Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Helmontert fluorescens in situ hybridisering for å studere spermatogenese i Anopheles mygg

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65356
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech
* These authors contributed equally

Summary

Gitt deres enkle anatomi, tilbyr Anopheles testikler en god cytologisk modell for å studere spermatogenese. Denne protokollen beskriver helmontert fluorescens in situ hybridisering, en teknikk som brukes til å undersøke denne biologiske prosessen, samt fenotypen av transgene stammer som har mutasjoner i gener involvert i sædproduksjon.

Abstract

Spermatogenese er en kompleks biologisk prosess der diploide celler gjennomgår suksessiv mitotisk og meiotisk deling etterfulgt av store strukturelle endringer for å danne haploide spermatozoer. Foruten det biologiske aspektet, er studier av spermatogenese av avgjørende betydning for å forstå og utvikle genetiske teknologier som gendrift og syntetiske kjønnsforholdsforvrengninger, som ved å endre henholdsvis mendelsk arv og sædkjønnsforholdet kan brukes til å kontrollere skadedyrpopulasjoner. Disse teknologiene har vist seg å være svært lovende i laboratorieinnstillinger og kan potensielt brukes til å kontrollere ville populasjoner av Anopheles-mygg , som er vektorer av malaria. På grunn av testisanatomiens enkelhet og deres medisinske betydning, representerer Anopheles gambiae, en stor malariavektor i Afrika sør for Sahara, en god cytologisk modell for å studere spermatogenese. Denne protokollen beskriver hvordan helmontert fluorescens in situ hybridisering (WFISH) kan brukes til å studere de dramatiske endringene i cellekjernestruktur gjennom spermatogenese ved bruk av fluorescerende prober som spesifikt flekker X- og Y-kromosomene. FISH krever vanligvis forstyrrelse av reproduktive organer for å eksponere mitotiske eller meiotiske kromosomer og tillate farging av spesifikke genomiske regioner med fluorescerende prober. WFISH muliggjør bevaring av testisens opprinnelige cytologiske struktur, kombinert med et godt nivå av signaldeteksjon fra fluorescerende sonder rettet mot repeterende DNA-sekvenser. Dette gjør det mulig for forskere å følge endringer i kromosomal oppførsel av celler som gjennomgår meiose langs organets struktur, hvor hver fase av prosessen tydelig kan skilles. Denne teknikken kan være spesielt nyttig for å studere kromosommeiotisk parring og undersøke cytologiske fenotyper assosiert med for eksempel syntetiske kjønnsforholdsforvrengere, hybrid mannlig sterilitet og utslag av gener involvert i spermatogenese.

Introduction

Malaria legger en enorm byrde på helse og velvære for den globale menneskelige befolkningen. I 2021 estimerte Verdens helseorganisasjon (WHO) at malaria forårsaket 619.000 dødsfall, hvorav 96% skjedde i Afrika sør for Sahara1. Sykdommen overføres av mygg som tilhører Anopheles-slekten, og i Afrika sør for Sahara har tre arter, nemlig Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) og Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) en uforholdsmessig stor rolle i malariaoverføring, og står for 95% av malariatilfeller globalt. Kontrollprogrammer som er avhengige av tradisjonelle metoder som insektmidler og antimalariamidler har reddet millioner av liv; De siste årene har imidlertid den økende motstanden mot disse kontrollmetodene utfordret deres effektivitet 1,2. I tillegg har restriksjoner pålagt av COVID-19-pandemien påvirket tilgjengeligheten av viktige malariakontrollintervensjoner, som ifølge WHO World Malaria Report 2022 har økt malariaforekomsten1. I de siste to tiårene har nye genetiske kontrollmetoder blitt utviklet i laboratorieinnstillinger for å målrette Anopheles mygg 3,4,5,6,7,8,9,10. Blant disse strategiene virker de som er basert på gendriftsystemer (GDS) og syntetiske kjønnsforholdsforvrengere (SD) lovende. GDS er avhengige av muligheten for å overføre, med svært høy frekvens, en genetisk modifikasjon som påvirker kvinnelig fruktbarhet eller svekker parasittenes livssyklus i myggen 5,11,12. SD-er handler i stedet ved å forskyve kjønnsforholdet mellom et myggavkom mot hanner, noe som over tid fører til kollaps av en målpopulasjon på grunn av mangel på kvinner 4,6,13. Hovedkomponentene i disse genetiske systemene virker primært på myggens reproduktive organer, hvor gameter, egg og sæd produseres etter meiotisk deling14.

I denne protokollen brukes fremskritt innen cytogenetiske teknikker for å utforske spermatogenese i An. gambiae med fokus på kromosomenes oppførsel in situ. Strukturen til myggtestisene og de biologiske prosessene som foregår i den, har tidligere blitt undersøkt ved hjelp av en rekke cytologiske metoder, for eksempel immunfluorescens, fluorescerende reportertransgener og DNA- og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)15,16,17,18,19,20; Organene viser en spindellignende form, hvor den nedre polen er festet til en deferent kanal forbundet med de mannlige tilbehørskjertlene. I den øvre polen prolifererer germline stamceller nisje og differensierer til spermatogoniceller innebygd i spermatocyster dannet av somatiske celler. Etter flere runder med mitotisk deling, skiller spermatogonia seg inn i spermatocytter, som går inn i meiose. Ved profase parrer autosomer og kjønnskromosomer seg med sine homologer, og kryssing finner sted. Etter de meiotiske divisjonene genereres runde haploide spermatider og går inn i spermiogenese, og denne prosessen fører til dannelsen av modne haploide spermatozoer der cytoplasma er fjernet, nukleærkromatinet kondenseres, og flagella oppstår ved den basale delen av kjernene21,22 (figur 1 og figur 2).

Generelt starter spermiogenese rundt midten av puppestadiet, og modne spermatozoer kan påvises i sent puppestadium i sædreservoaret23. Modningsprosessen av spermatocystene fortsetter i voksenlivet23,24,25. I Anopheles-testikler kan hvert trinn av spermatogenese lett identifiseres ved å se på cellemorfologien i hver spermatocyst (figur 2). Helmontert fluorescens in situ hybridisering (WFISH), beskrevet i denne protokollen, tillater forskere å spesifikt merke en kromosomal region og spore den under spermatogenese samtidig som den opprinnelige strukturen til organ- og cellekjerneposisjonen opprettholdes; Dette representerer en fordel sammenlignet med standard DNA FISH-protokoll der orgelet vanligvis klemmes, noe som fører til vevskader19. I den nåværende protokollen brukes fluorescerende prober til å flekke repeterende sekvenser på kjønnskromosomene og dermed spore deres oppførsel under spermatogenese, fra diploide delende celler til modne haploide spermatozoer. WFISH kan være spesielt nyttig for å studere kjønnskromosommeiotisk parring og undersøke cytologiske fenotyper assosiert med for eksempel syntetiske kjønnsforholdsforvrengere, hybrid mannlig sterilitet og utslag av gener involvert i spermatogenese 4,19,26,27.

Gitt sin rolle som malariavektorer, er Anopheles-mygg målet for et økende antall genetiske vektorkontrollstrategier, som ofte virker i reproduktive organer av disse organismene. Det er generert flere myggmutanter og cytologiske fenotyper som krever at nye cytologiske teknikker undersøkes26,27,28,29. Metoden beskrevet i denne studien kaster lys over forståelsen av spermatogenese, samt de cytologiske mekanismene bak genetiske strategier som har potensial til å kontrollere malariaoverførende mygg.

Protocol

1. Merking av DNA-sonde

MERK: Nedenfor er de tekniske trinnene for å generere fluorescerende DNA-prober som spesifikt merker kjønnskromosomene til An. gambiae mygg.

  1. Sondemerking ved hjelp av PCR
    1. Ekstraher genomisk DNA fra pupper eller voksne menn for å merke X- eller Y-kromosomene ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig genomisk DNA-ekstraksjonssett (se materialtabellen).
    2. Forbered PCR-reaksjonsblandingen: 200 ng genomisk DNA, 0,05 mM umerket nukleotid (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP og 1 uL fluorescerende merket dUTP (Cy3, Cy5 eller en annen fluorokrom), 50 pmol fremover og bakover primer (tabell 1), 5 μL 10x PCR-buffer og 10 U Taq DNA-polymerase (se materialtabell).
    3. For å merke 18S rDNA og satellitt AgY53B (tabell 1), utfør en PCR-reaksjon ved bruk av følgende PCR-parametere: en syklus på 95 °C i 10 minutter; 35 sykluser på 95 °C i 30 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 45 s; en syklus på 72 °C i 5 minutter; og et endelig hold ved 4 °C.
      MERK: For å oppnå en god sondekonsentrasjon med PCR-merkingsmetoden (~1 μg i 5 μL), som er kritisk for en vellykket WFISH, bør PCR-reaksjonen være svært effektiv. Av denne grunn, før du merker sonden, anbefales det sterkt å teste effekten av primerne som er valgt for forsterkningen. I tillegg vil inkludert en positiv kontroll i PCR-reaksjonen (uten fluorescerende dUTP) bidra til å verifisere effekten av merkingsreaksjonen.
    4. Oppbevar sonden ved -20 °C på et mørkt sted.
  2. Oppnå 3' endefluorescerende oligonukleotidprober
    1. Oppnå kommersielt tilgjengelige fluorescerende oligonukleotidprober som modifiserte oligoer ved å tilsette Cy3- eller Cy5-fluorokromer (eller andre fluorokrom) til 3'-enden av nukleotidsekvensen (se materialtabell). Se primere/oligonukleotid i tabell 1 for referansesekvensene som brukes til å merke den Y-koblede satellitten AgY477-AgY53B kryssregion og den X-koblede satellitten fra Contig_240.
      MERK: Det er ingen tekniske hindringer knyttet til konsentrasjonen av 3' endemerkede oligonukleotider, da brukeren vanligvis kan velge dette før kjøp. Vi foreslår å fortynne ~800 ng oligo sondeløsning i hybridiseringsbufferen for effektiv merking ved bruk av oligosonden. X- og Y-spesifikke oligosonder er tidligere brukt for WFISH av Liang og Sharakhov19, og referansesekvensen finnes i tabell 1.

2. Fremstilling av hybridiseringsløsningen

MERK: De fluorescerende sondene som genereres i trinn 1, må inkorporeres i en kjemisk løsning som hybridiserer med målsekvensene.

  1. Sondefelling før fluorescens in situ hybridisering
    1. Til et 1,5 ml rør, tilsett 5 μL merket DNA-sonde (hvis oppnådd ved PCR-merkingsmetoden) eller 2,2 μL 3' modifisert oligosonde (~ 800 ng sonde) fra trinn 1 og 5 μL laksesperm-DNA (se materialtabell). Kombiner sondene som er spesifikke for forskjellige genomiske regioner i samme rør, og bruk dem som en unik løsning i de følgende trinnene.
    2. Utfell DNA-sonden ved å tilsette 0,1 volum 3 M natriumacetat og 2 volumer 100% etanol. Oppbevares ved -20 °C i minst 2,5 timer (økning av inkubasjonstiden ved -20 °C vil øke sluttutbyttet). På dette stadiet kan sondene også lagres over natten før sentrifugering.
    3. Sentrifuge ved 17 000 x g ved 4 °C i 20 minutter, fjern etanolen og lufttørk pelleten ved RT i mørket i ~20 min.
  2. Hybridiseringsløsning
    1. Før du fortsetter med testisdisseksjonen (trinn 3), klargjør hybridiseringsbufferen ved å blande følgende reagenser i et 1,5 rør: 500 μL formamid, 0,2 g dekstransulfat, 100 μL 20x natriumsaltvannsitrat (SSC) og 200 μL sterilH200(se materialfortegnelse). Virv hybridiseringsløsningen i 1 min, og la dextransulfatet oppløses ved 37 °C i 30 minutter.
    2. Løs opp pelleten fra trinn 2.1.3 i 20-30 μL hybridiseringsbuffer (virvel i ca. 1 min, utfør et raskt spinn og oppbevar rørene ved 37 °C i mørket) for å oppnå hybridiseringsløsningen.

3. Testis disseksjon og fiksering

  1. Ved romtemperatur (RT), dissekere21 minst ~ 20 testikler fra pupper eller 1 dag gamle voksne i steril 1x fosfatbufret saltoppløsning (PBS), og overfør dem til et rent mikroskopglass som inneholder en frisk dråpe 1x PBS-løsning.
  2. Overfør testiklene ved hjelp av en P1,000 bredboret filtrert spiss eller spissen av en disseksjonsnål fra 1x PBS-dråpen til en embryoskål som inneholder 3,7% formaldehyd i 1x PBS med 0,1% Tween-20 (PBST), og inkuber i 10 minutter ved RT.
  3. Vask testiklene i 1x PBST i 5 minutter ved RT. Inkuber testiklene i 0,1 mg/ml RNAse A (se materialfortegnelse) fortynnet i steril 1x PBS i 30 minutter ved 37 °C.
  4. Fjern RNAse-oppløsningen, tilsett den penetrerende løsningen (1% Triton/0,1 M HCl i 1x PBST), og inkuber ved RT i 10 minutter.
    MERK: Proteinase K kan brukes som et penetrerende middel ved en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml i 1x PBST for å øke permeabiliseringen av testiklene.
  5. Vask testiklene i 1x PBST to ganger i 5 min hver ved RT.

4. Hybridisering

MERK: Denne delen beskriver de siste trinnene for in situ hybridisering.

  1. Etter vasketrinnet (trinn 3.5), overfør testiklene i et 1,5 ml rør med 20-30 μL hybridiseringsoppløsning som inneholder den tidligere preparerte sonden (trinn 2.2.2). Bruk pipettespissen til å blande oppløsningen forsiktig. Knips forsiktig på røret fem ganger før du går videre til de neste trinnene.
  2. Inkuber i 5 minutter ved 75 °C for DNA-denaturering.
  3. Inkuber over natten ved 37 ° C (hvis mulig, med rocking ved mindre enn 100 rpm) for DNA-DNA-hybridisering.
  4. Overfør testiklene tilbake til en embryoskål ved hjelp av en P1,000 bredboret filtrert spiss, og vask dem i 2x SSC forvarmet til 50 °C i 5 minutter.
    NOTAT: Etter hybridiseringstrinnet er det nødvendig med et siste vasketrinn med 2x SSC; Dette spiller en viktig rolle i å fjerne ethvert bakgrunnssignal forårsaket av tilstedeværelsen av uhybridiserte sonder inne i organvevet. Hvis et sterkt bakgrunnssignal er til stede, anbefales det å gjenta det siste vasketrinnet.
  5. Fjern 2x SSC, og monter testiklene ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (se materialfortegnelse) på et frostet glassglass, forsegle med dekselforseglingsmiddel og inkubere i minst 2 timer ved RT i mørket.
  6. Utfør konfokal bildebehandling. Hele testene kan visualiseres ved hjelp av 40x eller 63x olje nedsenking mål. Hvis en z-stack utføres, foreslår vi at du bruker et z-trinn på 1,25 μm.

Representative Results

I dette arbeidet ble WFISH brukt til å undersøke kromosomoppførselen under spermatogenese i An. gambiae. Det første avgjørende trinnet for å anvende denne protokollen er å skaffe testikler som viser et lavt nivå av morfologisk endring etter disseksjon. Grunnleggende kunnskap om mygganatomien er nødvendig for å utføre en vellykket testisdisseksjon, og nedenfor er det gitt noen veiledninger for denne prosedyren. I Anopheles-myggen kan modne testikler bli funnet liggende i det sjette abdominale segmentet av puppe- og voksenstadiene21. Som vist i figur 1 forbinder vas deferensene testiklene med de mannlige tilbehørskjertlene (MAG), som ligger i det siste segmentet av abdomen. MAG-ene er koblet til en unik ejakulasjonskanal som leverer sædene og sædvæskene til det kopulerende organet og den ytre delen av det mannlige kjønnsapparatet21. Hele det indre mannlige kjønnsapparatet kan dissekeres ved hjelp av forskjellige tilnærminger avhengig av myggens livsstadium. Under puppestadiet kan testiklene lett identifiseres ved hjelp av et stereomikroskop gjennom hele lysbåndet ved å se på den ventrale siden av abdomen i nærheten av det sjette segmentet (figur 1). For å dissekere testiklene, kan den nedre delen av magen, inkludert det sjette segmentet, isoleres fra resten av kroppen ved hjelp av et par nåler og overføres til en ren dråpe på 1x PBS. Etter fjerning av det siste segmentet, kan hele apparatet klemmes ut av magen ved å påføre forsiktig trykk med dissekerende nåler. For å dissekere testiklene fra voksne hanner, innebærer det første trinnet å isolere hele magen i en ny dråpe på 1x PBS og deretter trekke ut det siste segmentet som bærer låsene, som er de mannlige kopulatoriske strukturene (figur 1). På dette tidspunktet bør den nedre delen av MAG-ene dukke opp og være lett identifiserbare på grunn av deres gule farge. Hele mannsapparatet kan deretter trekkes sakte ut ved hjelp av en nål eller tang i en dråpe på 1x PBS til paret av testikler festet til vas deferensene er synlige. Før du fortsetter med fikseringen, er det viktig å isolere testiklene fra de andre delene av det mannlige apparatet ved å kutte i nærheten av den nedre delen av vas deferensene (figur 1).

Alderen på puppene eller voksne hanner er en viktig faktor å vurdere, avhengig av spermatogenesestadiet som undersøkes. Hos An. gambiae starter spermatogenesen i tidlig/midten av puppestadiet, og den fortsetter gjennom hele individets liv24. Mellom 3 timer og 10 timer etter puppingen er de premeiotiske og meiotiske stadiene mer representert i testiklene (meiotisk profase, meiotiske divisjoner), spermatid-DNA er relativt ukondensert, og modne sædceller er ennå ikke dannet. Sene pupper og 1 dag gamle voksne gir en god balanse mellom de premeotiske, meiotiske og postmeiotiske stadiene (figur 2 og figur 3). Hos voksne som er over 4 dager gamle, er de premeiotiske stadiene og spermatocystene mindre representert, og testiklene er hovedsakelig okkupert av modne sædceller inneholdt i sædreservoaret.

For å undersøke oppførselen til kjønnskromosomene under ulike stadier av spermatogenese, ble WFISH utført på testikler dissekert på sent puppestadium for å sikre en god representasjon av hele prosessen. For å følge oppførselen til disse kromosomene ble fluorescerende prober som er spesifikke for repeterende sekvenser som utelukkende ligger på X- eller Y-kromosomet, brukt. De fluorescerende probene kan genereres ved hjelp av PCR eller oppnås kommersielt som 3' endemerkede oligonukleotider. Det anbefales å bruke en oligo med en lengde på >40 bps for å muliggjøre god signaldeteksjon fra den fluorescerende oligosonden. Vår erfaring er at 3' endemerkede oligoer presterer bedre enn PCR-merkede sonder når det gjelder signaldeteksjon. I tillegg er kopinummeret til målsekvensen en faktor som kan påvirke effekten av WFISH. Hvis merkingen mislykkes, foreslås det å bruke PCR-merkingsmetoden på et lengre fragment eller designe flere oligoer som er spesifikke for målområdet.

De nåværende metodene, basert på bruk av en penetrerende løsning (1% Triton / 0,1 M HCl i 1x PBST), tillater et godt nivå av testispermeabilisering og penetrasjon av sondene, noe som resulterer i en vellykket hybridiseringsreaksjon. Oligoprober som er spesifikke for kjønnskromosomrepeterende sekvenser, kan utformes basert på den omfattende karakteriseringen av repeterende elementer utført av Hall et al.20. I tillegg kan konsensussekvenser som er spesifikke for X- eller Y-koblede repeterende elementer oppnås ved hjelp av en bioinformatisk plattform som RedKmer-rørledningen30. Det er viktig å legge merke til at kjønnskromosomprober kan målrette repeterende elementer som satellitter og retrotransposoner, og de kan ha et annet nivå av hybridisering med X- eller Y-kromosomene avhengig av arten som undersøkes 20,31,32. Som vist i figur 3 tillot et godt nivå av hybridisering av sonderne og lav bakgrunn visualisering av de målrettede kromosomene gjennom spermatogenese. Paringen av merkede kjønnskromosomer kunne sees i de premeiotiske og meiotiske stadiene. Dette ble etterfulgt av å oppdage enten X- eller Y-kromosomene i haploide cellekjernekromosomer som følge av meiotiske delinger. Deretter kunne X- eller Y-bærende spermatider følges gjennom spermiogenese, preget av forskjellige nivåer av DNA-kondensasjon, til det siste trinnet av pilformede modne spermatozoer. I det nåværende eksperimentelle oppsettet ble konfokale Z-stakker brukt til å skaffe seg informasjon om 3D-romlig organisering av cellene under denne prosessen (Video 1).

Figure 1
Figur 1: Testikler dissekert fra pupper og 1 dag gamle voksne Anopheles gambiae hanner. (A) En abdomen dissekert på det sene puppestadiet som viser testiklenes posisjon i nærheten av det sjette abdominale segmentet. Testiklene kan identifiseres gjennom hele neglebåndet og vises som brunlige strukturer på begge sider av magen (med piler). (B) Testikler dissekert på puppestadiet, som viser de modne testiklene (1), vas deferens (2), MAGs (3) og ejakulasjonskanalen (4). (C) En mage dissekert fra en 1 dag gammel voksen mann etter fjerning av basal lås segmentet. MAGs kan klemmes fra magen ved å bruke forsiktig trykk (hvit pil). (D) Mannlig indre reproduksjonsapparat dissekert fra en 1 dag gammel voksen mann. Den hvite pilen indikerer posisjonen okkupert av modne sædceller, som fremstår som et hvitt aggregat ved testisens basale pol. Skala barer: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. De romerske tallene fra I til VIII angir abdominalsegmentene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representasjon av spermatogenese i Anopheles gambiae. Bildet til venstre viser en An. gambiae sen puppe testis etter helmontert DAPI farging. Til høyre er en skjematisk versjon for bedre visualisering. Ved å observere kjernefysisk form og kondensasjonsnivå er det relativt enkelt å følge alle spermatogenesestadiene fra diploide celler til haploide spermatozoer. Stamcellenisjen ligger i organets øvre pol, hvor differensiering til spermatogoni starter. Spermatogonicellene øker i antall etter mitotisk deling (grønne blodlegemer), og spermatocystene øker i størrelse (gule blodlegemer). Spermatogoniacellene skiller seg ut i spermatocytter etter flere runder med mitotiske delinger (blå blodlegemer). Spermatocyttene, som er preget av relativt større kjerner enn cellene i de andre stadiene av prosessen, er cellene som vil gjennomgå meiotisk deling. Celler som gjennomgår meiose kan detekteres ved å se på tilstedeværelsen av kromosomer i forskjellige meiotiske stadier; Chiasmata og metafasekromosomer kan detekteres selv ved lav forstørrelse. De premeiotiske stadiene er overrepresentert i testikler dissekert på tidlig puppestadiet. Etter den første og andre meiotiske divisjonen produseres spermatider og kan vanligvis bli funnet liggende i midten av testisene. Kjernene til spermatider viser en viss grad av variasjon i form, fra en rund til en pillignende form. Spermatidene går inn i spermiogeneseprosessen, hvor kjernene begynner å kondensere, og deres struktur endres til pillignende prikker. Når mygg modnes seksuelt etter framvekst, kan spermatocyst som inneholder modne sædceller okkupere det meste av testisvolumet på bekostning av spermatocystene på et annet stadium av utviklingen. Skala bar: 20 μm. Stjernen (*) angir den apikale delen av testisene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: WFISH på en An. gambiae testis dissekert fra sent puppestadiet. WFISH ble utført med sonder spesifikke for X (Contig_240) og Y (oligosonde spesifikk for AgY53B) kromosomer. (A) WFISH gjør det mulig å følge oppførselen til kjønnskromosomet under spermatogenese fra diploide celler til haploide spermatozoer. I dette bildet er det mulig å sette pris på de dramatiske endringene som kjernene gjennomgår under spermatogenese. Merking av kjønnskromosomene tillater diskriminering mellom diploide og haploide celler. I diploide celler er signalet fra kjønnskromosomene knyttet til de samme kjernene. I haploide celler (spermatider og spermatozoer) er signalet fra kjønnskromosomene ukoblet på grunn av den meiotiske reduksjonsdelingen. (B,C) Et bilde med høyere forstørrelse (63x) av testisene vist i (A). De ble anskaffet på forskjellige posisjoner langs Z-aksen. De hvite stiplede rammene indikerer oppkjøpsområdet. (B) Overgangsstadiet mellom spermatocytter og spermatider, som viser dannelsen av haploide celler og separasjonen av signalene fra kjønnskromosomene i separate kjerner. (C) Overgangsstadiet mellom haploide spermatider og modne spermatozoer. Dette stadiet viser endringene i atomkondensasjonsnivået; Eldre spermatozoer viser en mer kondensert og langstrakt form enn spermatider. Skala barer: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Grå: DAPI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Målgruppe Primersekvens og oligosondekonsensus Referanse
Contig_240 (X) 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorokrom]		 19
AgY53B (Y) 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[fluorokrom]		 Denne studien
AgY477-
AgY53B
knutepunkt
region (Y)		 5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorokrom]		 19
18S rDNA (X) F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 19
AgY53B (Y) F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 19

Tabell 1: Liste over oligoprober som er spesifikke for X- eller Y-kromosomet i An. gambiae.

Video 1: En 3D-stabel på WFISH utført på en An. gambiae testis dissekert fra sen puppestadiet. For å oppnå en 3D-representasjon av spermatogeneseprosessen, kan en konfokal 3D-stabel utføres på testikler som viser et lavt antall strukturelle endringer. I denne studien ble stablene utført med et intervall på 1,25 μm mellom to optiske seksjoner under en 63x eller 40x oljelinse for ikke å miste informasjon om 3D-romlig organisering av cellene. Grå: DAPI, gul: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Vanligvis krever FISH-protokoller klemming av organet av interesse for å tillate kromosomfarging. Dette fører til tap av informasjon om det romlige arrangementet av cellene i det organet33. Denne protokollen beskriver hvordan biologiske prosesser, som spermatogenese, kan studeres in situ samtidig som testisens intakte opprinnelige struktur opprettholdes og dens interne cytologiske organisasjon. Prober rettet mot forskjellige DNA-repeterende elementer, som er spesielt beriket i kjønnskromosomer20, kan samtidig brukes til å avsløre dynamikken i sædmodning. Avhengig av tidspunktet for testisdisseksjonen, tilbyr WFISH muligheten til å studere ulike stadier av spermatogenese gjennom myggutvikling. WFISH er nyttig for å studere spesifikke fenomener som hybrid inkompatibilitet, som i Anopheles-mygg skyldes tilstedeværelsen av meiotiske defekter som premeiotisk svikt og kjønnskromosom ikke-disjunksjon 19,34,35. Foruten det biologiske aspektet, er spermatogenese målet for en rekke genetiske strategier utviklet for å kontrollere skadedyrinsekter som Anopheles mygg. I denne sammenhengen har det X-bundne rDNA-lokuset til An. gambiae blitt brukt som et mål for å utvikle en syntetisk kjønnsforholdsforvrengning, som ved å skade X-bærende sædceller forstyrrer avkommet mot hanner 4,8,13.

Denne teknologien speiler virkningen av naturlig kjønnsforhold meiotiske stasjoner som har blitt identifisert i flere taxa, inkludert mygg, men som fortsatt er dårlig forstått 28,36,37,38,39,40,41. WFISH tilbyr muligheten til å undersøke dette fenomenet og baner vei for raffinering eller forbedring av kjønnsforvrengningsbaserte genetiske strategier ved for eksempel å gi informasjon om hvordan cytologien av sædproduksjon påvirkes av valg av målsteder som brukes til kjønnskromosommakulering. Selv om WFISH etter vår erfaring viser store sjanser for suksess, kan fiasko fortsatt oppstå. Dette kan skyldes et ineffektivt nivå av vevspermeabilisering, som kan overvinnes ved å øke inkubasjonstiden til den penetrerende løsningen. Alternativt kan Proteinase K brukes under permeabiliseringstrinnet. I noen tilfeller la vi merke til et ujevnt nivå av sondepenetrasjon, med et høyere signal i spermatocytkjerner og et lavere eller fraværende signal i meiotiske og spermiogenesestadier. Dette kan skyldes en forskjell i permeabiliseringsnivået avhengig av cellestadiet. I tillegg viste WFISH seg å være verdifull ved bruk av fluorescerende prober designet for å målrette DNA-sekvenser som er tilstede i høye kopinumre. Ved målretting av enkeltkopigener kan det hende at signaldeteksjonen ikke er tilstrekkelig. I dette tilfellet må metoder for signalforsterkning, som tyramidsignalforsterkning (TSA), integreres42.

Denne protokollen kan kombineres med immunfarging eller med transgene reporterstammer som har germline-spesifikke fluorescerende markører16,18, da dette vil legge til informasjon om proteinlokalisering og genuttrykk in situ. I dette arbeidet beskrives WFISH som en teknikk for å undersøke spermatogenese hos Anopheles-mygg; Men gitt den delte anatomien til mannlige reproduktive organer, kan denne protokollen brukes på andre myggarter som spiller en rolle i sykdomsoverføring. På samme måte kan kvinnelig gametogenese undersøkes ved hjelp av denne teknikken. I tillegg kan cytologiske studier i organer eller vev av interesse, som myggmidgut, som er et mål for parasittinvasjon, eller atypisk genetisk bakgrunn, som de i hybridmygg, utforskes43. Videre kan denne teknikken potensielt overføres til andre organismer innenfor Diptera-ordenen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Bill &; Melinda Gates Foundation og Open Philanthropy. Vi takker Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) ved Imperial College London for mikroskopianalysen. Figur 2 ble laget med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP Cytiva PA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP Cytiva PA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips ThermoFisher Scientific 2079GPK
CytoBond Removable Coverslip Sealant SciGene 2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits  Qiagen 69504
Embryo Dishes VWR 70543-30
Ethanol, molecular grade Sigma-Aldrich 51976
Formamide ThermoFisher Scientific 17899
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
Hydrochloric acid, 37% Sigma-Aldrich 320331
Microscope slides, SuperFrost VWR  631-0114
PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36941
RNase A/T1 Mix ThermoFisher Scientific EN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U1330
Sodium Acetate Solution ThermoFisher Scientific R1181
SP8 inverted confocal microscope Leica
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution ThermoFisher Scientific 15632011
UltraPure SSC 20x ThermoFisher Scientific 15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics Contig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 Eurofins Genomics 18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
  2. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  3. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  4. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977 (2014).
  5. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  6. Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
  7. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
  8. Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158 (2019).
  9. Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
  10. Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218 (2022).
  11. Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
  12. Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
  13. Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139 (2016).
  14. Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
  15. Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
  16. Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841 (2019).
  17. Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255 (2015).
  18. Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13 (2009).
  19. Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080 (2019).
  20. Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
  21. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
  22. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
  23. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, S6 (2009).
  24. Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62 (2006).
  25. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  26. Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374 (2021).
  27. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
  28. Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
  29. Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160 (2019).
  30. Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
  31. Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327 (2020).
  32. Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
  33. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215 (2012).
  34. Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207 (2021).
  35. Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
  36. Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
  37. Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
  38. Jaenike, J. Sex chromosome meiotic drive. Annual Review of Ecology and Systematics. 32 (1), 25-49 (2001).
  39. Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430 (2019).
  40. Zanders, S. E., Unckless, R. L. Fertility costs of meiotic drivers. Current Biology. 29 (11), R512-R520 (2019).
  41. Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
  42. Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15 (2014).
  43. Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).

Tags

Hele montering fluorescens in situ hybridisering spermatogenese Anopheles mygg genetiske teknologier gendrift syntetisk kjønnsforhold forvrengere insektpopulasjoner mendelsk arv sperm sex ratio Anopheles gambiae malaria vektor cytologisk modell cellekjernestruktur fluorescerende prober FISH reproduktive organer genomiske regioner
Helmontert fluorescens <em>in situ</em> hybridisering for å studere spermatogenese i <em>Anopheles</em> mygg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov,… More

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov, I., Bernardini, F. Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito. J. Vis. Exp. (195), e65356, doi:10.3791/65356 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter