Summary
בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.
Abstract
ספרמטוגנזה היא תהליך ביולוגי מורכב שבמהלכו תאים דיפלואידים עוברים חלוקה מיטוטית ומיאוטית עוקבת ואחריה שינויים מבניים גדולים ליצירת זרעונים הפלואידים. מלבד ההיבט הביולוגי, חקר הזרע הוא בעל חשיבות עליונה להבנה ופיתוח של טכנולוגיות גנטיות כגון דחיפת גנים ועיוותים סינתטיים ביחס בין המינים, אשר, על ידי שינוי התורשה המנדליאנית ויחס מין הזרע, בהתאמה, יכולים לשמש להדברת אוכלוסיות חרקים מזיקים. טכנולוגיות אלה הוכיחו את עצמן כמבטיחות מאוד בתנאי מעבדה ועשויות לשמש להדברת אוכלוסיות בר של יתושי אנופלס , שהם וקטורים של מלריה. בשל פשטות האנטומיה של האשכים וחשיבותם הרפואית, אנופלס גמביה, וקטור מלריה מרכזי באפריקה שמדרום לסהרה, מייצג מודל ציטולוגי טוב לחקר זרעונים. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בהכלאה פלואורסצנטית באתרה (WFISH) כדי לחקור את השינויים הדרמטיים במבנה הגרעיני של התא באמצעות ספרמטוגנזה באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות המכתימות באופן ספציפי את כרומוזומי X ו- Y. FISH דורש בדרך כלל הפרעה של איברי הרבייה כדי לחשוף כרומוזומים מיטוטיים או meiotic ולאפשר צביעה של אזורים גנומיים ספציפיים עם בדיקות פלואורסצנטיות. WFISH מאפשר לשמר את המבנה הציטולוגי המקורי של האשכים, יחד עם רמה טובה של זיהוי אותות מגשושיות פלואורסצנטיות המכוונות לרצפי DNA חוזרים. זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר שינויים בהתנהגות הכרומוזומלית של תאים שעברו מיוזה לאורך מבנה האיבר, שם ניתן להבחין בבירור בכל שלב של התהליך. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לחקר זיווג כרומוזומים מיוטי וחקירת הפנוטיפים הציטולוגיים הקשורים, למשל, לעיוותים סינתטיים ביחס בין המינים, לעקרות זכרית היברידית ולהשמדת גנים המעורבים בזרעונים.
Introduction
המלריה מטילה נטל עצום על בריאותה ורווחתה של האוכלוסייה האנושית העולמית. בשנת 2021 העריך ארגון הבריאות העולמי (WHO) כי המלריה גרמה ל-619,000 מקרי מוות, מתוכם 96% באפריקה שמדרום לסהרה1. המחלה מועברת על ידי יתושים השייכים לסוג אנופלס, ובאפריקה שמדרום לסהרה, לשלושה מינים, כלומר אנופלס גמביה (An. gambiae), אנופלס קולוצי (An, coluzzi) ואנופלס ערביינסיס (An. arabiensis) יש תפקיד גדול באופן לא פרופורציונלי בהעברת מלריה, המהווים 95% ממקרי המלריה בעולם. תוכניות בקרה המסתמכות על שיטות מסורתיות כגון קוטלי חרקים ותרופות נגד מלריה הצילו מיליוני חיים; עם זאת, בשנים האחרונות, ההתנגדות הגוברת לשיטות בקרה אלה ערערה על יעילותן 1,2. בנוסף, הגבלות שהוטלו על ידי מגיפת COVID-19 השפיעו על זמינותן של התערבויות מרכזיות לשליטה במלריה, אשר, על פי דו"ח המלריה העולמי של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2022, הגבירו את שכיחות המלריה1. בשני העשורים האחרונים פותחו שיטות בקרה גנטית חדשניות בתנאי מעבדה כדי להתמקד ביתושי אנופלס 3,4,5,6,7,8,9,10. בין אסטרטגיות אלה, אלה המבוססות על מערכות דחף גנטי (GDSs) ועיוותים סינתטיים ביחס המין (SDs) נראים מבטיחים. GDS מסתמכים על האפשרות להעביר, בתדירות גבוהה מאוד, שינוי גנטי המשפיע על פוריות האישה או פוגע במחזור החיים של הטפיל ביתוש 5,11,12. במקום זאת, SDs פועלים על ידי הטיית יחס המין של צאצאי יתוש כלפי זכרים, מה שמוביל, לאורך זמן, לקריסת אוכלוסיית היעד עקב מחסור בנקבות 4,6,13. המרכיבים העיקריים של מערכות גנטיות אלה פועלים בעיקר על איברי הרבייה של היתושים, שם הגמטות, הביציות והזרע מיוצרים לאחר חלוקה מיוטית14.
בפרוטוקול זה, התקדמות בטכניקות ציטוגנטיות משמשת לחקר ספרמטוגנזה ב- An. gambiae תוך התמקדות בהתנהגות הכרומוזומים באתרם. מבנה האשך של היתוש והתהליכים הביולוגיים המתרחשים בו נחקרו בעבר באמצעות מספר שיטות ציטולוגיות, כגון אימונופלואורסצנטיות, טרנסגנים פלואורסצנטיים והכלאות DNA ו-RNA באתרו (FISH)15,16,17,18,19,20; האיברים מראים צורה דמוית ציר, שבה הקוטב התחתון מחובר לצינור דפרנט המחובר לבלוטות העזר הגבריות. בקוטב העליון, נישה תאי גזע germline מתרבים ומתמיינים לתאי זרע המשובצים בתוך זרעונים שנוצרו על ידי תאים סומטיים. לאחר סבבים מרובים של חלוקה מיטוטית, הזרעונים מתמיינים לזרעונים, הנכנסים למיוזה. בשלב הפרוזום, כרומוזומי מין ואוטוזומים מתחברים להומולוגים שלהם, ומתרחשת חצייה. לאחר החלוקות המיוטיות, נוצרים זרעונים הפלואידים עגולים ונכנסים לספרמיוגנזה, ותהליך זה מוביל להיווצרות זרעונים הפלואידים בוגרים שבהם הציטופלסמה הוסרה, הכרומטין הגרעיני מתעבה, ושוטונים מופיעים בחלק הבסיסי של גרעיני21,22 (איור 1 ואיור 2).
באופן כללי, ספרמיוגנזה מתחילה סביב שלב הגלמים האמצעיים, וניתן לזהות זרעונים בוגרים בשלב הגלמים המאוחרים במאגר הזרע23. תהליך ההתבגרות של הזרעונים נמשך במהלך החיים הבוגרים23,24,25. באשכי אנופלס, כל שלב של זרע יכול להיות מזוהה בקלות על-ידי התבוננות במורפולוגיה הגרעינית של התאים בכל זרע (איור 2). הכלאה פלואורסצנטית באתרה (WFISH), המתוארת בפרוטוקול זה, מאפשרת לחוקרים לתייג באופן ספציפי אזור כרומוזומלי ולעקוב אחריו במהלך הזרע תוך שמירה על המבנה הטבעי של מיקום האיבר וגרעיני התא; זה מייצג יתרון בהשוואה לפרוטוקול DNA FISH סטנדרטי שבו האיבר בדרך כלל מעוך, מה שמוביל לנזק לרקמות19. בפרוטוקול הנוכחי, בדיקות פלואורסצנטיות משמשות להכתמת רצפים חוזרים על כרומוזומי המין, ובכך לעקוב אחר התנהגותם במהלך ספרמטוגנזה, מתאים מתחלקים דיפלואידים לזרעונים הפלואידים בוגרים. WFISH יכול להיות שימושי במיוחד לחקר זיווג מיוטי של כרומוזומי מין וחקירת הפנוטיפים הציטולוגיים הקשורים, למשל, לעיוותים סינתטיים של יחס המינים, עקרות זכרית היברידית והשמדת גנים המעורבים בזרע 4,19,26,27.
בהתחשב בתפקידם כווקטורי מלריה, יתושי אנופלס הם המטרה של מספר גדל והולך של אסטרטגיות בקרת וקטורים גנטיים, אשר לעתים קרובות פועלים באיברי הרבייה של אורגניזמים אלה. נוצרו מספר מוטנטים ופנוטיפים ציטולוגיים הדורשים טכניקות ציטולוגיות חדשות כדי להיחקר26,27,28,29. השיטה המתוארת במחקר זה שופכת אור על הבנת הזרע, כמו גם על המנגנונים הציטולוגיים מאחורי אסטרטגיות גנטיות שיש להן פוטנציאל לשלוט ביתושים מעבירי מלריה.
Protocol
1. תיוג בדיקת DNA
הערה: להלן השלבים הטכניים ליצירת בדיקות DNA פלואורסצנטיות המסמנות באופן ספציפי את כרומוזומי המין של יתושי An. gambiae.
- בדיקה תיוג באמצעות PCR
- חלץ DNA גנומי מגלמים או זכרים בוגרים כדי לתייג את כרומוזומי X או Y באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומי זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- הכינו את תערובת תגובת ה-PCR: 200 ננוגרם של דנ"א גנומי, 0.05 מילימטר נוקלאוטיד לא מסומן (dATP, dCTP, dGTP), 0.015 מילימטר של dTTP, ו-1 uL של dUTP המסומן פלואורסצנטית (Cy3, Cy5, או פלואורוכרום אחר), 50 PMOL של פריימר קדמי והפוך (טבלה 1), 5 μL של 10x PCR-buffer ו-10 U של Taq DNA polymerase (ראה טבלת חומרים).
- כדי לתייג 18S rDNA ולוויין AgY53B (טבלה 1), בצע תגובת PCR באמצעות פרמטרי ה-PCR הבאים: מחזור אחד של 95°C למשך 10 דקות; 35 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, 52 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 45 שניות; מחזור אחד של 72 °C למשך 5 דקות; ואחיזה סופית ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי להשיג ריכוז בדיקה טוב עם שיטת התיוג PCR (~ 1 מיקרוגרם ב 5 μL), שהוא קריטי עבור WFISH מוצלח, תגובת PCR צריכה להיות יעילה מאוד. מסיבה זו, לפני תיוג הבדיקה, מומלץ מאוד לבדוק את יעילות הפריימרים שנבחרו להגברה. בנוסף, הכללת בקרה חיובית בתגובת ה- PCR (ללא dUTP פלואורסצנטי) תסייע לאמת את יעילות תגובת התיוג. - אחסנו את הגשושית בטמפרטורה של -20°C במקום חשוך.
- השגת בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות 3'
- השג בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות זמינות מסחרית כאוליגוס שונה על ידי הוספת פלואורוכרום Cy3 או Cy5 (או כל פלואורוכרום אחר) לקצה 3' של רצף הנוקלאוטידים (ראה טבלת חומרים). ראו פריימרים/אוליגונוקלאוטיד בטבלה 1 עבור רצפי הייחוס המשמשים לסימון אזור צומת הלוויין AgY477-AgY53B המקושר ל-Y והלוויין מקושר ה-X מ-Contig_240.
הערה: אין מכשולים טכניים הקשורים לריכוז של אוליגונוקלאוטידים המסומנים בקצה, מכיוון שהמשתמש יכול בדרך כלל לבחור זאת לפני הרכישה. אנו מציעים לדלל ~800 ננוגרם של תמיסת בדיקת אוליגו במאגר ההכלאה לצורך תיוג יעיל באמצעות בדיקת אוליגו. גשושיות אוליגו ספציפיות ל-X ו-Y שימשו בעבר עבור WFISH על ידי ליאנג ושרחוב19, וניתן למצוא את רצף הייחוס בטבלה 1.
- השג בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות זמינות מסחרית כאוליגוס שונה על ידי הוספת פלואורוכרום Cy3 או Cy5 (או כל פלואורוכרום אחר) לקצה 3' של רצף הנוקלאוטידים (ראה טבלת חומרים). ראו פריימרים/אוליגונוקלאוטיד בטבלה 1 עבור רצפי הייחוס המשמשים לסימון אזור צומת הלוויין AgY477-AgY53B המקושר ל-Y והלוויין מקושר ה-X מ-Contig_240.
2. הכנת פתרון ההכלאה
הערה: הגשושיות הפלואורסצנטיות הנוצרות בשלב 1 חייבות להיות משולבות בתמיסה כימית שמבצעת הכלאה עם רצפי המטרה.
- משקעי בדיקה לפני הכלאה פלואורסצנטית באתרו
- לצינור של 1.5 מ"ל, הוסף 5 μL של בדיקת DNA מסומנת (אם הושגה בשיטת תיוג PCR) או 2.2 μL של בדיקת אוליגו שונה 3' (~ 800 ng של בדיקה) משלב 1 ו -5 μL של DNA זרע סלמון (ראה טבלת חומרים). שלב את הגשושיות הספציפיות לאזורים גנומיים שונים באותו צינור, והשתמש בהן כפתרון ייחודי בשלבים הבאים.
- לזרז את בדיקת ה- DNA על ידי הוספת נפח 0.1 של 3 M נתרן אצטט ו 2 כרכים של 100% אתנול. שמור על -20 ° C לפחות 2.5 שעות (הגדלת זמן הדגירה ב -20 ° C יגדיל את התשואה הסופית). בשלב זה, ניתן לאחסן את הגשושיות גם לילה לפני הצנטריפוגה.
- צנטריפוגה ב 17,000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות, להסיר את האתנול, ולייבש את האוויר את הגלולה ב RT בחושך במשך ~ 20 דקות.
- פתרון היברידיזציה
- לפני שתמשיך עם דיסקציה האשכים (שלב 3), להכין את חיץ הכלאה על ידי ערבוב ריאגנטים הבאים בצינור 1.5: 500 μL של פורממיד, 0.2 גרם של דקסטרן סולפט, 100 μL של 20x נתרן ציטראט מלוחים (SSC), ו 200 μL של סטרילי H20 (ראה טבלה של חומרים). מערבלים את תמיסת ההכלאה למשך דקה אחת, ומאפשרים לדאקסטרן סולפט להתמוסס ב-37°C למשך 30 דקות.
- ממיסים את הגלולה משלב 2.1.3 ב-20-30 מיקרוליטר של חיץ הכלאה (מערבולת למשך כדקה, מבצעים סיבוב מהיר ומאחסנים את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך) לקבלת תמיסת ההכלאה.
3. דיסקציה וקיבוע אשכים
- בטמפרטורת החדר (RT), נתחולפחות 21 ~20 אשכים מגלמים או מבוגרים בני יום אחד בתמיסת מלח סטרילית 1x פוספט חוצץ מלח (PBS), והעבירו אותם למגלשת מיקרוסקופ נקייה המכילה טיפה טרייה של תמיסת PBS 1x.
- מעבירים את האשכים באמצעות קצה מסונן רחב P1,000 או קצה של מחט דיסקציה מטיפת PBS 1x לתוך צלחת עובר המכילה 3.7% פורמלדהיד ב-1x PBS עם 0.1% Tween-20 (PBST), ודגרים במשך 10 דקות ב-RT.
- שטפו את האשכים ב-1x PBST במשך 5 דקות ב-RT. דגרו על האשכים ב-RNAse A של 0.1 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים) מדוללים ב-1x PBS סטרילי למשך 30 דקות ב-37°C.
- הסר את תמיסת ה- RNAse, הוסף את התמיסה החודרת (1% טריטון/0.1 M HCl ב- 1x PBST), ודגר ב- RT למשך 10 דקות.
הערה: ניתן להשתמש בפרוטאינאז K כחומר חודר בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBST כדי להגביר את החדירות של האשכים. - שטפו את האשכים ב-1x PBST פעמיים במשך 5 דקות כל אחת ב-RT.
4. הכלאה
הערה: סעיף זה מתאר את השלבים האחרונים עבור הכלאה באתר .
- לאחר שלב הכביסה (שלב 3.5), להעביר את האשכים בצינור 1.5 מ"ל עם 20-30 μL של פתרון הכלאה המכיל את הבדיקה שהוכנה בעבר (שלב 2.2.2). השתמש בקצה פיפטה כדי לערבב את התמיסה בעדינות. החלק בעדינות את הצינור חמש פעמים לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
- דגירה במשך 5 דקות ב 75 ° C עבור דנטורציה DNA.
- דוגרים לילה בטמפרטורה של 37°C (אם אפשר, עם נדנוד בפחות מ-100 סל"ד) לצורך הכלאה של DNA-DNA.
- מעבירים את האשכים בחזרה לצלחת עוברית באמצעות קצה מסונן רחב P1,000, ושוטפים אותם ב-2x SSC שחומם מראש ל-50°C למשך 5 דקות.
הערה: לאחר שלב ההכלאה, נדרש שלב שטיפה סופי באמצעות 2x SSC; זה משחק תפקיד חשוב בהסרת כל אות רקע שנגרם על ידי נוכחות של בדיקות unhybridized בתוך רקמת האיבר. אם קיים אות רקע חזק, מומלץ לחזור על שלב הכביסה האחרון. - הסר את 2x SSC, והרכיב את האשכים באמצעות אמצעי הרכבה זמין מסחרית עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (ראה רשימת חומרים) על שקופית זכוכית חלבית, אטום עם חומר איטום החלקה, ודגר במשך שעתיים לפחות ב- RT בחושך.
- בצע הדמיה קונפוקלית. ניתן לדמיין את כל האשכים באמצעות מטרות טבילה בשמן 40x או 63x. אם מבוצעת מחסנית z, אנו ממליצים להשתמש בצעד z של 1.25 מיקרומטר.
Representative Results
בעבודה זו, WFISH שימש כדי לחקור את התנהגות הכרומוזומים במהלך spermatogenesis ב An. gambiae. הצעד המכריע הראשון ליישום פרוטוקול זה הוא השגת אשכים המראים רמה נמוכה של שינוי מורפולוגי לאחר דיסקציה. ידע בסיסי באנטומיה של היתוש נדרש כדי לבצע דיסקציה מוצלחת של האשכים, ולהלן ניתנות כמה הנחיות להליך זה. אצל יתוש האנופלס , ניתן למצוא אשכים בוגרים השוכבים בקטע הבטן השישי של שלבי הגלמים והבוגרים21. כפי שניתן לראות באיור 1, כלי הדם מחברים את האשכים לבלוטות העזר הגבריות (MAGs), אשר ממוקמות בחלק האחרון של הבטן. המאגדים מחוברים לצינור שפיכה ייחודי המעביר את הזרע ונוזלי הזרע לאיבר הקופולטורי ולחלק החיצוני של מנגנון איברי המין הגברי21. ניתן לנתח את כל מנגנון איברי המין הגברי הפנימי בגישות שונות בהתאם לשלב החיים של היתוש. במהלך שלב הגולם, ניתן לזהות בקלות אשכים באמצעות סטריאומיקרוסקופ לאורך הקוטיקולה הקלה על-ידי התבוננות בצד הגחוני של הבטן בקרבת החלק השישי (איור 1). כדי לנתח את האשכים, ניתן לבודד את החלק התחתון של הבטן, כולל החלק השישי, משאר הגוף באמצעות זוג מחטים ולהעביר לטיפה נקייה של PBS 1x. לאחר הסרת הקטע האחרון, ניתן למעוך את כל המנגנון מהבטן על ידי הפעלת לחץ עדין עם המחטים המנתחות. כדי לנתח את האשכים מזכרים בוגרים, השלב הראשון כולל בידוד של כל הבטן בטיפה טרייה של PBS 1x ואז שליפת החלק האחרון הנושא את האבזמים, שהם מבני הרבייה הזכריים (איור 1). בשלב זה, החלק התחתון של הפצ"רים אמור להופיע ולהיות קל לזיהוי בשל צבעם הצהוב. לאחר מכן ניתן לשלוף את כל המנגנון הגברי החוצה באיטיות בעזרת מחט או מלקחיים בטיפה של PBS 1x עד שזוג האשכים המחוברים לכלי הדם נראים לעין. לפני שממשיכים בקיבוע, חשוב לבודד את האשכים מהחלקים האחרים של המנגנון הגברי על-ידי חיתוך בקרבת החלק התחתון של כלי הדם (איור 1).
גיל הגלמים או הזכרים הבוגרים הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בהתאם לשלב הזרע הנחקר. ב An. gambiae , spermatogenesis מתחיל בשלב המוקדם/אמצע הגולם, והוא נמשך לאורך כל חייו של הפרט24. בין 3 שעות ל -10 שעות לאחר הגור, השלבים הפרמיוטיים והמיוטיים מיוצגים יותר באשכים (שלב מיוטי, חלוקות מיוטיות), הדנ"א הזרעוני אינו מעובה יחסית, וזרעונים בוגרים טרם נוצרו. גלמים מאוחרים ובוגרים בני יום אחד מציעים איזון טוב בין השלב הפרה-מיוטי, השלב המיוטי והשלב הפוסט-מיוטי (איור 2 ואיור 3). אצל מבוגרים בני יותר מ -4 ימים, השלבים הפרמיוטיים והזרעונים מיוצגים פחות, והאשכים תפוסים בעיקר על ידי זרע בוגר הכלול במאגר הזרע.
כדי לחקור את ההתנהגות של כרומוזומי המין בשלבים שונים של ספרמטוגנזה, WFISH בוצע על אשכים שנותחו בשלב הגולם המאוחר כדי להבטיח ייצוג טוב של התהליך כולו. כדי לעקוב אחר ההתנהגות של כרומוזומים אלה, נעשה שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות לרצפים חוזרים הממוקמים אך ורק על כרומוזום X או Y. ניתן לייצר את הגשושיות הפלואורסצנטיות באמצעות PCR או להשיג אותן באופן מסחרי כאוליגונוקלאוטידים מסומנים בקצה. מומלץ להשתמש באוליגו באורך של >40 bps כדי לאפשר זיהוי אות טוב מבדיקת האוליגו הפלואורסצנטית. מניסיוננו, אוליגו מסומן קצה 3' מתפקד טוב יותר מאשר בדיקות המסומנות PCR במונחים של זיהוי אותות. בנוסף, מספר העותק של רצף היעד הוא גורם שעשוי להשפיע על היעילות של WFISH. אם ההתוויה אינה מצליחה, מומלץ להשתמש בשיטת התיוג PCR על מקטע ארוך יותר או לעצב מספר אוליגו ספציפיים לאזור היעד.
השיטות הנוכחיות, המבוססות על שימוש בתמיסה חודרת (1% טריטון/0.1 M HCl ב-1x PBST), מאפשרות רמה טובה של חדירת האשכים וחדירה של הגשושיות, וכתוצאה מכך תגובת הכלאה מוצלחת. ניתן לתכנן בדיקות אוליגו ספציפיות לרצפים חוזרים של כרומוזומי מין בהתבסס על אפיון נרחב של אלמנטים חוזרים המבוצעים על ידי הול ואחרים. בנוסף, ניתן לקבל רצפי קונצנזוס ספציפיים לאלמנטים חוזרים מקושרי X או Y באמצעות פלטפורמה ביואינפורמטית כגון צינור RedKmer30. חשוב לשים לב כי גשושיות כרומוזומי מין יכולות להתמקד באלמנטים חוזרים כגון לוויינים ורטרוטרנספוזונים, והן יכולות להיות ברמה שונה של הכלאה עם כרומוזומי X או Y בהתאם למין הנבדק 20,31,32. כפי שניתן לראות באיור 3, רמה טובה של הכלאה של הגשושיות ורקע נמוך אפשרו הדמיה של הכרומוזומים הממוקדים במהלך הזרע. ניתן היה לראות את הזיווג של כרומוזומי המין המסומנים בשלבים הפרמיוטיים והמיוטים. לאחר מכן התגלה כרומוזומי X או Y בגרעין התא הפלואידי כתוצאה מחלוקות מיוטיות. לאחר מכן, ניתן היה לעקוב אחר זרעונים נושאי X או Y לאורך הזרע, המסומן ברמות שונות של עיבוי DNA, עד לשלב הסופי של זרעונים בוגרים בצורת חץ. במערך הניסוי הנוכחי, נעשה שימוש בערימות Z קונפוקליות כדי להשיג מידע על הארגון המרחבי התלת-ממדי של התאים במהלך תהליך זה (וידאו 1).
איור 1: אשכים שנותחו מגלמים ומזכרי אנופלס גמביה בוגרים בני יום אחד. (A) בטן שנחתכה בשלב הגולם המאוחר המראה את מיקום האשכים בקרבת מקטע הבטן השישי. ניתן לזהות את האשכים לאורך הקוטיקולה ולהופיע כמבנים חומים משני צידי הבטן (עם חצים). (B) אשכים שנחתכו בשלב הגולם, המראים את האשכים הבוגרים (1), vas deferens (2), MAGs (3) וצינור שפיכה (4). (C) בטן שנותחה מזכר בוגר בן יום אחד לאחר הסרת מקטע האבזם הבסיסי. ניתן למעוך את המאגים מהבטן על ידי הפעלת לחץ עדין (חץ לבן). (D) מנגנון רבייה פנימי זכרי שנותח מזכר בוגר בן יום אחד. החץ הלבן מציין את המיקום שנכבש על ידי זרע בוגר, המופיע כצבר לבן בקוטב הבסיסי של האשכים. פסי קנה מידה: (A,C) 200 מיקרומטר; (B,D) 100 מיקרומטר. הספרות הרומיות מ-I עד VIII מציינות את מקטעי הבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייצוג של זרע בגמביה אנופלס. התמונה משמאל מראה An. gambiae late pupa testis לאחר צביעת DAPI בהרכבה שלמה. בצד ימין נמצאת גרסה סכמטית להדמיה טובה יותר. על ידי התבוננות בצורה הגרעינית וברמת העיבוי, קל יחסית לעקוב אחר כל שלבי הזרע מתאים דיפלואידיים ועד זרעונים הפלואידים. גומחת תאי הגזע ממוקמת בקוטב העליון של האיבר, שם מתחיל התמיינות לזרעונים. מספרם של תאי הזרע גדל לאחר חלוקה מיטוטית (תאים ירוקים), ותאי הזרע גדלים (תאים צהובים). תאי הזרע מתמיינים לזרעונים לאחר סבבים מרובים של חלוקות מיטוטיות (תאים כחולים). הזרעונים, המאופיינים בגרעינים גדולים יחסית לתאי השלבים האחרים של התהליך, הם התאים שיעברו חלוקה מיוטית. תאים שעוברים מיוזה יכולים להיות מזוהים על ידי התבוננות בנוכחות כרומוזומים בשלבים מיוטיים שונים; ניתן לזהות כרומוזומים של כיאזמטה ומטאפאזות גם בהגדלה נמוכה. השלבים הפרה-מיוטיים מיוצגים יתר על המידה באשכים שנחתחו בשלב הגולם המוקדם. לאחר החטיבות המיוטיות הראשונה והשנייה, מיוצרים זרעונים ובדרך כלל ניתן למצוא אותם שוכבים באמצע האשכים. גרעיני הזרעונים מראים מידה מסוימת של שונות בצורתם, מצורה עגולה לצורה דמוית חץ. הזרעונים נכנסים לתהליך הזרע, שבמהלכו הגרעינים מתחילים להתעבות, והמבנה שלהם משתנה לנקודות דמויות חץ. כאשר יתושים מתבגרים מינית לאחר הופעתם, זרעונים המכילים זרעונים בוגרים יכולים לתפוס את רוב נפח האשכים על חשבון זרעונים בשלב אחר של התפתחות. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. הכוכבית (*) מציינת את החלק האפי של האשכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: WFISH על An. gambiae testis מנותח משלב הגלמים המאוחר. WFISH בוצע באמצעות בדיקות ספציפיות לכרומוזומי X (Contig_240) ו-Y (בדיקת אוליגו ספציפית לכרומוזומי AgY53B). (A) WFISH מאפשר לעקוב אחר התנהגות כרומוזום המין במהלך ספרמטוגנזה מתאים דיפלואידים לזרעונים הפלואידים. בתמונה זו ניתן להעריך את השינויים הדרמטיים שעוברים הגרעינים במהלך הזרע. תיוג כרומוזומי המין מאפשר הבחנה בין תאים דיפלואידים לתאים הפלואידים. בתאים דיפלואידיים, האות מכרומוזומי המין קשור לאותם גרעינים. בתאים הפלואידים (זרעונים וזרעונים), האות של כרומוזומי המין אינו מקושר עקב החלוקה הרדוקציונית המיוטית. (ב,ג) תמונה בהגדלה גבוהה יותר (63x) של האשכים מוצגת ב-(A). הם נרכשו בעמדות שונות לאורך ציר Z. המסגרות המקווקוות הלבנות מציינות את אזור הרכישה. (B) שלב המעבר בין זרעונים לזרעונים, המראה היווצרות תאים הפלואידים והפרדת האותות מכרומוזומי המין לגרעינים נפרדים. (C) שלב המעבר בין זרעונים הפלואידים לזרעונים בוגרים. שלב זה מציג את השינויים ברמת העיבוי הגרעיני; זרעונים בוגרים מראים צורה דחוסה ומוארכת יותר מאשר זרעונים. מוטות קנה מידה: (A), 30 מיקרומטר; (B,C), 10 מיקרומטר; אפור: DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| רצף יעד | קונצנזוס של Primer Sequence ו-Oligo-probe | הפניה |
| Contig_240 (X) | 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorochrome] |
19 |
| AgY53B (Y) | 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorochrome] |
מחקר זה |
| AgY477- AgY53B צומת אזור (Y) |
5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochrome] |
19 |
| 18S rDNA (X) | F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
19 |
| AgY53B (Y) | F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCCTTACCTTAAAGCCTAG |
19 |
טבלה 1: רשימת בדיקות אוליגו ספציפיות לכרומוזום X או Y ב- An. gambiae.
וידאו 1: ערימה תלת ממדית על WFISH שבוצעה על An. gambiae testis שנותח משלב הגולם המאוחר. כדי לקבל ייצוג תלת ממדי של תהליך הזרע, ניתן לבצע מחסנית תלת ממדית קונפוקלית על אשכים המראים מספר נמוך של שינויים מבניים. במחקר זה, הערימות בוצעו במרווח של 1.25 מיקרומטר בין שני מקטעים אופטיים תחת עדשת שמן 63x או 40x כדי לא לאבד מידע על הארגון המרחבי התלת-ממדי של התאים. אפור: DAPI, צהוב: Contig_240 (X), מגנטה: AgY53B (Y). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Discussion
בדרך כלל, פרוטוקולי FISH דורשים מעיכה של האיבר המעניין כדי לאפשר צביעת כרומוזומים. זה גורם לאובדן מידע לגבי הסידור המרחבי של התאים בתוך אותו איבר33. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לחקור תהליכים ביולוגיים, כגון ספרמטוגנזה, באתרם תוך שמירה על המבנה הטבעי השלם של האשך והארגון הציטולוגי הפנימי שלו. גשושיות המכוונות לאלמנטים שונים החוזרים על עצמם בדנ"א, המועשרים במיוחד בכרומוזומי מין20, יכולות לשמש בו זמנית כדי לחשוף את הדינמיקה של התבגרות הזרע. בהתאם לעיתוי של דיסקציה האשכים, WFISH מציע את ההזדמנות ללמוד שלבים שונים של spermatogenesis באמצעות התפתחות יתושים. WFISH שימושי לחקר תופעות ספציפיות כגון חוסר תאימות היברידית, אשר, ביתושים אנופלס, נובע מנוכחות של פגמים מיוטיים כגון כשל premeiotic ו כרומוזום מין אי ניתוק 19,34,35. מלבד ההיבט הביולוגי, ספרמטוגנזה היא המטרה של מספר אסטרטגיות גנטיות שפותחו כדי לשלוט חרקים מזיקים כגון יתושי אנופלס. בהקשר זה, מוקד rDNA מקושר X של An. gambiae שימש כמטרה לפיתוח עיוות יחס מין סינתטי, אשר, על ידי פגיעה בזרע נושא X, מטה את הצאצאים כלפי זכרים 4,8,13.
טכנולוגיה זו משקפת את פעולתם של דחפים מיוטיים טבעיים ביחס מין שזוהו במספר טקסים, כולל יתושים, אך עדיין אינם מובנים היטב 28,36,37,38,39,40,41. WFISH מציעה הזדמנות לחקור תופעה זו וסוללת את הדרך לשכלול או שיפור אסטרטגיות גנטיות מבוססות עיוות מין על ידי, למשל, מתן מידע על האופן שבו הציטולוגיה של ייצור הזרע מושפעת מבחירת אתרי היעד המשמשים לגריסת כרומוזומי מין. אמנם, מניסיוננו, WFISH מראה סיכויי הצלחה גבוהים, כישלון עדיין יכול להתרחש. זה יכול להיות בגלל רמה לא יעילה של חדירות רקמות, אשר ניתן להתגבר על ידי הגדלת זמן הדגירה של הפתרון החודר. לחלופין, ניתן להשתמש בפרוטאינאז K במהלך שלב החדירה. בחלק מהמקרים שמנו לב לרמה לא אחידה של חדירת גשושיות, עם אות גבוה יותר בגרעין הזרעונים ואות נמוך או נעדר בשלבי המיוטי והזרע. זה יכול להיות בגלל הבדל ברמת permeabilization בהתאם לשלב התא. בנוסף, WFISH הוכיח את עצמו כבעל ערך בעת שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות שנועדו להתמקד ברצפי DNA הנמצאים במספרי העתקה גבוהים. כאשר מתמקדים בגנים בעלי עותק יחיד, ייתכן שזיהוי האות אינו מספיק. במקרה זה, שיטות להגברת אותות, כגון הגברת אות טירמיד (TSA), חייבות להיות משולבות42.
פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם immunostaining או עם זני כתב טרנסגניים בעלי סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים לנבט16,18, שכן זה יוסיף מידע על לוקליזציה של חלבונים וביטוי גנים באתרם. בעבודה זו, WFISH מתואר כטכניקה לחקור spermatogenesis ב יתושי אנופלס; עם זאת, בהתחשב באנטומיה המשותפת של איברי הרבייה הגבריים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מיני יתושים אחרים הממלאים תפקיד בהעברת מחלות. באופן דומה, ניתן לחקור את הגמטוגנזה הנשית באמצעות טכניקה זו. בנוסף, מחקרים ציטולוגיים באיברים או רקמות מעניינים, כגון יתוש המעי האמצעי, שהוא יעד לפלישת טפילים, או רקע גנטי לא טיפוסי, כגון אלה של יתושים היברידיים, ניתן לחקור43. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מועברת באופן פוטנציאלי לאורגניזמים אחרים בתוך סדר דיפטרה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן ביל ומלינדה גייטס ופילנתרופיה פתוחה. אנו מודים למתקן לדימות באמצעות מיקרוסקופ אור (FILM) באימפריאל קולג' בלונדון על ניתוח המיקרוסקופ. איור 2 נוצר באמצעות Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
| ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
| Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
| Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
| RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
| Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
| Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
| SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
| UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
| Primer sequences | |||
| 5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
| 5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
| 5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
| F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
| F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |
References
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
- Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977 (2014).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
- Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158 (2019).
- Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
- Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218 (2022).
- Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
- Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
- Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139 (2016).
- Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
- Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
- Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841 (2019).
- Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255 (2015).
- Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13 (2009).
- Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080 (2019).
- Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
- Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L.
- Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G.
- Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62 (2006).
- Fabian, L., Brill, J. A.
- Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374 (2021).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
- Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
- Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160 (2019).
- Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
- Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327 (2020).
- Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
- Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215 (2012).
- Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207 (2021).
- Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
- Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
- Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
- Jaenike, J.
- Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430 (2019).
- Zanders, S. E., Unckless, R. L.
- Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
- Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15 (2014).
- Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).
