Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Sojabohnen (Glycine max) gehören zu den wertvollsten Nutzpflanzen in der Landwirtschaft. Es hat Tausende von kommerziellen und industriellen Verwendungszwecken, wie z. B. Lebensmittel, Tierfutter, Öl und als Rohstoffquelle für die Herstellung¹. Seine Fähigkeit, eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenmikroorganismen, insbesondere Rhizobien, einzugehen, erhöht die Bedeutung der Untersuchung der Sojabohnengenetik^{weiter 2}. So kann beispielsweise die Feinabstimmung der Stickstofffixierungseigenschaften in Sojabohnenwurzeln zu einer Verringerung der Kohlenstoffemissionen führen und den Bedarf an Stickstoffdünger erheblich senken³. Daher hat das Verständnis der Genetik, die insbesondere Aspekte der Biologie der Sojabohnenwurzel steuert, breite Anwendungen in der Landwirtschaft und Industrie. In Anbetracht dieser Vorteile ist es wichtig, ein zuverlässiges Protokoll zur Analyse der Funktion von Sojabohnengenen zu haben.

Agrobacterium tumefaciens ist vielleicht das am häufigsten verwendete Werkzeug für die genetische Transformation von Pflanzen, da es in der Lage ist, Transfer-DNA (T-DNA) in das Kerngenom vieler Pflanzenarten zu integrieren. Wenn Agrobacterium eine Pflanze infiziert, überträgt es das tumorinduzierende (Ti) Plasmid in das Wirtschromosom, was zur Bildung eines Tumors an der Infektionsstelle führt. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird seit Jahrzehnten häufig für die Genfunktionsanalyse und zur Modifikation von Pflanzenmerkmalen eingesetzt⁴. Obwohl jedes interessierende Gen durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation leicht in Wirtspflanzenzellen übertragen werden kann, hat diese Methode mehrere Nachteile. Es ist zeitaufwändig, teuer und erfordert für viele Pflanzenarten, wie z. B. Sojabohnen, umfangreiches Fachwissen. Obwohl einige Sojabohnensorten durch den Keimblattknotenansatz unter Verwendung von A. tumefaciens transformiert werden können, erfordert die Ineffizienz dieses Ansatzes die Notwendigkeit einer alternativen genetischen Transformationstechnologie, die schnell und hocheffizient ist ^4,5. Auch ein Laie kann diese Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Haarwurzel-Transformationsmethode (HR) anwenden, um diese Nachteile zu überwinden.

Die HR-Transformation ist ein relativ schnelles Werkzeug, nicht nur für die Analyse der Genfunktion, sondern auch für biotechnologische Anwendungen, wie die Herstellung von spezialisierten Metaboliten und Feinchemikalien sowie komplexer bioaktiver Glykoproteine⁶. Die Herstellung von Sojabohnen-HRs erfordert kein umfangreiches Fachwissen, da sie durch Verwundung der Oberflächen von Keimblättern und anschließender Inokulation mit Agrobacterium rhizogenes⁷ erzeugt werden können. A. rhizogenes exprimiert Virulenzgene (Vir), die durch sein Ti-Plasmid kodiert werden, das seinen T-DNA-Abschnitt in das Genom von Pflanzenzellen überträgt, trägt und integriert und gleichzeitig das Wachstum der ektopischen Wurzeln stimuliert⁸.

Im Vergleich zu anderen Genexpressionssystemen für Sojabohnen, wie z. B. der Biolistik oder der A. tumefaciens-basierten Transformation von Gewebe-, Zell- und Organkulturen, weist das HR-Expressionssystem mehrere Vorteile auf. Erstens sind HRs genetisch stabil und werden schnell auf hormonfreien Medien produziert ^1,9,10. Darüber hinaus können HRs spezialisierte Metaboliten in Mengen produzieren, die den nativen Wurzeln entsprechen oder diese überschreiten^11,12. Diese Vorteile machen HRs zu einem wünschenswerten biotechnologischen Werkzeug für Pflanzenarten, die mit A. tumefaciens nicht kompatibel sind oder die spezielle Gewebekulturbedingungen benötigen, um kompatible Gewebe zu bilden. Die HR-Methode ist ein effizienter Ansatz zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, der subzellulären Lokalisierung von Proteinen, der rekombinanten Proteinproduktion, der Phytoremediation, der Mutagenese und genomweiten Effekten unter Verwendung der RNA-Sequenzierung^13,14,15. Es kann auch verwendet werden, um die Produktion spezialisierter Metaboliten zu untersuchen, die in der Industrie von Wert sind, einschließlich Glyceollinen, die die Abwehr von Sojabohnen gegen den wichtigen mikrobiellen Krankheitserreger Phytophthora sojae behandeln und beim Menschen beeindruckende krebshemmende und neuroprotektive Wirkungen haben^16,17.

Dieser Bericht demonstriert ein einfaches, effizientes Protokoll zur Herstellung von HRs für Sojabohnen. Im Vergleich zu früheren HR-Transformationsmethoden bietet dieses Protokoll eine signifikante (33%-50%) Verbesserung der HR-Bildung, indem A. rhizogenes-Transformanten vor der Inokulation von Sojabohnen-Keimblättern auf das Vorhandensein des Ti-Plasmids voruntersucht werden. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls, indem wir mehrere binäre Vektoren transformieren, die Sojabohnen-Transkriptionsfaktor-Gene überexprimieren oder stilllegen.

Anmerkungen: Es wird empfohlen, alle weiteren Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen.

1. Sterilisation von Sojabohnensamen

1. Legen Sie in einer Biosicherheitswerkbank 16-20 runde Williams 82-Sojabohnensamen in makellosem Zustand (d. h. ohne Risse oder Schönheitsfehler) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 30 ml 70%igen Isopropylalkohol hinzu, schütteln Sie ihn 30 Sekunden lang vorsichtig und dekantieren Sie dann den Alkohol.
3. Schütteln Sie die Samen vorsichtig mit 30 ml 10%iger Bleichmittel für 10 s und lassen Sie die Samen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) in der Lösung ruhen. Nach 5 Minuten das Bleichmittel abtropfen lassen.
4. Wiederholen Sie das Schütteln dreimal mit 30 ml sterilem hochreinem H2O für 1 Minute pro Spülgang und entsorgen Sie das_H2Ozwischen jedemSpülgang.
5. Legen Sie die sterilisierten Samen auf Filterpapier, das mit 5 ml Keimungs- und Cokultivierungsmedium (GC) (Autoklav, halbstarke Flüssigkeit, Murashige- und Skoog [MS]-Medium mit 1% Saccharose [pH = 5,8] getränkt ist, und fügen Sie dann 2,5 ml/l Vitamine) in sterile Petrischalen hinzu.
6. Stellen Sie die Platten 3 Tage lang bei RT (25 °C) im Dunkeln, bevor Sie die Platten bei 22 °C unter 16 h kaltweißer T5-Leuchtstoffröhre (100 μE ^m-2·s-1) für 4 Tage umfüllen, damit die Samen keimen können.
   Anmerkungen: Entsorgen Sie zerknitterte oder rissige Samen. Die besten Samen sind diejenigen, die groß und gleichmäßig gelb sind. Sterilisieren Sie mindestens die doppelte Anzahl von Samen, die für das Experiment erforderlich sind, um Samen von guter Qualität auszuwählen, da einige Samen aufgrund von Schäden, Krankheiten oder Nichtkeimung möglicherweise nicht optimal sind.

2. Infektion der Keimblätter mit K599

HINWEIS: Verwenden Sie Vektoren der pGWB-Serie, da deren duale Selektion die genomische Integration der gesamten T-DNA-Kassette gewährleistet. Mittels Elektroporation wurde ein binärer Vektor, der das interessierende Gen enthält , in A. rhizogenes pRi2659 umgewandelt¹⁸.

1. Basierend auf der Sequenz des Plasmids¹⁸ von A. rhizogenes pRi2659 wurden Primer zum Nachweis des Ti-Plasmidgens VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 umgekehrt: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Erwartete Verstärkungsgröße: 221 bp). Nach der Transformation werden die Agrobacterium-Kolonien mit einem PCR-Kit auf die Retention von VirD2 mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) getestet (siehe Materialtabelle). PCR-Zyklus: 94 °C für 3 min; 35 Zyklen (94 °C für 1 Minute, 58 °C für 30 Sek., 72 °C für 1 Minute); und 72 °C für 10 min.
2. Nach der Auswahl der A. rhizogenes-Kolonie , die sowohl VirD2 als auch das interessierende Gen (GOI) enthält, werden einige Platten auf Luria-Bertani (LB)-Platten, die die entsprechenden Antibiotika (50 mg/L) für das interessierende Plasmid enthalten, gestreift und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Wenn Sie Spectinomycin verwenden, fügen Sie eine Konzentration von 100 mg/l hinzu.
3. Verwenden Sie eine P200-Pipettenspitze, um eine ~1,5 cm lange Länge des K599 Agrobacterium von den LB-Platten abzukratzen, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Phosphatpuffer (PB; 0,01 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
4. Das Agrobakterium wird in sterilisiertem, hochreinem_H2O(v/v = 1:1) und Acetosyringon (AS; 100 mM Vorrat an Dimethylsulfoxid [DMSO], v/v = 1:1000) verdünnt. Messen Sie die Absorption mit einer Küvettenröhre bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD600). Der erwartete optimale Bereich liegt zwischen 0,5 und 0,8.
5. Tauchen Sie in einer Biosicherheitswerkbank ein sterilisiertes Skalpell in die K599 Agrobacterium-Lösung und machen Sie mehrere 1 mm tiefe Schnitte entlang der Innenfläche (adaxial, flache Seite) des Keimblatts. Verwenden Sie während der Impfung eine sterilisierte Pinzette, um das Keimblatt zu stabilisieren.
6. Legen Sie etwa 6-8 Keimblätter mit der Schnittseite nach unten auf eine Petrischale mit Filterpapier, das mit GC-Medium mit AS getränkt ist.
   Anmerkungen: Für die Herstellung von 6 Platten sind 50 ml GC-Medium und 50 μl 100 mM AS ausreichend, um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen.
7. Inkubieren Sie die Platten bei RT (25 °C) für 3 Tage unter einer 16-stündigen Photoperiode (~65 μE).
8. Übertragen Sie die infizierten Keimblätter auf haarige Wurzelwachstumsplatten (HRG) (Autoklav halbstarke MS mit 3% Saccharose [pH = 5,8] und 2,6 g/L Gelzan, dann 2,5 ml/l Vitaminmischung und 500 mg/L Timentin).
   HINWEIS: Es gab einige Probleme mit Timentin von einigen alternativen Anbietern, von denen der K599 nicht beseitigt wurde. Es wird empfohlen, höhere Petrischalen (100 mm x 25 mm) für HRG-Medium zu verwenden.
9. Inkubieren Sie die HRG-Platten bei 22 °C in einer Wachstumskammer mit den Parametern auf 100 μE Licht bei einer 16-stündigen Photoperiode, bis Primärwurzeln mit Sekundärwurzeln von 2-3 cm Länge beobachtet werden (~3-4 Wochen).

3. Auswahl und Ernte von HRs

1. Ernten Sie Primärwurzeln (5-7 cm lang), die aus der Hornhaut wachsen und Sekundärwurzeln (2-3 cm lang) enthalten, mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette. Übertragen Sie auf ausgewählte HRG-Platten, die die entsprechenden Antibiotika enthalten. Lassen Sie die HRs noch 5 Tage auf den ausgewählten HRG-Platten wachsen.
   HINWEIS: Kanamycin (50 mg/l), Hygromycin (50 mg/l) oder Phosphinothricin (10 mg/l) werden in der Regel zur Auswahl verwendet. Für Expressionsvektoren wird pGWB2 für die Überexpression, pANDA35HK für das RNAi-Silencing, pGWB6 für die subzelluläre Lokalisation und pMDC7 für die induzierbare Expression verwendet.
2. Ernten Sie an Tag 5 transgene HRs mit Sekundärwurzeln von 3-6 cm Länge. Bei der Beobachtung fluoreszierender Proteine weisen die Sekundärwurzeln wenig Autofluoreszenz auf. Wenn Sie Elizitor oder chemische Behandlungen durchführen, schneiden Sie die Sekundärwurzeln in 1 cm große Stücke und legen Sie ~100 mg auf HRG-Agar auf einen Haufen. Tränken Sie dann die Stapel mit 80 μl der entsprechenden Behandlung und lassen Sie die Platten bei RT (25 °C) inkubieren.
3. Fahren Sie nach der gewünschten Behandlungszeit mit der Extraktion von RNA oder Metaboliten fort.
4. Für RNA tupfen Sie die Wurzeln schnell auf einem sterilisierten Papiertuch trocken und ernten Sie sie direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Versiegeln Sie die Oberseite der Tube sofort mit Parafilm, bohren Sie zwei kleine Löcher mit einer spitzen Pinzette und tauchen Sie die Röhren in flüssigen Stickstoff. 3 Tage gefriertrocknen, dann die Proben bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Es ist wichtig, HRs auszuwählen, die weiß sind. Nach 5 Tagen Wachstum auf der selektiven Platte bleiben transgene HRs weiß, aber nicht-transgene Wurzeln werden braun.

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus den veröffentlichten Daten19,20. Die Ergebnisse der Kolonie-PCR (cPCR) des transformierten K599 Agrobacterium sind in Abbildung 1 dargestellt. Wie die positiven Kolonien in Abbildung 1 zeigen, wurde das interessierende Gen mittels cPCR nachgewiesen (Abbildung 1A). Ein Drittel bis die Hälfte der Kolonien waren jedoch negativ für das VirD2-Gen-Screening (Abbildung 1B), was auf den Verlust des Ti-Plasmids hindeutet, und wären nicht in der Lage, Hornhaut oder Haarwurzeln zu erzeugen. Abbildung 2 veranschaulicht den gesamten Aufbereitungsprozess von Sojabohnen-HRs und die Genexpressionsanalyse. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GFP-GmJAZ1-6. Abbildung 4 zeigt eine Genexpressionsanalyse, die die Überexpression des Glyceollin-Transkriptionsfaktors GmHSF6-1 und das RNAi-Silencing von GmMYB29A2 in Williams 82 Haarwurzeln zeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden in mehreren neueren Berichten erzielt20,21.

Abbildung 1: Kolonie-PCR (cPCR) des K599 Agrobakteriums unter Verwendung von Kolonie-PCR-Primern des interessierenden Gens oder VirD2. (A) Gen von Interesse cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abkürzungen: C = Kolonie; +ve = Positivkontrolle; -ve = Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Überblick über die Sojabohnen-Haarwurzelkultur (HR) und das Verfahren zur Analyse der Genfunktion. Schwielen bildeten sich 2 Wochen nach der Infektion mit K599 Agrobacterium an der Wundstelle. Die Zelldifferenzierung erfolgte nach 1 Woche, dann verstrich 1 Woche für die HR-Verlängerung. Es folgte die HR-Ernte und der Wandglucan-Elizitor (WGE)/Probebehandlung für 24 Stunden. Die HRs wurden einer Metabolitenextraktion für die Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC)-Analyse bzw. RNA-Isolierung für die Genexpressionsanalyse unterzogen. WGE ist der Wandglucan-Auslöser aus Phytophthora sojae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopie von GmJAZ1-6 translational fusioniert mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) in transgenen Williams 82 Haarwurzeln. (A) Grüner Kanal (GFP). (B) Blauer Kanal (DAPI). (C) Zusammenführung von grünen und blauen Kanälen. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss-Mikroskop aufgenommen. DAPI-Bilder (6 μg/ml) deuten auf eine Kernfärbung hin. Die Maßstabsbalken sind 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Genexpressionsanalyse. (A) Genexpression bei Überexpression von GmHSF6-119 Williams 82 Sojabohnen-HRs unter 24-h-Probebehandlung oder 24-h-Induktion mit WGE. (B) Genexpression in RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 Sojabohnen HRs, die für 24 h mit WGE induziert wurden. WGE ist der Wandglucan-Auslöser aus Phytophthora sojae. einSignifikant größer und bsignifikant kleiner als die Kontrollgruppe, t-Test der gepaarten Studierenden (p < 0,01). Fehlerbalken repräsentieren SE (n ≥ 3 biologische Replikate). Sekundärwurzeln, die von einer Primärwurzel gesammelt wurden, deuteten auf ein biologisches Replikat hin. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Lin et al.19 und Jahan et al.20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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