Optimierte Herstellung und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur bakteriellen Herstellung von rekombinanten Proteinen, einschließlich typischerweise unlöslicher oder Disulfidbrücken-haltiger Proteine, die in extrazellulären membrangebundenen Vesikeln verpackt sind. Dies hat das Potenzial, auf vielseitige Bereiche der wissenschaftlichen Forschung angewendet zu werden, einschließlich der angewandten Biotechnologie und der Medizin.

Zusammenfassung

Dieses innovative System, das einen kurzen Peptid-Tag verwendet, der mehrere rekombinante Proteine in membrangebundenen Vesikeln aus E. coli exportiert, bietet eine effektive Lösung für eine Reihe von Problemen, die mit der bakteriellen rekombinanten Proteinexpression verbunden sind. Diese rekombinanten Vesikel unterteilen Proteine in einer Mikroumgebung, die die Produktion von ansonsten schwierigen, toxischen, unlöslichen oder disulfidbrückenhaltigen Proteinen aus Bakterien erleichtert. Die Proteinausbeute ist im Vergleich zur typischen bakteriellen Expression in Abwesenheit des vesikelnukleierenden Peptid-Tags erheblich erhöht. Die Freisetzung von Vesikel-verpackten Proteinen unterstützt die Isolierung aus dem Nährmedium und ermöglicht eine langfristige aktive Proteinspeicherung. Diese Technologie führt zu einer höheren Ausbeute an vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für eine vereinfachte nachgelagerte Verarbeitung für eine Vielzahl von Anwendungen, von der angewandten Biotechnologie bis hin zu Entdeckungswissenschaft und Medizin. Im vorliegenden Artikel und dem dazugehörigen Video wird ein detailliertes Protokoll der Methode bereitgestellt, das die wichtigsten Schritte der Methodik zur Maximierung der rekombinanten proteingefüllten Vesikelproduktion hervorhebt.

Einleitung

Das gramnegative Bakterium E. coli ist ein attraktives System für die rekombinante Proteinproduktion sowohl im industriellen als auch im akademischen Maßstab. Es ist nicht nur kostengünstig und einfach, in Chargen bis zu hohen Dichten zu kultivieren, sondern es wurde auch ein breites Spektrum an Reagenzien, Stämmen, Werkzeugen und Promotoren entwickelt, um die Erzeugung funktioneller Proteine in E. coli¹ zu fördern. Darüber hinaus überwinden Techniken der synthetischen Biologie nun Hindernisse, die typischerweise mit der Anwendung posttranslationaler Modifikationen und der Faltung komplexer Proteine zusammenhängen². Die Möglichkeit, die Sekretion rekombinanter Proteine gezielt in Nährmedien zu fördern, ist attraktiv, um die Ausbeute zu verbessern und die Herstellungskosten zu senken. Die kontrollierte Verpackung von benutzerdefinierten Proteinen in Membranvesikel unterstützt die Entwicklung von Produkten und Technologien in der angewandten Biotechnologie- und Medizinindustrie. Bisher fehlte es an breit anwendbaren Methoden, um rekombinante Proteine aus E. coli ³ zu sezernieren.

Eastwood et al. haben kürzlich eine Peptid-Tagging-basierte Methode zur Herstellung und Isolierung rekombinanter proteinhaltiger Vesikel aus E. coli^{entwickelt 1}. Dieses Vesikel-Nukleating-Peptid (VNp) ermöglicht die Herstellung extrazellulärer bakterieller Membranvesikel, in die das rekombinante Protein der Wahl gezielt eingesetzt werden kann, um die Reinigung und Lagerung des Zielproteins zu vereinfachen, und ermöglicht deutlich höhere Ausbeuten als normalerweise aus Schüttelkolbenkulturen. Es wurden Ausbeuten von fast 3 g rekombinantem Protein pro Liter Kolbenkultur berichtet, wobei die Ausbeuten >100-mal höher waren als bei äquivalenten Proteinen ohne VNp-Tag. Diese rekombinanten, mit Proteinen angereicherten Vesikel können schnell aus den Nährmedien gereinigt und konzentriert werden und bieten eine stabile Umgebung für die Lagerung. Diese Technologie stellt einen großen Durchbruch in der Produktion von rekombinanten E. coli-Proteinen dar . Die Vesikel kompartimentieren toxische und disulfidbrückenhaltige Proteine in löslicher und funktioneller Form und unterstützen die einfache, effiziente und schnelle Reinigung von vesikelverpackten, funktionellen Proteinen für die Langzeitlagerung oder die direkte Verarbeitung¹.

Die wichtigsten Vorteile, die diese Technologie gegenüber den derzeitigen Techniken bietet, sind: (1) die Anwendbarkeit auf eine Reihe von Größen (1 kDa bis >100 kDa) und Proteintypen; (2) Erleichterung der Bildung von Disulfidbrücken zwischen und innerhalb von Proteinen; (3) anwendbar auf Multiproteinkomplexe; (4) kann mit einer Reihe von Promotoren und Standard-Labor-E. coli-Stämmen verwendet werden; (5) die Erzeugung von Proteinausbeuten aus Schüttelkolben, die normalerweise nur bei Fermentationskulturen zu beobachten sind; Proteine werden exportiert und in membrangebundene Vesikel verpackt, die (6) eine stabile Umgebung für die Lagerung des aktiven löslichen Proteins bieten; und (7) vereinfacht die nachgeschaltete Verarbeitung und Proteinreinigung. Dieses einfache und kostengünstige Werkzeug für rekombinante Proteine wird sich wahrscheinlich positiv auf die Biotechnologie- und Medizinbranche sowie auf die Entdeckungswissenschaft auswirken.

Hier beschreibt ein detailliertes, über mehrere Jahre entwickeltes Protokoll die optimalen Bedingungen, um mit der VNp-Technologie rekombinante proteingefüllte Vesikel aus Bakterien herzustellen. Es werden Beispielbilder dieses Systems in der Praxis gezeigt, wobei ein fluoreszierendes Protein exprimiert wird, wodurch das Vorhandensein von Vesikeln in verschiedenen Phasen der Produktion, Reinigung und Konzentration visualisiert werden kann. Abschließend wird eine Anleitung gegeben, wie die Bildgebung lebender Zellen zur Validierung der Produktion von VNp-fusionshaltigen Vesikeln aus den Bakterien verwendet werden kann.

Protokoll

Die bakterielle Arbeit folgt den lokalen, nationalen und internationalen Vorschriften zur Eindämmung der biologischen Sicherheit, die dem jeweiligen biologischen Sicherheitsgefahrenniveau jedes Stammes entsprechen.

1. Auswahl verschiedener VNps

1. Identifizieren Sie die VNp-Sequenzen.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden drei VNp-Sequenzen^{identifiziert1} , die zu einer maximalen Ausbeute und einem vesikulären Export der bisher untersuchten Proteine führen: VNp2, VNp6 und VNp15. Es ist derzeit nicht klar, warum bestimmte VNp-Varianten mit einigen Proteinen effizienter arbeiten als andere; Daher wird empfohlen, mit jeder VNp-Variante (d. h. VNp2, 6 oder 15) Fusionen zwischen einem neuen Protein von Interesse zu erzeugen.
   VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
   AGKTKEGVL
   VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
   AEKTKEGVM
   VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
   Plasmide, die die Expression des interessierenden Proteins mit verschiedenen aminoterminalen VNp-Fusionen ermöglichen, wurden kommerziell verfügbar gemacht (siehe Materialtabelle).
2. Entwerfen Sie eine Klonierungsstrategie, um das interessierende Gen am 3'-Ende der cDNA, die für das VNp kodiert, in eines dieser Konstrukte einzufügen, oder passen Sie ein vorhandenes Plasmid an, indem Sie synthetisierte VNp-cDNA stromaufwärts des ersten ATG-Codons des Gens integrieren, das für das interessierende Protein kodiert. Verwenden Sie die unter¹ beschriebenen Methoden.
3. Verwenden Sie für toxische Proteine einen Vektor mit einem repressiblen Expressionspromotor oder einen Promotor mit minimalem nicht induziertem Expressionsrauschen.
4. Klonen Sie den VNp-Sequenz-Tag am Amino-Terminal des Fusionsproteins. Stellen Sie sicher, dass sich die Affinitätsmarkierungen, Proteasespaltungssequenzen usw. und das interessierende Protein auf der Carboxylseite des VNp-Tags befinden. Es wird empfohlen, das VNp mit einer flexiblen Linkerregion, wie z. B. zwei oder drei Wiederholungen einer -G-G-S-G-peptidsequenz, vom nachgeschalteten Peptid zu trennen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Verwenden Sie Plasmide mit einer Antibiotikaauswahl, die nicht auf Peptidoglykan abzielt, was die Zelloberfläche schwächt und die Vesikelausbeute verringert. Kanamycin und Chloramphenicol (siehe Materialtabelle) waren die bevorzugten Antibiotika, die für diese Studie verwendet wurden.

2. Bakterielle Zellkultur und Proteininduktion

HINWEIS: Bakterienstämme, die typischerweise in diesem Protokoll verwendet werden, sind entweder Escherichia coli BL21 (DE3) oder W3110. E. coli-Zellen werden in Lysogenbrühe (LB) (10 g/L Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Hefeextrakt) oder in hervorragender Bouillon (TB) (12 g/L Trypton; 24 g/L Hefeextrakt; 4 mL/L 10% Glycerin; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K₂HPO₄, Salze separat autoklaviert) kultiviert (siehe Materialtabelle). Beispielbilder, die jeden Schritt der Proteininduktion und des anschließenden Isolierungs- und Reinigungsprozesses zeigen, sind in Abbildung 2 dargestellt.

1. Kultur von 5 ml LB Starter aus frischen bakteriellen Transformationen bei 37 °C bis zur Sättigung und Verwendung zur Inokulation von 25 ml TB in einem 500 ml Erlenmeyerkolben, alles mit geeigneter Antibiotikaauswahl.
2. Das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ist ein wichtiger Faktor bei der Optimierung dieses Systems. Verwenden Sie einen möglichst großvolumigen Kolben (z. B. einen 5-Liter-Kolben mit 1 l Kultur; für Optimierungsläufe verwenden Sie 25 ml des Mediums in einem 500-ml-Kolben).
3. Die größeren Schüttelkolbenkulturen werden in einem Inkubator bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min (≥25 mm Orbitalwurf) inkubiert, bis ein optischer Dichtewert von 600 nm (OD₆₀₀) von 0,8-1,0 erreicht ist.
   HINWEIS: Die Vesikulation ist optimal, wenn die Zellen bei 37 °C gezüchtet werden. Einige rekombinante Proteine müssen jedoch bei niedrigeren Temperaturen exprimiert werden. Wenn dies bei dem interessierenden Protein der Fall ist, muss der VNp6-Tag verwendet werden, da dies einen hochergiebigen Vesikelexport bei Temperaturen von bis zu 25 °C ermöglicht.
4. Um eine rekombinante Proteinexpression aus dem T7-Promotor zu induzieren, wird Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von bis zu 20 μg/ml (84 μM) hinzugefügt (siehe Materialtabelle). Die Induktion der rekombinanten Proteinexpression muss für die Produktion von Vesikeln in der späten logarithmischen Phase (d.h. typischer OD₆₀₀ von 0,8-1,0) erfolgen.
   HINWEIS: Die Länge der Induktionszeit kann je nach Proteinen unterschiedlich sein, wobei einige die maximale Produktion nach 4 Stunden und andere über Nacht (18 Stunden) erreichen. Bisher wurde der maximale Vesikelexport in Übernachtkulturen erzielt.

3. Rekombinante Vesikelisolierung

1. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g (4 °C) für 20 Minuten.
2. Um vesikelhaltige Medien für die Langzeitlagerung zu sterilisieren, führen Sie die gereinigten Nährmedien durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,45 μm Polyethersulfon(PES)-Filter (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um den Ausschluss lebensfähiger Zellen aus dem vesikelhaltigen Filtrat zu testen, auf LB-Agar plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Um die Vesikel auf ein kleineres Volumen zu konzentrieren, werden die sterilen vesikelhaltigen Medien durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,1-μm-Filter für gemischte Celluloseester (MCE) geleitet (siehe Materialtabelle).
4. Waschen Sie die Membran vorsichtig mit 0,5-1 ml sterilem PBS mit einem Zellschaber oder Kunststoffstreuer, um die Vesikel vorsichtig von der Membran zu entfernen. In ein frisches Mikrofugenröhrchen umfüllen.
   HINWEIS: Gereinigte Vesikel können in sterilen Medien oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C gelagert werden. Es gibt Beispiele für rekombinante Proteine, die auf diese Weise 6 Monate lang in diesen Vesikeln gelagert werden, ohne dass die enzymatische Aktivität verloren geht.

4. Freisetzung löslicher Proteine aus isolierten Vesikeln

1. Nachdem die proteinhaltigen Vesikel in das sterile Medium/den sterilen Puffer isoliert wurden, werden die vesikulären Lipidmembranen nach einem für die Apparatur geeigneten Zeitplan (z. B. 6 x 20 s Ein- und Ausschaltzyklen) beschallt und 20 Minuten lang bei 39.000 x g (4 °C) zentrifugiert, um Vesikelreste zu entfernen.
   HINWEIS: Eine osmotische Schock- oder Detergenzienbehandlung kann als Alternative zum Aufbrechen der Vesikel verwendet werden, aber die Auswirkungen auf die Proteinfunktionalität und/oder die nachgeschaltete Anwendung müssen berücksichtigt werden.
2. Wenn die VNp-Fusion zytosolisch bleibt und nicht in das Medium freigesetzt wird, isolieren Sie das Protein unter Verwendung von Standardprotokollen (z. B. Resuspendierung der Zellpellets in 5 ml eines geeigneten Extraktionspuffers (20 mM Tris, 500 mM NaCl), Beschallung und Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugation).

5. Bestimmung der Proteinkonzentration

1. Bestimmung der Proteinkonzentration durch Gel-Densitometrie-Analyse von dreifachen Proben¹. Laufen Sie zusammen mit den Beladungsstandards für Rinderserumalbumin (BSA) auf Coomassie-gefärbten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelelektrophorese-Gelen (SDS-PAGE). Scannen und analysieren Sie die Gele mit geeigneter Software (z. B. Bild J; siehe Materialtabelle).

6. Visualisierung der Vesikelbildung und isolierter Vesikel mittels Fluoreszenzmikroskopie

HINWEIS: Wenn die Zellen fluoreszenzmarkierte VNp-Fusions- oder Membranmarker enthalten, kann die Bildgebung lebender Zellen verwendet werden, um die Vesikelbildung zu verfolgen. Alternativ können fluoreszierende Lipidfarbstoffe verwendet werden, um Vesikel sichtbar zu machen, um die Produktion und Reinigung zu bestätigen.

1. Zellenmontage
   1. Induzieren Sie die VNp-Fusionsexpression für mehrere Stunden, bevor Sie sie auf das Deckglas aufbringen.
   2. Agarose-Pad-Methode (Abbildung 3A-C): Pipettieren Sie die Zellen auf ein dünnes (<1 mm), kreisförmiges LB-Agarose-Pad (2 %), das sich bilden und auf einem sauberen Glasobjektträger abbinden konnte. Lassen Sie die Zellen absetzen und ausgleichen und legen Sie ein 50 mm x 25 mm großes Deckglas auf das Pad und die Zellen. Halten Sie das Deckglas mit Abstandshaltern und Klebeband fest.
   3. Polyethylenimin (PEI)-Methode (Abbildung 3D-F): 20 μl 0,05 % PEI (in dH₂O) mit einer Pipettenspitze auf ein Deckglas verteilen und 3-5 Minuten ohne Trocknen an Glas binden lassen. Fügen Sie 50 μl Zellkultur hinzu und lassen Sie sie 5-10 Minuten einwirken, um sicherzustellen, dass sich Bakterien mit der PEI-beschichteten Oberfläche verbunden haben⁴. Waschen Sie das Deckglas mit 100 μl Medien, bevor Sie es auf den Objektträger legen, und halten Sie es mit Abstandshaltern und Klebeband fest.
2. Montage von Vesikeln
   1. Pipettieren Sie gereinigte Vesikel auf ein dünnes (<1 mm), kreisförmiges LB-Agarose-Pad (2 %), das sich bilden und auf einem sauberen Objektträger abbinden konnte. Sobald die Flüssigkeit getrocknet ist, legen Sie ein 50 mm x 25 mm großes Deckglas auf das Pad und die Vesikel. Halten Sie das Deckglas mit Abstandshaltern und Klebeband fest.
   2. Der fluoreszierende Lipidfarbstoff FM4-64 ist in der Lage, Membranen⁵ zu färben und kann daher zur Visualisierung von Vesikeln verwendet werden. FM4-64 (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 2 μM (aus einem in Dimethylsulfoxid [DMSO] gelösten 2-mM-Stamm) zu gereinigten Vesikeln geben und nach einer 10-minütigen Inkubation abbilden. Dies ist besonders nützlich für die Identifizierung von Vesikel, die nicht fluoreszenzmarkierte Ladungen^{enthalten 5}.
   3. Spülen Sie die Deckgläser mit dem gleichen Medium aus, mit dem die beobachteten Zellen kultiviert wurden.
      HINWEIS: Einige komplexe Medien (z. B. TB) können Autofluoreszenz aufweisen, was zu einem übermäßigen Hintergrundsignal führen kann.
3. Bildgebende Vesikel
   HINWEIS: Beispielmikroskopiebilder von rekombinanten VNp-Vesikeln sind in Abbildung 4 zu sehen.
   1. Montieren Sie den Objektträger mit einem Ölimmersionsobjektiv auf ein inverses Mikroskop (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 2-3 Minuten einwirken, damit sich die Probe setzen und die Temperatur ausgleichen kann.
      HINWEIS: Die gesamte Bildgebung lebender Zellen für jede Probe muss innerhalb von 30 Minuten nach dem Aufbringen der Zellen auf Deckgläser abgeschlossen sein, um die Auswirkungen von Phototoxizität und anaerobem Stress zu minimieren. Aus diesem Grund werden Bilder mit einer Ebene gegenüber Z-Stapeln bevorzugt.
   2. Verwenden Sie geeignete Lichtquellen (z. B. Leuchtdiode [LED] oder Halogenlampe; siehe Materialtabelle) und Filterkombinationen für das/die verwendete(n) fluoreszierende(n) Protein(e)/Farbstoff(e)⁶.
   3. Verwenden Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung (z. B. 100x oder 150x) und hoher numerischer Apertur (z. B. NA ≥1,4) für die Abbildung der mikrobiellen Zellen und Vesikel.
   4. Bestimmen Sie die minimale Lichtintensität, die erforderlich ist, um Fluoreszenzsignale von Zellen und / oder Vesikeln sichtbar zu machen. Dies kann eine Anpassung der Belichtungs- und Verstärkungseinstellungen für die verwendete Kamera erfordern.
      HINWEIS: Die typischen Belichtungszeiten aktueller CMOS-Kameras (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) variieren je nach Bildgebungssystem zwischen 50 und 200 ms.
   5. Verwenden Sie für Einzelbildbilder die Mittelwertbildung aus drei Bildern, um hardwareabhängige zufällige Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
   6. Planen Sie für Zeitrafferaufnahmen 3-5 Minuten zwischen den einzelnen Bildern ein.
      Anmerkungen: Abhängig von der Mikroskopkonfiguration muss der Fokus bei längeren Zeitrafferexperimenten möglicherweise intermittierend angepasst werden.

Ergebnisse

BL21 DE3 E. coli, die das VNp6-mNeongreen-Expressionskonstrukt enthalten, wurden in die späte logarithmische Phase gezüchtet (Abbildung 2A). Die VNp6-mNeongreen-Expression wurde durch Zugabe von IPTG (20 μg/ml oder 84 μM Endkonzentration) induziert, das anschließend über Nacht bei 37 °C unter kräftigem Schütteln (200 U/min, ≥25 mm Orbitalwurf) wachsen gelassen wurde. Am nächsten Morgen zeigte die Kultur mNeongreen-Fluoreszenz⁷ (Abbildung 2B), die nach der Entfernung von Bakterienzellen durch Zentrifugation im Medium sichtbar blieb (Abbildung 2C). Das Vorkommen von VNp-mNeongreen in der Kultur und in den freigegebenen Nährmedien wurde durch SDS-PAGE bestätigt (Abbildung 2D). Die mNeongreen-haltigen Vesikel wurden auf einen 0,1 μm MCE-Filter isoliert (Abbildung 2E) und in PBS resuspendiert (Abbildung 2F). Die gereinigten Vesikel wurden anschließend auf ein Agarosepad montiert (Abbildung 3A-C) und mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet (Abbildung 4A). Das Vorhandensein von Vesikelmembranen wurde mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 bestätigt (Abbildung 4B). Die E. coli-Zellen, die das innere Membranprotein CydB exprimieren, das mit mNeongreen (grün) und VNp6-mCherry2 (magenta)⁸ fusioniert ist, zeigen die Vesikelproduktion und die Cargo-Insertion in lebenden Bakterienzellen (Abbildung 4C). Die Abbildungen 4A und B wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, während die Abbildung 4C mit Hilfe der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden^{aufgenommen wurde 9,10}.

Abbildung 1: Zusammenfassung der VNp-Technologie von der Entwicklung einer Klonierungsstrategie bis zur Aufreinigung und Lagerung extrazellulärer Vesikel. (A) Schematische Darstellung eines typischen VNp-Fusionsproteins. VNp am NH2-Terminus, gefolgt von einem flexiblen Linker und einer geeigneten Kombination aus Affinitäts- und Fluoreszenz-Tags (Tag1, Tag 2, Protease-Spaltstelle [z.B. TEV]) und Protein von Interesse. (B) Schematische Darstellung des Protokolls für die Expression und Reinigung von rekombinanten, proteingefüllten Membranvesikeln aus E. coli. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Produktions- und Reinigungsstufen von VNp6-mNg-Vesikeln. Kulturen von E. coli-Zellen , die die VNp-mNeongreen-Expression enthalten, werden in blauem Licht entweder vor (A) oder nach (B) IPTG-induzierter Expression des Fusionsproteins konstruiert. Die Zellen von (B) wurden durch Zentrifugation entfernt, so dass VNp-mNeongreen-gefüllte Vesikel im Medium (C) verblieben. (D) Äquivalente Proben aus A, B und C wurden mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Die Vesikel wurden auf einen 0,1 μm Filter (E) isoliert und anschließend in ein geeignetes Volumen Puffer (F) abgewaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Verfahren zur Zellmontage für die Bildgebung von Vesikeln und die Vesikelproduktion. (A-C) Die Agarose-Pad-Methode und (D-F) die PEI-Methode zur Befestigung von E. coli-Zellen auf dem Deckglas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Mikroskopische Aufnahmen von VNp-rekombinanten Vesikel. Grüne (A) und rote (B) Emissionsbilder aus verschiedenen Feldern von FM4-64 markierten VNp6-mNeongrün-haltigen Vesikel, die auf einem Agarose-Pad montiert sind. (C) Die Bildgebung von E. coli-Zellen, die das innere Membranprotein CydB exprimieren, fusioniert mit mNeongreen (grün) und VNp6-mCherry2 (magenta), zeigt die Vesikelproduktion und die Cargo-Insertion in lebende Bakterienzellen. (A,B) wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop abgebildet, während (C) mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) aufgenommen wurde. Maßstabsbalken: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Die oben beschriebene aminoterminale Peptid-markierte Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine ist ein einfacher Prozess, der konstant große Mengen an Protein liefert, die effizient isoliert und/oder monatelang gelagert werden können.

Es ist wichtig, die wichtigsten Schritte im Protokoll hervorzuheben, die für eine optimale Nutzung dieses Systems erforderlich sind. Zuerst muss der VNp-Tag¹ am N-Terminus lokalisiert werden, gefolgt von dem interessierenden Protein und den entsprechenden Tags. Es ist auch wichtig, den Einsatz von Antibiotika zu vermeiden, die auf die Peptidoglykanschicht abzielen, wie z. B. Ampicillin.

In Bezug auf die Wachstumsbedingungen sind Rich Media (z. B. LB- oder TB-Medien) und ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis erforderlich, um die Vesikelproduktion zu maximieren. Die optimale Temperatur für die Produktion extrazellulärer Vesikel beträgt 37 °C, aber auch die Bedingungen, die typischerweise für die Expression des interessierenden Proteins erforderlich sind, müssen berücksichtigt werden. Für niedrigere Induktionstemperaturen muss VNp6 verwendet werden. Entscheidend ist, dass die Induktion des T7-Promotors mit nicht mehr als 20 μg/ml (84 μM) IPTG erreicht werden muss, sobald die Zellen einen OD₆₀₀ von 0,8-1,0 erreichen. Proteine, die mit dem System exprimiert werden, erreichen die maximale Vesikelproduktion entweder nach 4 Stunden oder nach Induktion über Nacht.

Trotz der Einfachheit dieses Protokolls muss es optimiert werden. Die Fusion von VNp-Varianten, die Expressionstemperaturen und die Induktionszeiten können je nach interessierendem Protein unterschiedlich sein. Darüber hinaus besteht die Notwendigkeit, die Reinigung und anschließende Konzentration der extrazellulären Vesikel aus den Medien zu optimieren. Das aktuelle Verfahren ist nicht skalierbar und kann zeitaufwändig sein. Dies sind die Grenzen dieser Methodik.

Die VNp-Technologie hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden². Es ermöglicht den vesikulären Export verschiedener Proteine, wobei die maximale Größe, die bisher erfolgreich exprimiert wurde, 175 kDa für Vesikel liegt, die intern bleiben, und 85 kDa für diejenigen, die exportiert werden. Darüber hinaus kann diese Technologie die Ausbeute an rekombinanten Proteinen mit einer Reihe von physikalischen Eigenschaften und Aktivitäten erheblich steigern. Exportierte Vesikel, die das interessierende Protein enthalten, können durch einfache Filtration aus dem vorgereinigten Medium isoliert und anschließend in sterilen Nährmedien oder Puffern bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.

Die Anwendungen für dieses System sind vielfältig und reichen von der Entdeckungswissenschaft über die angewandte Biotechnologie bis hin zur Medizin (z. B. durch die Herstellung funktioneller Therapeutika)³. Die einfache Herstellung, die Weiterverarbeitung und die hohe Ausbeute sind attraktive Eigenschaften in diesen Bereichen und insbesondere in der Industrie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ampicillin	Melford	69-52-3
Chloramphenicol	Acros Organics (Thermofisher Scientific)	56-75-7
E. coli BL21 (DE3)	Laborlager	N/A
E. coli DH10β	Labormaterial	N/A
Filter für Mikroskop	Chroma
FM4-64	Molekulare Sonden (Invitrogen)	T-3166	Gelöst in DMSO, Stammkonzentration 2 mM
ImageJ	Open Source		Heruntergeladen von: https://imagej.net/ij/index.html
Inverses Mikroskop	Olympus
Isopropyl β- D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG)	Melford	367-93-1
Kanamycinsulfat	Gibco (Thermofisher Scientific)	11815-024
LED-Lichtquelle für Micrscope	Cairn Research Ltd
Lysogeny Broth (LB) / LB Agar	Labormaterial	N/A	10 g/L Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Hefeextrakt (1,5 g/L Agar)
Metamorph Imaging Software	Molecular Devices
MF-Millipore Membranfilter (0,1 &Mikro; m, MCE)	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS Membranfilter (0,45 &μ; m, PES)	Merck	HPWP04700
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Labormaterial	N/A-Plasmide
, die die Expression von Protein von Interesse mit verschiedenen VNp-Aminoterminalfusionen ermöglichen	Addgene		https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB)	Labormaterial	N/A	12 g/L Trypton; 24 g/L Hefeextrakt; 4 ml/L 10% Glycerin; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4