перенесите 20 мкл образца в новую микроцентрифужную пробирку в качестве контроля загрузки непереваренной ДНК (см. шаг2.4).
  12. Чтобы расщепить ДНК, растворенную в оставшихся 100 мкл ddH2O, добавьте в образец 2000 гелевых единиц микрококковой нуклеазы вместе с 1/10 объема (~11 мкл) 10-кратного реакционного буфера для микрококковых нуклеаз кальция. Инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.

3. Вестерн-блоттинг переваренных образцов ДНК

  1. Добавьте 4 буфера для образца Laemmli, затем прокипятите образец в течение 5 минут.
  2. Загрузите 5-6 мкг расщепленного образца (~15 мкл) на 4%-20% полиакриламидный гель, а затем SDS-PAGE42 для разрешения немодифицированных и PTM-конъюгированных DPC.
  3. Для обнаружения ЖК-индуцированных неферментативных видов ДПК инкубируйте гель с красителем Coomassie blue в течение ночи при комнатной температуре. Смыть гель ddH 2 O в течение2ч и получить изображение с помощью системы визуализации.
  4. Перенесите гель и инкубируйте мембраны в течение ночи при 4 °C с соответствующими разведениями первичных антител в блокирующем буфере.
    1. Для выявления убиквитилирования проводят разведение антител к убиквитину в соотношении 1:100.
    2. Для обнаружения SUMO-1 или модификации SUMO-2/3 проводят разведение анти-SUMO-1 или антител к SUMO-2/3 в соотношении 1:250.
    3. Для обнаружения АДФ-рибозилирования проводят разведение антител к PAR в соотношении 1:500.
    4. Чтобы обнаружить общие TOP1-, TOP2α- или TOP2β-DPC, сделайте разведение антител к TOP1, анти-TOP2α или анти-TOP2β в соотношении 1:500.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения подробной информации о разведении антител.
  5. Инкубируют 1x PBS-T (0,1% tween 20) промытую мембрану со вторичным антителом, разбавленным в 5000 раз в блокирующем буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре.
  6. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

4. Щелевое блоттингирование непереваренных образцов ДНК

  1. Развести 20 мкл непереваренного образца ДНК в 180 мкл натрий-фосфатного буфера (25 мМ, рН 6,6).
  2. Разрежьте нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм) и уравновешивайте в течение 5 мин в натрий-фосфатном буфере.
  3. Соберите щелевой блот-аппарат в соответствии с инструкциями производителя и подключите его к вакуумной системе.
  4. Промойте лунки натрий-фосфатным буфером, применив вакуум. Убедитесь в отсутствии протечек в колодцах.
  5. Остановите вакуум и загрузите 200 мкл ДНК на образец (1 мкг). Заполните пустые лунки 200 мкл натрий-фосфатного буфера.
  6. Примените пылесос.
  7. Когда все лунки полностью опустеют, остановите вакуум, загрузите 200 мкл натрий-фосфатного буфера в каждую лунку и повторите шаг 4.6.
  8. Извлеките мембрану и заблокируйте 5%-ным блокирующим буфером в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
  9. Зонд с антителом к двухцепочечной ДНК (дцДНК) в разведении 1:5 000 в течение ночи при 4 °C.
  10. Промыть 3 раза с 1 PBS-T и инкубировать с разбавленным вторичным антителом против мышей, связанным с пероксидазой хрена (HRP) в соотношении 1:5.
  11. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

5. Денситометрический анализ

  1. Используя ImageJ, рассчитайте отношение интенсивности каждой полосы/мазка к интенсивности слота непереваренной ДНК и нормализуйте это соотношение с таковым в клетках без/до медикаментозного лечения.

Representative Results

Репрезентативные результаты, представленные на рисунке 1 , показывают образование и кинетику лекарственно-индуцированных TOP1-DPC, а также их сумоилирование и убиквитилирование. TOP1 расщеплял одну цепь дуплекса ДНК и образовывал ковалентный промежуточный продукт фермент-ДНК, называемый комплексом расщепления TOP1 (TOP1cc). Лечение камптотецином (CPT), ингибитором TOP1, связывается с TOP1cc и стабилизирует его, что приводит к образованию долгоживущих TOP1-DPC. Наблюдалось, что TOP1-DPC индуцируются и достигают пика через 20 минут после воздействия CPT. Одновременно TOP1-DPC модифицировались SUMO-2/3, который также достигал пика через 20 минут после лечения CPT. Поскольку SUMO-2 и SUMO-3 имеют 95% идентичность последовательности, антитела не отличают одно от другого. Через 60 мин TOP1-DPC и их модификация SUMO-2/3 уменьшались, сопровождаясь кульминацией их модификации SUMO-1 и убиквитилирования. После 60-минутного медикаментозного лечения уровни модификации и убиквитилирования TOP1-DPC SUMO-1 начали снижаться. У млекопитающих изоферменты TOP2 α и β действуют путем введения двухцепочечного разрыва ДНК, а также путем образования транзиторного и обратимого ковалентного комплекса фермент-ДНК (TOP2cc). Ингибиторы TOP2, такие как этопозид (ETOP), превращают TOP2cc в TOP2-DPC и индуцируют их SUMOylation и ubiquitylation. Подобно кинетике TOP1-DPC и их PTM, TOP2α- и β-DPC и их модификация SUMO-2/3 достигали пика на 20 мин, а затем начинали снижаться; в то же время их модификации SUMO-1 и убиквитина достигли пика на 60-й минуте (рис. 2). Было продемонстрировано, что клиренс TOP-DPC является результатом протеасомальной деградации, а клиренс TOP-DPC SUMOylation и ubiquitylation, вероятно, обусловлен рециркуляцией путем деSUMOylation и deubiquitylation, соответственно, их реверсивными ферментами. В экспериментах, показанных на рисунке 3 , изучались ФА-индуцированные неферментативные ЦОД и их ПТМ. Было замечено, что ЦОД и их СУМО-2/3, СУМО-1 и убиквитилирование формировались и накапливались дозозависимым образом ФА. Наконец, PARylation TOP1-DPC количественно детектировали с помощью антитела к PAR тем же методом (рис. 4). PARylation TOP1-DPC не обнаруживалось до тех пор, пока в клетку не был добавлен ингибитор PARG, что позволяет предположить, что PARylation происходит быстро и является очень динамичным. В соответствии с предыдущим выводом, ингибирование деПАРилирования PARGi, по-видимому, приводит к накоплению TOP1-DPC, вероятно, путем блокирования протеолитической деградации.

Figure 1
Рисунок 1: Количественный анализ образования и кинетики TOP1-DPC и их SUMOylation и ubiquitylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 20 мкМ CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Количественный анализ образования и кинетики TOP2-DPC и их SUMOylation и убиквитилирования при обработке ETOP в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 200 мкМ ETOP в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Количественный анализ неферментативных ДПК и их сумоилирования и убиквитилирования при обработке ФА в клетках HEK293. (А) Клетки HEK293 обрабатывали ФА указанных концентраций в течение 2 ч. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Количественный анализ TOP1-DPC и их PARylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 предварительно обрабатывали 10 мкМ PARGi в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Описанный метод позволяет измерять ферментативные и неферментативные ДНК-белковые сшивки в клетках млекопитающих и является единственно подходящим подходом для изучения их убиквитилирования, SUMOylation и АДФ-рибозилирования. Щелевой блоттинг после анализа ICE или RADAR позволяет быстро обнаруживать специфические ферментативные DPC, такие как TOP-DPC, с помощью их антител. Однако недостатком этого метода является его неспособность разделять белки разной молекулярной массы, что делает невозможным определение размеров PTM-сопряженных ЦОД. Описанный способ решает проблему путем высвобождения сшитых белков с микрококковой нуклеазой, которая расщепляет ДНК до олигонуклеотидов с концевыми 3'-фосфатами, тем самым обеспечивая полное разделение белков (конъюгированных с олигонуклеотидами) с помощью SDS-PAGE. Таким образом, ЦОД, модифицированные мономерами и полимерами убиквитина, SUMO или АДФ-рибозы различных размеров, могут быть визуализированы и количественно определены антителами, нацеленными на эти ПТМ, что позволяет детально исследовать их образование и кинетику. Для обеспечения воспроизводимости и расчета статистической значимости требуются биологические повторы экспериментов.

Одной из наиболее распространенных проблем этого анализа является низкий выход ДНК после осаждения этанола. С одной стороны, выход ДНК может быть увеличен за счет большего количества исходного материала (клеток). С другой стороны, инкубация клеточных лизатов с этанолом в плоской пластине, а не в пробирке Эппендорфа, может заметно улучшить агрегацию молекул ДНК и, таким образом, облегчить их осаждение. Неспецифические сигналы, наблюдаемые в образцах без медикаментозной обработки, могут указывать на загрязнение нековалентным белком. В этом случае можно рассмотреть возможность промывки гранул ДНК буфером с высоким содержанием соли для удаления загрязняющих веществ перед ультразвуковой обработкой. Также рекомендуется отжимать образцы ДНК после ультразвуковой обработки и расщепления микрококковой нуклеазы и выбрасывать все нерастворимые. В случае плохого сигнала или его отсутствия можно попробовать несколько возможных решений. Во-первых, можно увеличить количество загрузки ДНК для SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Для обнаружения SUMOylated и ubiquitylated DPC species рекомендуется загрузить в гель не менее 4 мкг ДНК. Во-вторых, можно увеличить концентрацию препарата, чтобы индуцировать более высокие уровни DPC и связанных с ними PTM. В-третьих, рекомендуется инкубировать блоты с первичными антителами в течение еще одного дня, если полосы/мазки кажутся слабыми. 2-дневная инкубация может значительно потенцировать сигнал и, таким образом, снижает биологическую изменчивость по результатам независимых экспериментов23. Зачистка мембраны для повторного окрашивания неизбежно приводит к потере определенного количества PTM-конъюгированных видов DPC, которые и без того находятся в низкой численности. Поэтому настоятельно рекомендуется использовать отдельные гели для определения убиквитина и SUMO, а не повторно зондировать один блот. Кроме того, гранулы ДНК должны быть промыты 75% этанолом для удаления оставшейся ДНК-золы, содержащей соль гуанидина, перед растворением в H2O или любых других растворителях, что в противном случае вызывает кристаллизацию образца после добавления загрузочного буфера Laemmli.

Рабочий процесс описанного метода гораздо более эффективен по времени по сравнению с громоздким ICE-анализом, поскольку он основан на быстром осаждении этанола вместо трудоемкого ультрацентрифугирования хлорида цезия для выделения геномной ДНК. Очистка на основе этанола приводит к низкому количеству белковых загрязнителей, которые обычно незначительны для иммунодетекции. Однако, когда дело доходит до аналитических исследований, таких как протеомный анализ на основе масс-спектрометрии или секвенирование нового поколения, которые требуют точности и прецизионности, центрифугирование с градиентом плотности хлорида цезия по-прежнему является более надежным подходом для выделения чистой ДНК с высоким содержанием. Этот метод также потенциально может быть применен для профилирования сайтов модификации на сшитых белках и определения типов сцепления полиубиквитилирования и поли-СУМОилирования с использованием соответствующих методов, основанных на масс-спектрометрии.

Следует отметить, что данный анализ позволяет идентифицировать и охарактеризовать факторы, регулирующие ПТМ для ремонта ЦОД. Например, беспристрастные высокопроизводительные методы скрининга (РНК-интерференция и CRISPR) являются мощными инструментами для обнаружения убиквитиновых E3-лигаз, SUMO-E3-лигаз и связанных с ними кофакторов, снижающих цитотоксичность индукторов DPC. Описанный метод позволяет проводить молекулярную валидацию этих белков, определяя, помогают ли они клеткам выживать после индукторов DPC путем репарации DPC. Новые низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на эти белки, идентифицированные, например, с помощью виртуального скрининга, также могут быть валидированы с помощью этого протокола. Учитывая, что ингибиторы топоизомеразы являются одними из наиболее часто назначаемых химиотерапевтических препаратов, этот надежный анализ может быть разработан в качестве инструмента для разработки препаратов, которые синергируют с клиническими ингибиторами топоизомеразы.

Disclosures

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом рака (National Cancer Institute Center for Cancer Research) за выдающиеся достижения в области постдокторских исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher 70011069
4–20% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561096
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
AcquaStain (coomassie blue) Bulldog Bio AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal) Abcam 27156 1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal) R&D systems 4335-MC-100 1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4940 1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4971 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal) BD Biosciences 556597 1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-365799 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-25330 1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-8017 1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609 Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin Sigma-Aldrich PHL89593
ChemiDo MP imaging system Bio-Rad 12003154
Disodium phosphate Sigma-Aldrich 5438380100 Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol Thermo Fisher 10503027
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher R0861
Dulbecco's modified eagle's medium Sigma-Aldrich 11965084
Ethyl alcohol, 200 proof Sigma-Aldrich E7023
Etoposide Sigma-Aldrich 1268808
Formaldehyde Sigma-Aldrich 47608
Graphpad Prism Software GraphStats Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG Cytiva NA931 1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG Cytiva NA934 1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software NIH, USA ImageJ 1.53e
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
Maximum sensitivity ECL substrate Thermo Fisher 34095
Micrococcal nuclease New England BioLabs M0247S
Monosodium phosphate Sigma-Aldrich S3139 Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
N-ethylmaleimide Thermo Fisher 23030 DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm Bio-Rad 1620115
Non-fat dry milk Bio-Rad 1706404XTU
PDD00017273 Selleckchem S8862 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Protease inhibitor cocktail Thermo Fisher 78430
Q700 sonicator Qsonica Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit Bio-Rad 1704274
Slot-blot apparatus Bio-Rad 1706542
Slot-blot filter paper Bio-Rad 1620161
Trans-Blot turbo transfer system Bio-Rad 1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer Bio-Rad 1610732
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179
Vertical electrophoresis cell Bio-Rad 1658004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11 (2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250 (2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924 (2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 194
Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Y. Quantitative Detection of… More

Sun, Y. Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications. J. Vis. Exp. (194), e65315, doi:10.3791/65315 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter