Summary
Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.
Abstract
Karmaşık mitokondriyal ağ, canlı hücreleri segmentlere ayırmayı, takip etmeyi ve analiz etmeyi çok zorlaştırır. MATLAB araçları, timelapse dosyalarında mitokondrinin analizine izin vererek görüntü işleme sürecini önemli ölçüde basitleştirir ve hızlandırır. Bununla birlikte, mevcut araçlar, bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmi üretir ve temel deney kurulumları, her biri kapsamlı ve zaman alıcı işlem gerektiren binlerce dosyadan oluşan bir çıktıya sahiptir.
Bu sorunları ele almak için, hem MATLAB kodunda hem de canlı komut dosyası formlarında, hızlı dosya analizine olanak tanıyan ve belge okuma ve veri işlemeyi önemli ölçüde azaltan rutin bir optimizasyon geliştirildi. 100 dosya/dk hızıyla optimizasyon, genel olarak hızlı bir analize izin verir. Optimizasyon, zaman dilimleri boyunca bireysel mitokondri için çerçeveye özgü verilerin ortalamasını alarak, verileri mevcut araçlardan elde edilen çıktılarla tutarlı olarak tanımlanmış bir şekilde analiz ederek sonuç çıktısını elde eder. Tetrametilrodamin metil ester boyası kullanılarak canlı konfokal görüntüleme yapıldı ve nöronal mitokondri üzerindeki etkileri literatürde ortaya konan retinoik asit reseptörü (RAR) agonistleri ile nöronal hücrelerin tedavi edilmesiyle rutin optimizasyon doğrulandı. Sonuçlar literatürle tutarlıydı ve izoforma özgü RAR modülasyonuna yanıt olarak mitokondriyal ağ davranışının daha fazla karakterizasyonuna izin verdi.
Bu yeni metodoloji, tüm nöron mitokondri ağının hızlı ve doğrulanmış karakterizasyonuna izin verdi, ancak aynı zamanda sinirbilim alanında uygulanacak önemli bir özellik olan akson ve hücre gövdesi mitokondrileri arasında farklılaşmaya da izin veriyor. Ayrıca, bu protokol, hızlı etkili tedaviler kullanan deneylere uygulanabilir ve tedavilerden önce ve sonra aynı hücrelerin görüntülenmesine izin vererek, sinirbilim alanını aşar.
Introduction
Hücresel mitokondri, tüm fizyolojik durumların merkezinde yer alır ve kanser ve Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklar için farmakolojik tedavinin belirlenmesine yardımcı olmak için homeostazlarının (mitostaz) ve davranışlarının tam olarak anlaşılması çok önemlidir 1,2.
Mitokondri, enerji homeostazı, ATP üretimi, kalsiyum tamponlama ve ROS regülasyonunda çok önemli hücresel roller oynar ve moleküler şaperonlar enerjiye bağımlı olduğundan protein homeostazını korumak için mitostaz gereklidir3. Bunlar, hücresel ihtiyaçları verimli bir şekilde karşılamak için sabit ve dinamik bir ağ modülasyonu ve adaptasyonu gerektirir ve mitokondri taşınması farklı sinyal yolları tarafından düzenlenir; önceki çalışma, retinoik asit reseptörlerinin (RAR'lar) böyle bir yolunu tanımlamıştır4,5. Retinoik asit (RA), RAR aktivasyonu yoluyla aksonal ve nörit büyümesini teşvik eder. Fare primer kortikal nöronlarında, RAR-β'in aktivasyonu, nöritte mitokondriyal büyümeyi, hızı ve hareketliliği teşvik eder6.
Mitokondriyal ağ uyarlanabilirliği ve dinamikleri göz önüne alındığında, mitosazın "gerçek zamanlı" olarak değerlendirilmesi olasılığı sadece enerji homeostazını araştırmak için değil, aynı zamanda proteostaz, hücresel sağlık, proliferasyon veya sinyalizasyon için de gereklidir. Mitostazın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bir floresan boya veya işaretleyici kullanarak mitokondriyi vurguladıktan sonra konfokal mikroskopiye ve ayrıca sıcaklık ve/veya CO2 regülasyonuna izin veren özel bir mikroskopi kurulumunadayanır 7. Bu tür bir deney düzeneği, bir seferde bir deneysel kopyanın gerçekleştirilmesini gerektirir. Farklı tedavilerin deneysel tekrarına ek olarak, çoğu deneyin teknik kopyalarına (plaka başına birden fazla konumun görüntülendiği) sahip olması gerektiği ve bir dizi odak düzleminin (z-yığınları) bir dizi zaman noktasında kaydedilmesi gerektiği düşünülmelidir. Böylece, bir kontrol ve iki tedavinin üç tekrarı, plaka başına beş görüntüleme pozisyonu ve 15 zaman noktası ile deneysel bir tasarım, işlenecek 225 yığınla sonuçlanır. Klasik olarak, canlı mitokondri videoları, bilgisayar araçlarına güvenirken bile, kapsamlı manuel girdi gerektiren zaman alıcı bir süreçte, ayrı ayrı analiz edilecek olan kimograflarçizilerek analiz edildi 8.
Canlı hücreli 2 boyutlu ve 3 boyutlu hızlandırılmış dosyalarda mitokondrinin otomatik segmentasyonuna ve izlenmesine izin veren bir algoritmayakın zamanda 9 tanımlandı. Diğer niceleme teknikleri mevcuttur ve hepsinin sınırlamalarıvardır 10. Otomatik açık kaynaklı bir uygulama olan Mitometer, özellikle düşük kullanıcı girdisi gerektiren hızlandırılmış ve mitokondri dinamiği analizi için yeterlidir. Bu uygulamanın, diğer mevcut MATLAB tabanlı araçlara göre bir dizi avantajı vardır, yani, peri- ve tele-nükleer mitokondri arasında ayrım yaptığı için özellikle sinirbilimleri için ilginç olan 13 farklı parametreye kadar bireysel TIF yığınlarının otomatik olarak işlenmesine izin verir.
Ancak, yukarıda açıklanan gibi bir deney için, 225 yığına uygulanan bu 13 parametre, 2.925 ayrı çıktı dosyasıyla sonuçlanır. Bunlar, tüm çıktı dosyalarını indirmek için gereken 10.000'den fazla manuel girişe kadar toplam dört ayrı bilgisayar girişi gerektirir. Büyük deneysel tasarımlar için bu, her dosyanın gereksiz yere son derece zaman alıcı bir analizine ve veri entegrasyonuna neden olur. Burada, hızlı dosya analizine izin veren, belge okumayı ve veri işlemeyi büyük ölçüde azaltan, verileri mevcut araçlardan elde edilen çıktılarla tutarlı olarak tanımlanmış bir şekilde analiz eden rutin bir optimizasyon sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolün iki ana adımı vardır: canlı mitokondri görüntülerini elde etmek için hücre kültürü ve canlı konfokal mikroskopi içeren ıslak bir laboratuvar adımı (Şekil 1) ve elde edilen görüntüleri analiz etmek için in silico bir adım (Şekil 2). 3D canlı görüntülenen mitokondrinin otomatik veri analizi için, Lefebvre ve ark.9 tarafından sağlanan MATLAB uygulaması Mitometre kullanıldı. Rutin optimizasyon MATLAB'da yazılmıştır. Yazılım, güncellenmiş sürümler ve ImageJ Makrolarının işlenmesi, GitHub aracılığıyla çevrimiçi olarak ücretsiz olarak https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. Canlı mikroskopi
Şekil 1: Deneysel protokol. SH-SY5Y hücreleri farklılaştırıldı ve retinoidlerle tedavi edildi. (A) TMRM, konfokal bir mikroskop kullanılarak tedavi edilen hücrelerde sağlıklı mitokondriyi canlı olarak görüntülemek için kullanıldı ve beş görsel alandan oluşan hızlandırılmış bir z-yığını yakaladı. (B) Mitometre uygulaması MATLAB, mitokondri görüntülerini otomatik olarak bölümlere ayırır ve analiz eder. Analize ek olarak, bu yazılım mitokondriyi nükleer yakınlığa göre otomatik olarak ayırt eder. Mavi noktalar mitokondriyal başlangıç konumlarıdır; Kırmızı noktalar son konumlardır. Ölçek çubuğu = 30 μm. Kısaltma: TMRM = tetrametilrodamin, metil ester. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Hücre kültürü
- SH-SY5Y hücrelerini 37 °C'de %5CO2 ve %95 havadan oluşan nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin, MEM (Minimal Esansiyel Ortam) ve F12 (Ham's F12 Besin Karışımı) Ortamının eşit kısımlarında kültürlenmiş, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir.
- SH-SY5Y hücrelerini 15 × 104 hücre/mL yoğunlukta cam tabanlı hücre kaplarında plakalayın.
- % 1 FBS içeren kültür ortamında 10 μM all-trans retinoik asit ile 5 günlük tedavi ile hücreleri ayırt edin, ardından 10 ƞg / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile 2 günlük tedavi uygulayın.
- Hücre tedavisi
- Hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 72 saat boyunca 10-7 M RAR-izoform agonistleri ile, MEM (Minimal Esansiyel Ortam) ve F12 (Ham'ın F12 Besin Karışımı) Ortamının eşit kısımlarında,% 1 FBS ile desteklenmiştir.
NOT: Kullanılan RARα agonisti AM580 idi; Kullanılan RARβ agonisti CD2314 idi; Ch55, RARα ve β ko-agonisti olarak agonist olarak kullanıldı; daRA pozitif kontrol olarak kullanıldı; BMS493, bir RAR pan-antagonisti olarak kullanıldı.
- Hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 72 saat boyunca 10-7 M RAR-izoform agonistleri ile, MEM (Minimal Esansiyel Ortam) ve F12 (Ham'ın F12 Besin Karışımı) Ortamının eşit kısımlarında,% 1 FBS ile desteklenmiştir.
- Canlı konfokal görüntüleme
- Kültür ortamını taze% 1 FBS içeren kültür ortamı ile 20 nM tetrametilrodamin, metil ester (TMRM) ile 45 dakika değiştirin.
NOT: TMRM, aktif mitokondri tarafından tutulan, hücre kaynaklı bir floresan boyadır ve bu inkübasyon süresi, TMRM'nin bir dengeye ulaşmasını ve polarize mitokondri11 tarafından alınmasını sağlar. Görüntüleme sırasında TMRM sinyal yoğunluğu yapay olarak artabileceğinden, denge kurulmadan önce görüntülemeye başlanmalıdır. - Hücreleri, 37 ° C'de lazer taramalı konfokal mikroskoba bağlı bir inkübatöre yerleştirin.
- 1 havadar birimlik bir iğne deliği açıklığı ile elde edilen 512 x 512 piksel görüntü boyutunda, her hücre plakasındaki beş farklı görsel alandan 15 karelik bir zaman serisi yakalayan 63x yağa daldırma apokromat objektif kullanarak görüntüler yakalayın ve 8 eşit uzaklıkta z düzleminden oluşan bir z yığını. Sonuçta elde edilen .lsm dosyası bir zaman, konum ve z yığınıdır.
NOT: Kazanç, kontrast ve parlaklık ayarları, başlangıçta dedektörün tüm dinamik aralığını kullanmak için gereken minimum lazer gücü kullanılarak optimize edilmeli ve tüm görüntülemenin aynı koşullar altında gerçekleştirilmesini sağlamak için çalışma boyunca sabit tutulmalıdır. Bu donanım-yazılım kombinasyonunda dokuz adede kadar farklı konum kaydedilebilir ve mikroskop görüntüleme konumları arasında otomatik olarak geçiş yapar.
- Kültür ortamını taze% 1 FBS içeren kültür ortamı ile 20 nM tetrametilrodamin, metil ester (TMRM) ile 45 dakika değiştirin.
2. Görüntü analizi
Şekil 2: Rutin optimizasyon. (A) Rutin optimizasyonun temsili kodu. (B) Rutin optimizasyon Live-Script. (C) Rutin optimizasyon iş akışı. (D) Rutin optimizasyon sonucu doğrulaması: tedavi edilmemiş hücrelerde mitokondrinin temsili görüntüsü (sol panel), RA'da(10-7 M, 72 saat, orta panel) ve RAR antagonisti BMS493 (10-7 M, 72 saat, sağ panel) ile muamele edildi, TMRM ile inkübasyondan sonra görüntülendi (20 nM, 45 dakika inkübasyon). Ölçek çubuğu = 30 μm. (E) TMRM Hücre gövdesi mitokondrisindeki yoğunluk. All-trans retinoik asit tedavisi ile (RA'da, 10-7 M, 72 saat), kontrole kıyasla (p = 0,0062), RAR antagonisti ile tedavi edildiğinde gözlenmeyen önemli azalma (BMS493, 10-7 M, 72 saat). Koşul başına üç tekrarın her birinden beş hücre ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Görüntü işleme
- Dosyaları ImageJ 2.1.0'da açın ve yığınları görsel alana göre ayırın: ImageJ'yi açın ve Menü Çubuğu | Görüntü | Mükerrer | Giriş dilimleri/çerçeve numarası | TAMAM.
NOT: Yazılıma tekrarlanan girdileri azaltmak için, görsel alan görüntülerinin çoğaltılmasını ve kaydedilmesini kolaylaştırmak için bir ImageJ Makro geliştirilmiştir.
- Dosyaları ImageJ 2.1.0'da açın ve yığınları görsel alana göre ayırın: ImageJ'yi açın ve Menü Çubuğu | Görüntü | Mükerrer | Giriş dilimleri/çerçeve numarası | TAMAM.
- Makro protokolü
- Serbest seçim aracıyla hücrenin etrafına bir ilgi bölgesi (ROI) çizin.
- ImageJ'yi açıp Menü Çubuğu | Eklentiler | Makrolar | Arka planı temizle ve görüntüleri kaydet makrosunu çalıştırın.
NOT: Bu işlemde görüntüler rastgele hale getirilebilir ve çözüm anahtarı optimizasyon gereksinimlerine göre saklanabilir. - Piksel boyutunu ve voksel derinliğini belirleyin: ImageJ | Görüntü'yü açın ve Menü Çubuğu | Görüntü | Özellikleri.
- Alternatif doğrudan protokol
NOT: Bu alternatif, görüntüleri işlemek için Makro kullanmaz- Piksel boyutunu ve voksel derinliğini bulun: ImageJ'yi Aç | Görüntüyü açın ve Menü Çubuğu | Görüntü | Özellikleri.
- Serbest seçim aracıyla hücrenin etrafına bir ROI çizin ve 15 kare boyunca tüm hücreyi kapsadığından emin olun.
- Menü Çubuğuna Git | Düzenle | Dışarısı temiz.
- Menü Çubuğuna Git | Dosya | Farklı kaydet | Tiff'i seçin.
- Klasörü Kaydetme'yi seçin ve Kaydet'e tıklayın.
NOT: Analize devam etmeden önce bu noktada görüntüler manuel olarak körleştirilebilir/rastgele hale getirilebilir.
- Otomatik görüntü analizi
- Analiz dosyaları için klasörleri hazırlayın.
- "Tüm parçalar", "Perinükleer izler" ve "Telenükleer izler" başlıklı üç ana klasör oluşturun.
NOT: Bunlar, ana otomatik parça seçenekleriyle eşleşir. - Her ana klasörde, işlenecek her görüntü için 1'den itibaren sayısal olarak tanımlanan bir alt klasör oluşturun.
- Her görüntü klasörüne iki rutin optimizasyon ek dosyasının (mitometer2table.m ve getTXTfiles.m) bir kopyasını ekleyin.
NOT: Bu dosyalar, veri analizine ve son biçim düzenlemesine yardımcı olur. Klasör sayısı, rastgele elektronik tablodaki (.xlsx) öğelerin sayısıyla eşleşmelidir. Bir veri kümesi için ek dosyalar içeren tüm numaralandırılmış alt klasörler oluşturulduktan sonra, bunlar toplu olarak kopyalanabilir ve kalan veri kümelerine yapıştırılabilir.
- "Tüm parçalar", "Perinükleer izler" ve "Telenükleer izler" başlıklı üç ana klasör oluşturun.
- Analiz dosyaları için klasörleri hazırlayın.
- Görüntüleri analiz etmek için MATLAB uygulaması Mitometre'yi kullanın.
NOT: Bu protokol, MATLAB R2022a'ya yüklenen bir mitometre üzerinde çalıştırılmıştır. Optimum zaman çalışması ve çıktı dengesi için görüntüleri 30'lu gruplar halinde yükleyin. Maksimum MAT dosya boyutu yerel dosya sistemi tarafından uygulanır: varsayılan olarak, "kaydetme" işlemleri 231 bayt (~ 2 GB) < bir dosya oluşturabilir; kaydetme biçimi MAT-Files Sürüm 7.3, 2 GB'den büyük maksimum değişken boyutlarına izin verdiği için bunun yerine kullanılabilir.- Varsayılan MAT dosyası sürümünü tanımlayın/değiştirin: Ortam bölümündeki Giriş sekmesinde, Tercihler'e tıklayın ve MATLAB | Genel | MAT Dosyaları.
- Analiz etmek için MATLAB aracı Mitometre'yi kullanın: MATLAB'ı açın ve Menü Çubuğu | UYGULAMALAR | Açık Mitometre | 3D'yi Başlat'ı seçin | Giriş verileri (Piksel Boyutu (μm): 0.1395089 / Çerçeveler arasındaki süre (ler): 2 / Sayı z-düzlemleri: 8 / Z-düzlemleri arasındaki eksenel mesafe (μm): 0.418809 | Girilecek görüntüleri seçin.
- Mitometre Yan Menüsüne gidin, Görüntü'yü seçin, Vurgulanmış Seç'e tıklayın, mitometre Menü Çubuğuna gidin | Parçaları Seç | Parça görünümleri | All-Tracks, Telenuclear veya Perinükleer'i seçin | mitometre Menü Çubuğu | Analiz Seç | Bir öğe seçin (ör. Uzunluk) | ".txt"ye kaydet'i seçin.
NOT: Aynı anda seçilirse, birden fazla parametre aynı anda indirilebilir. - Sonuç dosyalarını oluşturulan klasörlere ayıklayın (2.2.1).
- Rutin optimizasyon ve veri analizi
- Görüntü kodlama anahtarını içeren "Randomization.xlsx" dosyasını hazırlayın/uyarlayın.
- A sütununa 1'den başlayarak ardışık tamsayıların listesini ekleyin.
NOT: Orijinal olarak adlandırılmış görüntülerle çoğaltılmış bir klasör tutmanız önerilir. - Analitik değişkenleri alfasayısal karakterlerden oluşan B sütununa yerleştirin.
NOT: Belgedeki satır sayısı, ana veri kümesinde bulunan klasör sayısıyla tutarlı olmalıdır. Bu "Randomization.xlsx" dosyasını kopyalayıp diğer iki ana veri kümesine yapıştırın.
- A sütununa 1'den başlayarak ardışık tamsayıların listesini ekleyin.
- Optimize edilmiş veri analizi
- "executable.mlx" dosyasına çift tıklayın, klasör sayısını girin, klasörler dizinini belirtin (klasörün üst kısmından dizini kopyalayın) | kaydetme dizini (dizini klasörün üstünden kopyalayın) | çıktı dosyasındaki elektronik tablo adını girin ve Çalıştır'ı tıklayın.
- Gerektiğinde istatistiksel analiz yapın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, her klasörde .txt verileri ve analizin sonuna kadar sesli uyarı içeren bir .xlsx dosyası oluşturulması seçilebilir. Live Script, tablo biçiminde tek bir elektronik tablo dosyası çıkarır. Bu çıktıda, sütunlar analiz edilen parametreleri temsil eder (örneğin, "Ana Eksen Uzunluğu"; "Yoğunluk") ve çizgiler analitik değişkenlerin görsel alanlarını temsil eder (örneğin, "Kontrol").
- Görüntü kodlama anahtarını içeren "Randomization.xlsx" dosyasını hazırlayın/uyarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çıktı dosyalarının .txt formatta analizini geliştirmek ve hızlandırmak için, bir çerçeveyi temsil eden sütunlar ve tanımlanmış mitokondriyi temsil eden çizgiler ile Mitometre .txt çıktı dosyalarıyla tutarlı verileri okuyan rutin bir optimizasyon kodlandı. Rutin optimizasyon, tanımlanan her mitokondri için çerçevelerin ortalamasını alarak ve ardından görsel alan başına tüm mitokondri sonuçlarının ortalamasını alarak parametre başına tek bir değerde veri üretir. Geliştirilen rutin, 1'den yukarı doğru numaralandırılmış klasörlerden dosyaları okur. Canlı Komut Dosyası Rutin Optimizasyonu, tablo biçiminde tek bir elektronik tablo dosyası çıkarır. Bu çıktıda, sütunlar analiz edilen parametreleri temsil eder (örneğin, "Ana Eksen Uzunluğu"; "Yoğunluk") ve çizgiler analitik değişkenlerin görsel alanlarını temsil eder (örneğin, "Kontrol").
Daha önce yayınlanmış sonuçlar, RARβ aktivasyonundan sonra primer nöronal kültürlerin hücre gövdesindeki mitokondriyal membran potansiyelinin azaldığını ve aksonal mitokondri hareketinin arttığını açıklamaktadır6.
Diferansiye nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde de benzer tedaviler uygulandı, retinoik asit reseptör agonistleri ve antagonistleri ile 72 saat boyunca tedavi edildi (Şekil 3). Toplanan veriler doğrusal olarak taranmış ve yönsüz, 2 kuyruklu, 2 örneklemli, eşit varyanslı Student t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. Çıktı elektronik tablo dosyasında, uygun gruplar arasında α = 0.05 ile karşılaştırmalar yapılmıştır.
Şekil 3: İzoforma özgü retinoid sinyalleme ile mitokondriyal homeostazın düzenlenmesi. (A) İşlemden sonra mitokondrinin temsili görüntüsü (üstte), ilgili yüzey grafiği (ortada) ve otomatik segmentasyon (altta). Mavi noktalar mitokondriyal başlangıç konumlarıdır; Kırmızı noktalar son konumlardır. Ölçek çubukları = 30 μm. (B) Mitokondri parametrelerinde bulunan tüm varyasyonları özetleyen ısı haritası; Hücre gövdesi ile nörit arasında anlamlı varyans bulundu (iki yönlü ANOVA, p=0.0158), tüm mitokondrilerde RAR izoforma özgü modülasyonun önemli etkisi vardı (iki yönlü ANOVA, p=0.0082). (C) Mitokondriyal Uzunluk - AM580 ile tedavi edilen hücrelerde önemli bir azalma gözlendi (p = 0.0179). (D) Mitokondriyal yüzey alanı - AM580 (p = 0.000406) ve BMS493 (p = 3.01 × 10-8) ile tedavi edilen hücrelerde önemli düşüşler gözlendi. (E) Mitokondriyal hacim için normalize edilmiş TMRM yoğunluğu - RA (p = 0.00621) ve Ch55 (p = 0.000542) ile tedavi edilen hücrelerde önemli düşüşler bulundu. * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Koşul başına üç tekrarın her birinden beş hücre ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Analiz, farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin RARα agonisti AM580 ile tedavisinin ortalama mitokondri uzunluğunda ve yüzey alanında bir azalmaya yol açtığını ortaya koymaktadır; bu etki, yalnızca RARα dışındaki diğer izoformlar için agonistlerle tedavi edilirken bulunmadı, ancak RAR pan-antagonisti BMS493 ile tedaviyi takiben mitokondriyal yüzey alanında% 35.42 ± 0.5'lik ilginç bir azalma oldu (p = 3.01 x 10-8). Buna karşılık, retinoidler, mitokondri membran polarizasyonu11 ile ilgili olan TMRM yoğunluğu açısından zıt bir etkiye sahip gibi görünmektedir: RARα agonisti ile tedavinin TMRM yoğunluğunda önemli bir etkisi olmadığı görülürken, RA'daRAR pan-agonisti ile tedavi% 54.82 ± %18.01'lik dramatik bir düşüşle sonuçlanır (p = 0.00621). Bu azalma, RARα/β agonisti CH55 ile tedaviden sonra da bulunur (% 28.99 ± 4.97 azalma, p = 0.000542) ve muhtemelen RARβ spesifik agonist CD2314 ile tedaviyi takiben (37.01 ±% 28.96 azalma, p = 0.09134). Daha da önemlisi, bu yöntem aksonal mitokondri ile hücre gövdesindekiler arasında ayrım yaparak izoforma özgü RAR uyaranı ve mitokondriyal modülasyonun incelenmesine izin verdi.
Şekil 4: Görüntüleme protokolü boyunca minimal foto ağartma. (A) Z-yığını zaman aralıkları FIJI'de işlendi ve tüm zaman noktaları için ortalama yoğunlukların z-proje projeksiyonları dışa aktarıldı. (B) Aynı işlemenin z ekseni profili zamana göre çizildi. (C) Deney düzeneği için fotoağartma miktarı. Anlamlı bir değişiklik gözlenmedi (p = 0.7607; ilk ve son kare ortalama sinyal yoğunluğu için eşleştirilmiş t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canlı hücre görüntüleme, ciddi bilgi işlem gerektiren büyük dosyalar üretir, ancak en yeni araçlar bile işlemek için kapsamlı manuel girdi gerektirir. Bu rutin optimizasyon, Mitometre'de mitokondri analizi sürecini basitleştirmeye odaklanmıştır çünkü bu araç, kullanıcı girdisi ve veri çıkışı arasında çok iyi bir denge sunar. Mitokondri görüntü analizi için farklı araçlar arasında kapsamlı bir karşılaştırma daha önce gözden geçirilmiştir10. Diğer boru hatları daha çok mitokondri ağlarını ve küme kütlesini analiz etmeye veya membran potansiyel varyasyonunu analiz etmeye odaklanırken, burada sunulan bu yeni metodoloji, tüm hücre mitokondri ağının hızlı ve doğrulanmış karakterizasyonuna izin vererek, aynı zamanda akson ve hücre gövdesi mitokondrileri arasında farklılaşmaya izin verir.
MATLAB uygulaması Mitometre9 , görüntü serilerindeki mitokondriyi analiz eder: dağınık arka plan, serideki her zaman diliminden ve z-düzleminden çıkarılır, bunlar daha sonra yüksek frekanslı gürültüyü ortadan kaldırmak için bir Gauss çekirdeği ile birleştirilir, ardından segmentli mitokondri maskesi ile sonuçlanan bir yoğunluk eşiği gelir. İdeal ayarlar, tanımlanan medyan mitokondri sayısını en üst düzeye çıkarırken, resmin bitişik zamansal çerçeveleri boyunca mitokondri sayısındaki ve alandaki dalgalanmayı en aza indirirken, öteleme hareketi için önceki çerçeveden izine bir mitokondri tahsis edilir.
Diferansiye SH-SY5Y hücreleri, rutin optimizasyonun deneysel olarak doğrulanması için nöronal bir model olarak kullanıldı. Bu insan hücre hattı, kültürde kolayca çoğalan enzim aktivitesi, reseptörler veya nörofilamentler gibi çeşitli nöronal benzeri özellikleri ifade eden homojen bir nöroblast benzeri hücre hattıdır. Bu model, insan kaynaklı hücrelerin, ilgili etik kaygılar olmadan ve birincil kültürleri kullanmaktan çok daha düşük maliyetlerle denenmesine izin verir12. Farklılaşmamış SH-SY5Y, kısa süreçlerle proliferatiftir; Bu hücrelerin ardışık retinoik asit ve BDNF tedavisi ile farklılaşması proliferasyonu durdurur ve nörit uzamasını teşvik ederek yararlı bir in vitro nöronal modelsağlar 13.
Pan-RAR agonisti olarak all-trans retinoik asit (10-7 M) kullanıldı; AM580 (10-7 M) bir RARα agonistidir; CD2314 (10-7 M) bir RARβ agonistidir; Ch55 (10-7 M) bir RARα ve RARβ agonistidir; BMS493 (10-7 M) bir RAR pan-antagonistidir ve farmakolojik kontrol olarak kullanılmıştır. Bu metodoloji, yakın zamanda tarif edilen benzer bir model kullanılarak doğrulanmıştır: nöronal hücrelerde RAR'ın aktivasyonu, nöron6'daki mitokondri homeostazını düzenler. Benzer şekilde, bu optimize edilmiş rutin kullanılarak elde edilen sonuçlar literatürle tutarlıdır ve çeşitli mitokondriyal parametrelerde (mitokondri uzunluğu, yüzey alanı ve mitokondri membran potansiyeli) önemli değişiklikler gösterir ve nöritteki mitokondriyi hücre gövdesindekilerden ayırır (Şekil 3). Mitometre, mitokondriyi çekirdeğe olan mesafeye göre otomatik olarak tanımlayabilir ve ayırabilir (Şekil 1). Bu, orijinal uygulama9'dan bir özelliktir ve olduğu gibi kullanılmıştır.
Bu optimizasyon, görüntüleme dosyalarının hızlı bir şekilde işlenmesine olanak tanıyarak operatör girdisini, belge okumayı, veri işlemeyi (dakikada 100 dosya hızına) önemli ölçüde azalttı, önyargıyı azalttı ve deneysel körlemeyi artırdı. Bu deney düzeneğiyle, karelerin her birinin bir döngüyü tamamlaması yaklaşık 1 dakika sürer; yakalanan Z-düzlemlerinin sayısı (muhtemelen iğne deliği açıklığının artmasıyla birlikte) veya görme alanlarının sayısı azaltılarak daha kısa aralıklar elde edilebilir; Yakalanmadan önce bir gecikme süresi seçilerek daha uzun aralıklar gerçekleştirilebilir.
8 z-düzlemi ve 15 çerçeve ile beş pozisyondan oluşan bir deney düzeneği, hücre kültürü kabı başına yaklaşık 19 dakika sürer ve bu da minimum fotoağartma ile sonuçlanır (Şekil 4). Mitokondri canlı görüntüleme ile ilgili ana deneysel sınırlama, hücrelerin sağlıklı olması için yeterli birleşme ile hücreler ve özellikle nöritler arasında ayrım yapılmasına izin verecek seyreklik arasındaki dengeyi bulmaktır. Hücreler cam tabanlı çanaklarda çok fazla birleşikle kaplanırsa, farklılaşma işlemi sırasında çoğalmaları, üst üste binen hücrelere ve nörit ağlarının oluşumuna, tek tek hücrelerin ve nöritlerin görüntülenmesinde ve taşıma yönünün belirlenmesinde zorluk, mitokondri ağ haritalamasının karıştırılmasına neden olur. İşleme açısından, MATLAB, Python gibi diğer dillerle aynı hesaplama gücüne sahip değildir, ancak MATLAB özellikle sinyal işlemede iyidir ve bu da onu mitokondri görüntüleme deneyleri için ideal hale getirir.
Bu protokol aynı zamanda sıvı bir çözelti ile akut tedaviden önce ve sonra görüntülemeye izin verir. Bunu yapmak için, mikroskop inkübasyon odası, tedavi uygulaması için cam tabanlı çanağa erişim sağlamak için dikkatlice açılmalıdır. Bu, daha büyük hacimlerde (>100 μL) en iyi sonucu verir, çünkü türbülans işlemi uygulaması onu preparat boyunca dağıtabilirken, daha küçük hacimler preparatın çalkalanmasını gerektirir, muhtemelen yönünü objektife/plaka tutucuya göre kaydırır. Böyle bir sapma meydana gelmezse, yazılımda kaydedilen pozisyonlar tedaviden önce görüntülenen aynı hücrelerle ilişkili olacaktır ve yeni bir görüntüleme döngüsü başlatılabilir. Bununla birlikte, bu varyasyonun foto ağartmayı artıracağı göz önünde bulundurulmalı ve başlangıç lazer yoğunluğundan ödün verilmelidir. Dahası, aynı protokol, nöronal primer kültürler6 veya hatta diğer hücre tipleri14 gibi diğer hücresel modellere de uygulanabilir, ancak daha hareketli hücreler veya daha uzun görüntüleme periyotları için görüntüleniyorsa mikroskopi bölümünün optimizasyonunu gerektirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Görüntü alımı, PPBI'nin (Portekiz Biyogörüntüleme Platformu) bir düğümü olan iBiMED'in LiM tesisinde gerçekleştirildi: POCI-01-0145-FEDER-022122. Bu çalışma, Ministério da Educação e Ciência'nın Fundação para a Ciência e Tecnologia'sından DT'ye bir hibe olan FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) tarafından desteklenmiştir (2020.02006.CEECIND), ATG-Gabba Mezunlar Derneği'nden VP'ye bir hibe ve Aveiro Üniversitesi Biyotıp Enstitüsü-iBiMED.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E.
- Clare, D. K., Saibil, H. R.
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
