Summary
Det mitokondriella nätverket är extremt komplext, vilket gör det mycket utmanande att analysera. Ett nytt MATLAB-verktyg analyserar levande konfokala avbildade mitokondrier i timelapse-bilder, men resulterar i en stor utdatavolym som kräver individuell manuell uppmärksamhet. För att lösa detta problem utvecklades en rutinoptimering som möjliggjorde snabb filanalys.
Abstract
Det komplexa mitokondriella nätverket gör det mycket utmanande att segmentera, följa och analysera levande celler. MATLAB-verktyg gör det möjligt att analysera mitokondrier i timelapse-filer, vilket avsevärt förenklar och påskyndar bildbehandlingsprocessen. Icke desto mindre producerar befintliga verktyg en stor utdatavolym, vilket kräver individuell manuell uppmärksamhet, och grundläggande experimentella inställningar har en utmatning av tusentals filer, som var och en kräver omfattande och tidskrävande hantering.
För att ta itu med dessa problem utvecklades en rutinmässig optimering, i både MATLAB-kod och live-script-formulär, vilket möjliggör snabb filanalys och avsevärt minskar dokumentläsning och databehandling. Med en hastighet på 100 filer/min möjliggör optimeringen en övergripande snabb analys. Optimeringen uppnår resultaten genom att beräkna medelvärdet av ramspecifika data för enskilda mitokondrier över tidsramar, analysera data på ett definierat sätt, i överensstämmelse med de som utdata från befintliga verktyg. Levande konfokalavbildning utfördes med hjälp av färgämnet tetrametylrhodaminmetylester, och den rutinmässiga optimeringen validerades genom att behandla neuronala celler med retinsyrareceptoragonister (RAR), vars effekter på neuronala mitokondrier är etablerade i litteraturen. Resultaten överensstämde med litteraturen och möjliggjorde ytterligare karakterisering av mitokondriellt nätverksbeteende som svar på isoformspecifik RAR-modulering.
Denna nya metodik möjliggjorde snabb och validerad karakterisering av mitokondrienätverk för hela nervceller, men den möjliggör också differentiering mellan axon- och cellkroppsmitokondrier, en viktig funktion att tillämpa inom neurovetenskapen. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på experiment med snabbverkande behandlingar, vilket möjliggör avbildning av samma celler före och efter behandlingar, vilket överskrider neurovetenskapen.
Introduction
Cellulära mitokondrier sitter i centrum för alla fysiologiska tillstånd, och en grundlig förståelse av deras homeostas (mitostas) och beteende är avgörande för att hjälpa till att identifiera farmakologisk behandling för ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer och Alzheimers sjukdom 1,2.
Mitokondrier spelar avgörande cellulära roller i energihomeostas, ATP-generering, kalciumbuffring och ROS-reglering, och mitostas är avgörande för att upprätthålla proteinhomeostas eftersom molekylära chaperoner är energiberoende3. Dessa kräver en konstant och dynamisk nätverksmodulering och anpassning för att effektivt möta cellulära behov, och mitokondrietransporten regleras av olika signalvägar; Tidigare forskning har beskrivit en sådan signalväg, retinsyrareceptorer (RAR)4,5. Retinsyra (RA) främjar axonal och neuritutväxt via RAR-aktivering. I primära kortikala neuroner hos möss uppmuntrar aktivering av RAR-β mitokondriell tillväxt, hastighet och rörlighet i neuriten6.
Med tanke på mitokondriernas nätverks anpassningsförmåga och dynamik är möjligheten att bedöma mitostas i "realtid" avgörande inte bara för att undersöka energihomeostas, utan också för proteostas, cellulär hälsa, proliferation eller signalering. En vanlig metod för att utvärdera mitostas bygger på konfokalmikroskopi efter att mitokondrier markerats med hjälp av ett fluorescerande färgämne eller markör, samt en specifik mikroskopiuppställning som tillåter temperatur och/eller CO2-reglering 7. Denna typ av experimentuppställning innebär att ett experimentellt replikat utförs åt gången. Förutom experimentell upprepning av olika behandlingar bör det beaktas att de flesta experiment bör ha sina tekniska replikat (där mer än en position avbildas per platta), med en serie fokalplan (z-stackar) registrerade i en serie tidpunkter. En experimentell design med tre repetitioner av en kontroll och två behandlingar, med fem avbildningspositioner per platta och 15 tidpunkter, resulterar i 225 stackar som ska bearbetas. Klassiskt analyserades videor av levande mitokondrier genom att plotta kymografer, som skulle analyseras individuellt8, i en tidskrävande process som krävde omfattande manuell inmatning, även när man förlitade sig på datorverktyg.
En algoritm beskrevs nyligen9 som möjliggör automatiserad segmentering och spårning av mitokondrier i levande celler 2-D och 3-D time-lapse-filer. Andra kvantifieringstekniker finns tillgängliga, och alla har sina begränsningar10. Mitometer, en automatiserad applikation med öppen källkod, är särskilt lämplig för analys av tidsfördröjning och mitokondriedynamik, vilket kräver låg användarinmatning. Denna applikation har en rad fördelar jämfört med andra befintliga MATLAB-baserade verktyg, nämligen att den tillåter automatisk bearbetning av enskilda TIF-stackar, med upp till 13 olika parametrar, särskilt intressant för neurovetenskap, eftersom den skiljer mellan peri- och telenukleära mitokondrier.
Men för ett experiment som det ovan beskrivna resulterar dessa 13 parametrar som tillämpas på 225 stackar i 2 925 enskilda utdatafiler. Dessa kräver fyra individuella datorinmatningar, vilket ger över 10 000 manuella inmatningar som krävs för att ladda ner alla utdatafiler. För stora experimentella designer resulterar detta i en onödigt extremt tidskrävande analys av varje fil och dataintegration. Här presenterar vi en rutinmässig optimering som möjliggör snabb filanalys, vilket kraftigt minskar dokumentläsning och databehandling, analyserar data på ett definierat sätt, i överensstämmelse med resultatet från befintliga verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll har två huvudsteg: ett vått labbsteg, som involverar cellodling och levande konfokalmikroskopi för att få bilder av levande mitokondrier (figur 1) och ett in silico-steg för att analysera erhållna bilder (figur 2). För automatiserad dataanalys av 3D-live-avbildade mitokondrier användes MATLAB-applikationen Mitometer som tillhandahålls av Lefebvre et al.9. Rutinoptimeringen är skriven i MATLAB. Programvaran, uppdaterade versioner och bearbetning av ImageJ-makron är fritt tillgängliga online via GitHub, på https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. Live-mikroskopi
Figur 1: Experimentellt protokoll. SH-SY5Y-celler differentierades och behandlades med retinoider. (A) TMRM användes för att avbilda friska mitokondrier i behandlade celler med hjälp av ett konfokalmikroskop och fånga en tidsförlopp z-stack med fem synfält. (B) Mitometerapplikationen MATLAB segmenterar och analyserar automatiskt mitokondriebilder. Förutom att analysera urskiljer denna programvara automatiskt mitokondrier beroende på nukleär närhet. Blå prickar är mitokondriella initialpositioner; Röda prickar är slutpositioner. Skalstapel = 30 μm. Förkortning: TMRM = tetrametylrhodamin, metylester. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Cellodling
- Inkubera SH-SY5Y-celler vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 %CO 2 och 95 % luft, odlade i lika delar MEM (Minimal Essential Medium) och F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS).
- Platta SH-SY5Y-celler i glasbottencellskålar med en densitet av 15 × 104 celler/ml.
- Differentiera celler med 5 dagars behandling med 10 μM all-trans-retinsyra i 1 % FBS-innehållande odlingsmedium, följt av 2 dagars behandling med 10 ƞg/ml hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF).
- Cellbehandling
- Tvätta cellerna med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och behandla i 72 timmar med 10-7 M RAR-isoformagonister, i lika delar MEM (Minimal Essential Medium) och F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, kompletterat med 1% FBS.
OBS: RARα-agonisten som användes var AM580; RARβ-agonist som användes var CD2314; Ch55 användes som agonist som RARα och β co-agonist; vidRA användes som en positiv kontroll; BMS493 användes som en RAR-pan-antagonist.
- Tvätta cellerna med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och behandla i 72 timmar med 10-7 M RAR-isoformagonister, i lika delar MEM (Minimal Essential Medium) och F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, kompletterat med 1% FBS.
- Konfokal avbildning i realtid
- Ersätt odlingsmediet med färskt 1 % FBS-innehållande odlingsmedium med 20 nM tetrametylrhodamin, metylester (TMRM) i 45 min.
OBS: TMRM är ett cellpermenat fluorescerande färgämne, bundet av aktiva mitokondrier, och denna inkubationsperiod gör att TMRM kan nå en jämvikt och tas upp av polariserade mitokondrier11. Avbildning bör påbörjas innan jämvikt etableras eftersom TMRM-signalens intensitet kan öka artificiellt under avbildning. - Placera cellerna i en inkubator som är fäst vid ett konfokalmikroskop med laserskanning vid 37 °C.
- Ta bilder med ett 63x apokromatobjektiv med oljenedsänkning, med en bildstorlek på 512 x 512 pixlar erhållna med en nålhålsbländare på 1 luftig enhet, fånga en tidsserie med 15 bilder från fem olika synfält i varje cellplatta och en z-stack med 8 lika stora z-plan. Den resulterande .lsm-filen är en tids-, positions- och z-stack.
OBS: Inställningar för förstärkning, kontrast och ljusstyrka måste initialt optimeras med den minsta lasereffekt som krävs för att använda detektorns hela dynamiska omfång och hållas konstant under hela studien, vilket säkerställer att all avbildning utförs under samma förhållanden. Upp till nio olika positioner kan registreras i denna kombination av hårdvara och programvara och mikroskopet växlar automatiskt mellan bildpositionerna.
- Ersätt odlingsmediet med färskt 1 % FBS-innehållande odlingsmedium med 20 nM tetrametylrhodamin, metylester (TMRM) i 45 min.
2. Bildanalys
Figur 2: Rutinoptimering. (A) Representativ kod för rutinoptimeringen. (b) Rutinmässig optimering Live-Script. (C) Arbetsflöde för rutinoptimering. (D) Validering av rutinoptimeringsresultat: representativ bild av mitokondrier i obehandlade celler (vänster panel), behandlad medRA (10-7 M, 72 timmar, mittpanel) och behandlad med RAR-antagonist BMS493 (10-7 M, 72 timmar, höger panel), avbildad efter inkubation med TMRM (20 nM, 45 min inkubation). Skalstapel = 30 μm. (E) TMRM Intensitet i cellkroppens mitokondrier. Signifikant minskning med behandling med all-trans-retinsyra (vidRA, 10-7 M, 72 timmar) jämfört med kontroll (p=0,0062), observerades inte vid behandling med RAR-antagonist (BMS493, 10-7 M, 72 timmar). Fem celler kvantifierades från var och en av tre repetitioner per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Bildbehandling
- Öppna filer i ImageJ 2.1.0 och separera positionsstaplar efter visuellt fält: Öppna ImageJ och klicka på Menyrad | Bild | Duplicera | Indatasegment/bildrutenummer | Okej.
OBS: För att minska repetitiva inmatningar till programvaran utvecklades ett ImageJ-makro för att underlätta duplicering och sparande av synfältsbilder.
- Öppna filer i ImageJ 2.1.0 och separera positionsstaplar efter visuellt fält: Öppna ImageJ och klicka på Menyrad | Bild | Duplicera | Indatasegment/bildrutenummer | Okej.
- Makro protokoll
- Rita ett intresseområde (ROI) runt cellen med det fria markeringsverktyget.
- Kör makrot genom att öppna ImageJ och navigera till menyraden | Plugins | Makron | Kör Rensa bakgrunden och spara bilder makro.
OBS: Bilder kan randomiseras i den här processen och lagra lösningsnyckeln enligt optimeringskraven. - Bestäm pixelstorlek och voxeldjup: Öppna ImageJ | bilden och navigera till menyraden | Bild | Egenskaper.
- Alternativt direktprotokoll
OBS: Detta alternativ använder inte makro för att bearbeta bilder- Hitta pixelstorlek och voxeldjup: Öppna ImageJ | Öppna Bild och navigera till Menyrad | Bild | Egenskaper.
- Rita en ROI runt cellen med det fria markeringsverktyget och se till att det omfattar hela cellen i de 15 bildrutorna.
- Navigera till menyraden | Redigera | Rensa utvändigt.
- Navigera till menyraden | Arkiv | Spara som | Välj Tiff.
- Välj Spara mapp och klicka på Spara.
OBS: Bilder kan bländas/randomiseras manuellt vid denna tidpunkt innan du fortsätter till analys.
- Automatiserad bildanalys
- Förbered mapparna för analysfiler.
- Skapa tre huvudmappar med namnen "Alla spår", "Perinukleära spår" och "Telenukleära spår".
OBS: Dessa matchar de viktigaste automatiska spåralternativen. - I varje huvudmapp skapar du en undermapp för varje bild som ska bearbetas, identifierad numeriskt från 1 och uppåt.
- Lägg till en kopia av de två tilläggsfilerna för rutinoptimering (mitometer2table.m och getTXTfiles.m) i varje bildmapp.
OBS: Dessa filer hjälper till med dataanalys och slutligt formatarrangemang. Antalet mappar måste matcha antalet element i det slumpmässiga kalkylarket (.xlsx). När du har skapat alla numrerade undermappar med tilläggsfiler för en datauppsättning kan de kopieras och klistras in i de återstående datauppsättningarna.
- Skapa tre huvudmappar med namnen "Alla spår", "Perinukleära spår" och "Telenukleära spår".
- Förbered mapparna för analysfiler.
- Använd MATLAB-applikationen Mitometer för att analysera bilder.
OBS: Detta protokoll kördes på en mitometer, installerad på MATLAB R2022a. Läs in bilder i batchar om 30 för optimal tidskörning och utdatabalans. Maximal MAT-filstorlek införs av det ursprungliga filsystemet: som standard kan "spara"-åtgärder skapa en fil < 231 byte (~2 GB); spara format MAT-filer Version 7.3 kan användas istället, eftersom den tillåter maximala variabla storlekar som är större än 2 GB.- Identifiera/ändra standardversionen av MAT-filen: På fliken Start i avsnittet Miljö klickar du på Inställningar och väljer MATLAB | Allmänt | MAT-filer.
- Använd MATLAB-verktyget Mitometer för att analysera: Öppna MATLAB och navigera till menyraden | APPAR | Öppna Mitometer | Välj Starta 3D | Indata (pixelstorlek (μm): 0,1395089/Tid mellan bildrutor (s): 2/Antal z-plan: 8/Axiellt avstånd mellan z-plan (μm): 0,418809 | Välj bilder att mata in.
- Gå till Mitometer Side Menu, välj Bild, klicka på Välj markerad, navigera till mitometerns menyrad | Välj spår | Spåra vyer | välj Alla spår, telenukleär eller perinukleär | mitometer Menyrad | Välj Analys | Välj ett element (t.ex. längd) | välj Spara i ".txt".
OBS: Mer än en parameter kan laddas ner samtidigt, om den väljs samtidigt. - Extrahera resultatfiler till de skapade mapparna (2.2.1).
- Rutinoptimering och dataanalys
- Förbered/anpassa "Randomization.xlsx"-filen som innehåller nyckeln för bildkodning.
- Infoga en lista med på varandra följande heltal, från 1 och uppåt, i kolumn A.
OBS: Det är tillrådligt att ha en duplicerad mapp med ursprungligen namngivna bilder. - Placera analysvariablerna i kolumn B, som består av alfanumeriska tecken.
Antalet rader i dokumentet måste överensstämma med antalet mappar som finns i huvuddatauppsättningen. Kopiera och klistra in den här "Randomization.xlsx"-filen i de andra två huvuddatauppsättningarna.
- Infoga en lista med på varandra följande heltal, från 1 och uppåt, i kolumn A.
- Optimerad dataanalys
- Dubbelklicka på "executable.mlx", ange antalet mappar, ange mappkatalogen (kopiera katalogen från toppen av mappen) | spara katalogen (kopiera katalogen från toppen av mappen) | kalkylbladsnamnet i utdatafilen och klicka på Kör.
- Utför statistisk analys vid behov.
OBS: Valfritt skapande av en .xlsx file i varje mapp med .txt data och ljudvarning till slutet av analysen kan väljas. Live Script matar ut en enda kalkylbladsfil i tabellformat. I dessa utdata representerar kolumnerna analyserade parametrar (t.ex. "Längd på huvudaxeln"; "Intensitet") och linjer representerar visuella fält för analytiska variabler (t.ex. "Kontroll").
- Förbered/anpassa "Randomization.xlsx"-filen som innehåller nyckeln för bildkodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att förbättra och påskynda analysen av utdatafiler i .txt format kodades en rutinoptimering som läser data som överensstämmer med Mitometer .txt utdatafiler, med kolumner som representerar en ram och linjer som representerar identifierade mitokondrier. Den rutinmässiga optimeringen producerar data i ett enda värde per parameter genom att beräkna medelvärdet av ramarna för varje identifierad mitokondri och sedan beräkna medelvärdet av resultaten för alla mitokondrier per synfält. Den utvecklade rutinen läser filer från mappar numrerade från 1 och uppåt. Optimering av rutin för live-skript matar ut en enda kalkylbladsfil i tabellformat. I dessa utdata representerar kolumnerna analyserade parametrar (t.ex. "Längd på huvudaxeln"; "Intensitet") och linjer representerar visuella fält för analytiska variabler (t.ex. "Kontroll").
Tidigare publicerade resultat beskriver mitokondriell membranpotential i cellkroppen hos primära neuronala kulturer för att minska och axonala mitokondriers rörelse för att öka efter RARβ aktivering6.
Liknande behandlingar utfördes på differentierade SH-SY5Y-celler i neuroblastom, behandlade med retinsyrareceptoragonister och -antagonister i 72 timmar (Figur 3). Insamlade data plottades och analyserades med hjälp av icke-riktade, 2-sidiga, 2-samplade, lika varians Studentens t-test. Jämförelser gjordes, i utdatakalkylbladsfilen, mellan lämpliga grupper, med α = 0,05.
Figur 3: Reglering av mitokondriell homeostas genom isoformspecifik retinoidsignalering. (A) Representativ bild av mitokondrier efter behandling (överst), respektive ytdiagram (mitten) och automatiserad segmentering (nederst). Blå prickar är mitokondriella initialpositioner; Röda prickar är slutpositioner. Skalstaplar = 30 μm. (B) Värmekarta som sammanfattar alla variationer som finns i mitokondrieparametrar; Signifikant varians hittades mellan cellkroppen och neurit (tvåvägs ANOVA, p=0,0158), med signifikant påverkan av RAR-isoformspecifik modulering i alla mitokondrier (tvåvägs ANOVA, p=0,0082). (C) Mitokondriell längd - en signifikant minskning observerades i celler som behandlades med AM580 (p=0,0179). (D) Mitokondriell yta - signifikanta minskningar observerades i celler som behandlades med AM580 (p=0,000406) och med BMS493 (p=3,01 × 10-8). (E) TMRM-intensitet, normaliserad för mitokondriell volym - signifikanta minskningar sågs i celler som behandlades med RA (p=0,00621) och Ch55 (p=0,000542). * p < 0,05. ** p < 0,01; # p < 0,0001. Fem celler kvantifierades från var och en av tre repetitioner per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Analys visar att behandling av differentierade SH-SY5Y-celler med RAR α-agonisten AM580 resulterar i en minskning av mitokondriernas genomsnittliga längd och yta; Denna effekt sågs inte vid behandling med agonister för andra isoformer än uteslutandeRAR-α, men det fanns en intressant minskning på 35,42 ± 0,5 % i mitokondrieytan efter behandling med RAR-panantagonisten BMS493 (p = 3,01 x 10-8). Däremot verkar retinoider ha en motsatt effekt när det gäller TMRM-intensitet, vilket relaterar till mitokondriemembranpolarisering11: medan behandling med RAR α-agonist inte verkar ha någon signifikant effekt på TMRM-intensitet, resulterar behandling med RAR-pan-agonist vidRA i en dramatisk minskning med 54,82 ± 18,01 % (p=0,00621). Denna minskning ses också efter behandling med RARα/β-agonist CH55 (28,99 ± 4,97 % minskning, p=0,000542), och möjligen även efter behandling med RARβ specifik agonist CD2314 (37,01 ± 28,96 % minskning, p=0,09134). Viktigt är att denna metod skilde mellan axonala mitokondrier och de i cellkroppen, vilket möjliggjorde studier av isoformspecifik RAR-stimulus och mitokondriell modulering.
Figur 4: Minimal fotoblekning under hela avbildningsprotokollet. (A) Z-stack-timelapses bearbetades i FIJI, och z-projektioner med genomsnittlig intensitet exporterades för alla tidpunkter. (B) En z-axelprofil med samma bearbetning ritades upp enligt tiden. (C) Kvantifiering av fotoblekning för experimentell uppställning. Inga signifikanta förändringar observerades (p = 0,7607; parat t-test för första och sista bildrutans medelsignalintensitet). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avbildning av levande celler producerar stora filer som kräver seriös databehandling, men även de senaste verktygen kräver omfattande manuell inmatning för att bearbetas. Denna rutinoptimering är inriktad på att förenkla processen för mitokondrieanalys på Mitometern eftersom detta verktyg presenterar en mycket bra balans mellan användarinmatning och datautmatning. En omfattande jämförelse mellan olika verktyg för mitokondriebildanalys har tidigare granskats10. Medan andra pipelines är mer fokuserade på att analysera mitokondrienätverk och klustermassa eller analysera membranpotentialvariation, möjliggör denna nya metodik som presenteras här snabb och validerad karakterisering av helcellsmitokondrienätverk, vilket också möjliggör differentiering mellan axon- och cellkroppsmitokondrier, en viktig funktion att tillämpa inom neurovetenskapen.
MATLAB-applikationen Mitometer9 analyserar mitokondrier i bildserier: diffus bakgrund subtraheras från varje tidsram och z-plan i serien, som sedan konvolveras med en gaussisk kärna för att eliminera högfrekvent brus, följt av en intensitetströskel som resulterar i en mask av de segmenterade mitokondrierna. De ideala inställningarna maximerar medianantalet identifierade mitokondrier samtidigt som fluktuationerna i mitokondriernas antal och area över bildens intilliggande temporala ramar minimeras, med en mitokondrie som allokeras till sitt spår från föregående bildruta för translationell rörelse.
Differentierade SH-SY5Y-celler användes som en neuronal modell för experimentell validering av rutinoptimeringen. Denna humana cellinje är en homogen neuroblastliknande cellinje som uttrycker flera neuronalliknande egenskaper, såsom enzymaktivitet, receptorer eller neurofilament, som lätt förökar sig i odling. Denna modell gör det möjligt att experimentera med celler som härrör från människor utan de etiska problem som är förknippade med detta och till mycket lägre kostnader än att använda primära kulturer12. Odifferentierad SH-SY5Y är proliferativa, med korta processer; differentiering av dessa celler med sekventiell retinsyra- och BDNF-behandling stoppar proliferation och främjar neuritelongation, vilket ger en användbar in vitro neuronal modell13.
All-trans-retinsyra (10-7 M) användes som pan-RAR-agonist; AM580 (10-7 M) är en RARα-agonist; CD2314 (10-7 M) är en RARβ agonist; Ch55 (10-7 M) är en RAR-α och RARβ agonist; BMS493 (10-7 M) är en RAR-panantagonist och användes som farmakologisk kontroll. Denna metodik validerades med hjälp av en liknande modell som nyligen har beskrivits: aktiveringen av RAR i neuronala celler reglerar mitokondriernas homeostas i neuron6. På samma sätt överensstämmer resultaten som erhållits med denna optimerade rutin med litteraturen, som visar signifikanta förändringar i flera mitokondriella parametrar (mitokondriernas längd, yta och mitokondriernas membranpotential), vilket skiljer mitokondrier i neuriten från de i cellkroppen (figur 3). Mitometer kan automatiskt identifiera och separera mitokondrier beroende på avståndet från kärnan (figur 1). Detta är en funktion från det ursprungliga programmet9 och användes som den är.
Denna optimering möjliggjorde snabb bearbetning av bildfiler, vilket avsevärt minskade operatörens inmatning, dokumentläsning, databehandling (till en hastighet på 100 filer per minut), minskade bias och ökade experimentell blindning. Med denna experimentella uppställning tar var och en av ramarna cirka 1 minut att slutföra en cykel; Kortare intervall kan erhållas genom att minska antalet fångade Z-plan (eventuellt åtföljt av ökande nålhålsbländare) eller antalet synfält; Längre intervall kan åstadkommas genom att välja en fördröjningsperiod innan den fångas.
En experimentell uppställning av fem positioner med 8 z-plan och 15 ramar tar cirka 19 minuter per cellodlingsskål, vilket resulterar i minimal fotoblekning (figur 4). Den huvudsakliga experimentella begränsningen med mitokondrier live imaging är att hitta balansen mellan tillräckligt med sammanflöde för att celler ska vara friska och gleshet för att tillåta diskriminering mellan celler, och i synnerhet neuriter. Om celler pläteras för flytande i glasbottenskålarna, resulterar deras proliferation under differentieringsprocessen i överlappande celler och bildandet av neuritnätverk, svårigheter att avbilda enskilda celler och neuriter och identifiera transportriktning, vilket stör kartläggningen av mitokondrienätverk. När det gäller bearbetning har MATLAB inte samma beräkningskraft som andra språk, till exempel Python, men MATLAB är särskilt bra på signalbehandling, vilket gör det idealiskt för mitokondrieavbildningsexperiment.
Detta protokoll tillåter också avbildning före och efter akut behandling med en flytande lösning. För att göra detta måste mikroskopets inkubationskammare öppnas försiktigt för att ge tillgång till glasbottenskålen för applicering av behandling. Detta fungerar bäst med större volymer (>100 μL), eftersom turbulensbehandlingsapplikationen kan fördela den genom hela preparationen, medan mindre volymer skulle kräva omrörning av preparationen, vilket eventuellt ändrar dess orientering i förhållande till objektivet/platthållaren. Om ingen sådan avvikelse skulle inträffa skulle de positioner som registrerats i programvaran relatera till samma celler som avbildats före behandlingen, och en ny avbildningsslinga kan initieras. Man bör dock ta hänsyn till att denna variation skulle öka fotoblekningen, och kompromisser måste göras i den initiala laserintensiteten. Dessutom kan samma protokoll tillämpas på andra cellulära modeller, såsom neuronala primära kulturer6 eller till och med andra typer av celler14, men det skulle kräva optimering av mikroskopisektionen om avbildning av fler mobila celler eller för längre avbildningsperioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Bildinsamlingen utfördes i LiM-anläggningen hos iBiMED, en nod inom PPBI (Portuguese Platform of BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Detta arbete stöddes av FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), ett bidrag till DT från Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), ett bidrag från ATG-The Gabba Alumni Association till VP, och Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
