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Methodenartikel

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/65530

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2. Februar 2024

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1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Zusammenfassung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) können sich in jede Art von Zelle differenzieren, was sie zu einer hervorragenden alternativen Quelle für menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse macht. hPS-Zellen können entweder embryonale Stammzellen (hES-Zellen) sein, die aus der Blastozyste stammen, oder induzierte pluripotente Zellen (hiPS-Zellen), die direkt aus somatischen Zellen durch einen Reprogrammierungsprozess erzeugt werden. Hier wird ein videobasiertes Protokoll vorgestellt, um die optimalen Kultur- und Passagebedingungen für hPSCs vor ihrer Differenzierung und anschließenden Erzeugung von insulinproduzierenden Pankreaszellen zu skizzieren. Diese Methodik folgt dem sechsstufigen Prozess der β-Zell-gerichteten Differenzierung, bei dem sich hPSCs in definitives Endoderm (DE), primitive Darmröhre, posteriores Vorderdarmschicksal, Pankreasvorläuferzellen, endokrine Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse und schließlich pankreatische β-Zellen differenzieren. Es ist bemerkenswert, dass diese Differenzierungsmethode einen Zeitraum von 27 Tagen benötigt, um menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zu erzeugen. Das Potenzial der Insulinsekretion wurde durch zwei Experimente bewertet, die Immunfärbung und glukosestimulierte Insulinsekretion umfassten.

Einleitung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) haben die einzigartige Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, was sie zu einer praktikablen Alternative zu menschlichen β-Zellen der Bauchspeicheldrüsemacht 1. Diese hPSCs werden in zwei Typen eingeteilt: embryonale Stammzellen (hESCs), die von der Blastozyste2 abgeleitet sind, und induzierte pluripotente Zellen (hiPSCs), die durch direkte Reprogrammierung somatischer Zellen erzeugtwerden 3. Die Entwicklung von Techniken zur Differenzierung von hPSCs in β-Zellen hat wichtige Auswirkungen sowohl auf die Grundlagenforschung als auch auf die klinische Praxis 1,4. Diabetes mellitus ist eine chronische Krankheit, von der weltweit >400 Millionen Menschen betroffen sind und die auf die Unfähigkeit des Körpers zurückzuführen ist, die Glykämie aufgrund von Fehlfunktionen oder Verlust von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zu regulieren5. Die begrenzte Verfügbarkeit von Pankreas-Inselzellen für die Transplantation hat die Entwicklung von Zellersatztherapien für Diabetesbehindert 2,4,6,7. Die Fähigkeit, glukosereaktive insulinsekretierende Zellen mit hPSCs zu erzeugen, dient als nützliches zelluläres Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion menschlicher Inselzellen. Es kann auch verwendet werden, um potenzielle therapeutische Kandidaten für die Diabetesbehandlung in einer kontrollierten Umgebung zu testen. Darüber hinaus haben hPSCs das Potenzial, Pankreas-Inselzellen zu produzieren, die genetisch mit dem Patienten identisch sind, wodurch das Risiko einer Immunabstoßung nach der Transplantation verringertwird 2,4,7.

In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte bei der Verfeinerung von hPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokollen, was zu einer erhöhten Effizienz und Reproduzierbarkeit des Differenzierungsprozesses zur Erzeugung von Pankreas-β-Zellen führte 8,9.

Das folgende Protokoll beschreibt die wesentlichen Stadien der gerichteten Differenzierung von Pankreas-β-Zellen. Es beinhaltet die Regulation spezifischer zellulärer Signalwege zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Es basiert auf dem von Sui L. et al.10 (2018) entwickelten Protokoll zur Erzeugung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen. Das Protokoll wurde an die jüngsten Aktualisierungen von Sui L. et al.11 (2021) angepasst, da die neuesten Forschungsergebnisse die Bedeutung der Verwendung von Aphidicolin (APH)-Behandlung zur Verbesserung der Differenzierung von β-Zellen betonen. Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Zugabe von APH zum Medium in den späteren Phasen des Prozesses. Darüber hinaus wurden in den frühen Stadien der Differenzierung Änderungen an der Zusammensetzung des Mediums im Vergleich zum ursprünglichen Protokoll vorgenommen. Eine bemerkenswerte Änderung ist die Hinzufügung des Keratinozyten-Wachstumsfaktors (KGF) an Tag 6 und bis Tag 8. Der Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) wird von Tag 6 bis Tag 8 eingeführt, was sich geringfügig vom ursprünglichen Protokoll10 unterscheidet, bei dem KGF nicht im Medium der Stufe 4 enthalten war.

Der erste und wesentliche Schritt bei der Erzeugung β-zellähnlicher Zellen ist die gerichtete Differenzierung von hPSCs in das definitive Endoderm (DE), eine primitive Keimschicht, aus der die Epithelauskleidung verschiedener Organe, einschließlich der Bauchspeicheldrüse, hervorgeht. Nach der Bildung von DE differenzieren sich die Zellen in die primitive Darmröhre, gefolgt von der Spezifizierung des hinteren Vorderdarmschicksals. Der hintere Vorderdarm entwickelt sich dann zu Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, die das Potenzial haben, sich in alle Zelltypen der Bauchspeicheldrüse zu differenzieren, einschließlich der endokrinen und exokrinen Zellen. Der nächste Schritt des Prozesses umfasst endokrine Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, aus denen die hormonsezernierenden Zellen hervorgehen, die in den Langerhans-Inseln vorkommen. Am Ende erreicht der Differenzierungsprozess sein Endstadium durch die Herstellung voll funktionsfähiger pankreatischer β-zelliger Zellen 9,10. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Prozess komplex ist und oft eine Optimierung der Kulturbedingungen erfordert, wie z. B. spezifischer Wachstumsfaktoren und extrazellulärer Matrixkomponenten, um die Effizienz und Spezifität der Differenzierung zu verbessern 9,10. Darüber hinaus ist die Erzeugung funktioneller β-Zell-ähnlicher Zellen aus hPSCs in vitro immer noch eine große Herausforderung. Die laufende Forschung konzentriert sich auf die Verbesserung der Differenzierungsprotokolle und die Verbesserung der Reifung und Funktion der resultierenden β-Zellen9.

In diesem Protokoll ist die Verwendung einer sanften Zelldissoziation während der Kultur und Passage von hPSCs unerlässlich, um die Lebensfähigkeit und Pluripotenz der Zellen aufrechtzuerhalten und die Effizienz der Differenzierung in Pankreas-β-Zellen erheblich zu verbessern. Darüber hinaus wurde jedes stadienspezifische Medium akribisch nach dem von Sui L. et al.10 entwickelten Protokoll optimiert, um eine hohe Ausbeute an insulinsekretierenden Zellen in Clustern zu fördern, die der menschlichen Insel sehr ähnlich sind.

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Protokoll

Vor Beginn der Differenzierung wird empfohlen, die erforderliche Anzahl von inselartigen Organoiden für experimentelle Zwecke zu bestimmen. In einer 6-Well-Platte besteht ein einzelner Well mit über 80 % Konfluenz typischerweise aus 2-2,3 Millionen hPSCs. Während eine genaue Vorhersage aufgrund von Variationen der hPSC-Linien und der Differenzierungseffizienz eine Herausforderung darstellt, ist eine grobe Schätzung das 1,5-fache der Anzahl der ersten Wells. Eine effektiv gerichtete Differenzierung ergibt in der Regel 1,6 bis 2 Millionen Zellen pro Well in Sechs-Well-Platten, die alle Zellen innerhalb der Cluster und nicht ausschließlich insulinproduzierende Zellen umfassen. Bei einem 50-μm-Cluster kann man annähernd etwa 10.000 Zellen enthalten. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der Medienzusammensetzung, die für jeden Tag/jedes Stadium der gerichteten Differenzierung auf Stammzellmatrix und -medium zusammen mit dem glukosestimulierten Insulinsekretionspuffer verwendet wird.

1. Passieren humaner pluripotenter Stammzellen vor der Differenzierung in 6-Well-Platten

HINWEIS: Die angemessene Passage menschlicher Stammzellen vor der Differenzierung in β-zellähnliche Zellen ist ein entscheidender Schritt bei der Etablierung des experimentellen Prozesses. Eine falsche Verdünnung des Durchgangs oder eine falsche Anzahl der Bindungszellen kann die Differenzierungseffizienz und -treue beeinträchtigen.

  1. Bereiten Sie Stammzellkulturmedium, Beschichtung und Dissoziationslösungen vor (wie in Tabelle 1 angegeben).
  2. 1-2 h vor dem Passieren eine Sechs-Well-Platte mit kalter Beschichtungslösung (1 ml pro Well) beschichten und bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren.
  3. Erwärmen Sie ein Aliquot des Stammzellkulturmediums bei Raumtemperatur (15 -25 °C) für 20 min.
  4. Aspirieren Sie das Stammzellmedium und fügen Sie 1 ml calcium/magnesiumfreies D-PBS hinzu.
  5. Wiederholen Sie Schritt 1.4. zweimal.
    HINWEIS: D-PBS wird hinzugefügt, um die Zellen zu waschen und das vorherige Medium und die Verbindungen zu entfernen. Es ist wichtig zu beachten, dass für die Waschschritte kein bestimmter Zeitrahmen erforderlich ist, da die Exposition gegenüber D-PBS die hPSCs nicht schädigt und einen Zellbruch oder eine Schrumpfung durch Osmose verhindert.
  6. Aspirieren Sie D-PBS, fügen Sie 500 μl Dissoziationslösung für jede Vertiefung hinzu und lassen Sie es 2-5 Minuten bei Raumtemperatur (15 - 25 °C) ruhen.
  7. Während die Zellen dissoziieren, saugen Sie die Beschichtungslösung der neuen 6-Well-Platte an und geben Sie 1-2 ml calcium-/magnesiumfreies D-PBS in jedes Well.
  8. Überprüfen Sie regelmäßig den Dissoziationsprozess unter dem inversen Mikroskop.
  9. Aspirieren Sie die Dissoziationslösung, wenn 80 - 90% der Zellen gerundet sind, aber noch adhärent sind.
  10. Fügen Sie 1 ml des Stammzellmediums hinzu, das 10 μM ROCK-Inhibitor enthält.
  11. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit steril gefilterten 1.000-μl-Pipettenspitzen und einer P1000-Pipette.
  12. Zerreiben Sie die Zellsuspension langsam in der Pipette mit einer sterilen 1.000-μl-Pipettenfiltrierspitze, um die Kolonien aufzubrechen, jedoch nicht mehr als 10 Mal.
  13. 1 ml des Stammzellmediums, das den ROCK-Inhibitor enthält, wird hinzugefügt, um die verbleibenden hPSCs abzulösen, und die Zellsuspension in dasselbe konische 15-ml-Röhrchen (1.10) überführt.
  14. Aspirieren Sie das D-PBS aus der neu beschichteten Platte und fügen Sie sofort die Zellsuspension aus dem konischen 15-ml-Röhrchen hinzu. Um ein optimales Zellwachstum zu gewährleisten, säen Sie einen Bereich von 2 x 105- 1 x 106 lebensfähigen Zellen pro Well, wenn Sie eine 6-Well-Platte verwenden (1 in 10 bis 1 in 50 Splits).
    HINWEIS: Für die Volumenberechnung muss jede Vertiefung einer 6-Well-Platte 2 ml Stammzellmedium mit ROCK-Inhibitor enthalten.
  15. Bewegen Sie die Platte schnell hin und her und 5 - 10 Mal von einer Seite zur anderen.
  16. Stellen Sie die Platte 24 h lang auf 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator.
  17. Am nächsten Tag durch frisches Stammzellmedium ohne ROCK-Inhibitor ersetzen, und dann alle 2 Tage, bis die Konfluenz der hPSCs 80 - 95% erreicht hat.

2. Aus menschlichen Stammzellen gewonnene β-Zell-gerichtete Differenzierung

HINWEIS: Die hPSCs können für den direkten Differenzierungsprozess in Pankreas-β-Zellen verwendet werden, wenn eine Konfluenz von 80-95% erreicht ist.

  1. Tag -1: Durchgang der Zellen Tag -1 der Differenzierung:
    1. 1-2 h vor der Passage eine 6-Well-Platte mit kalter Beschichtungslösung in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator für 1 h beschichten.
    2. Befolgen Sie die Schritte 1.1 bis 1.10 und fahren Sie mit dem Zählen von Zellen fort.
    3. Laden Sie 10 μl der Zellmischung, fügen Sie ein gleiches Volumen Trypanblau hinzu und mischen Sie vorsichtig.
    4. Berechnen Sie die Zellkonzentration. Verwenden Sie 0,8 × 106 Zellen/ml - 1,0 x 106 Zellen/ml Stammzellmedium mit 10 μM ROCK-Inhibitor, um die beschichtete 6-Well-Platte mit 2 ml Medium pro Well zu beschichten.
    5. Bewegen Sie die Platte dreimal schnell hin und her, von einer Seite zur anderen.
    6. Stellen Sie die Platte in einen 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator. Bewegen Sie die Platte schnell hin und her und 10 Mal von einer Seite zur anderen. Dann die Platte 4 Stunden lang inkubieren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die maximale Anhaftung und die gleichmäßige Verteilung der Zellen die Zellen nicht stören, indem Sie die Platte nach dem Einsetzen in den Inkubator bewegen. Öffnen und schließen Sie den Inkubator sehr vorsichtig.
    7. Stellen Sie die Flasche mit dem Basalmedium für die Tage 0 bis 4 auf 4 °C, um sie über Nacht aufzutauen.
  2. Tag 0
    HINWEIS: Die hPSCs müssen zu 80 - 95% konfluent sein, starten Sie den Differenzierungsprozess nicht zum endgültigen Endoderm unter dieser Konfluenz.
    1. Tauen Sie auf Eis sowohl das Basalmedium für die Tage 0 bis 4 als auch die Ergänzungen auf (siehe Materialtabelle).
    2. Bereiten Sie in zwei konischen Röhrchen nur das erforderliche Volumen für Tag 1 vor (2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und in einem separaten Röhrchen verdoppeln Sie das Volumen für Tag 2,5 bis 4 (2 x 2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte). Lagern Sie den Tag 2,5 bis Tag 4 medium bei 4 °C.
    3. Erwärmen Sie ein Aliquot des erforderlichen Volumens des Tagesmediums 1 und des Waschmediums 1 in einem 37 °C warmen Wasserbad für 5 Minuten.
    4. Aspirieren Sie das Stammzellmedium und fügen Sie 2 ml Waschmedium hinzu 1.
      HINWEIS: Das im Protokoll verwendete Waschmedium besteht aus dem für jeden Tag/jede Phase spezifischen Basalmedium, ergänzt mit 1% Antibiotika. Die Waschschritte des direkten Differenzierungsprotokolls umfassen nur die Zugabe des vorgesehenen Waschmediums (als "Waschmedium 1 oder 2" bezeichnet), Materialtabelle) und die anschließende Aspiration nach dem beschriebenen Verfahren 2.2.4. Es ist wichtig zu erwähnen, dass für diese Waschschritte kein bestimmter Zeitrahmen angegeben ist.
    5. Waschmedium 1 absaugen und sofort 2 ml des Tages-1-Mediums an die Seite der Vertiefung geben.
    6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h.
  3. Tag 1
    1. Ein Aliquot des erforderlichen Volumens der Tage 2,5 bis 4 Medium in einem 37 °C warmen Wasserbad für 5 min vorwärmen.
    2. Saugen Sie das Tages-1-Medium an und geben Sie sofort 2 ml des Tages-2,5- bis 4-Mediums an die Seite der Vertiefung. Waschen Sie die Zellen nicht.
    3. Stellen Sie die Platte wieder auf 37 °C und 5 % CO2 für 36 h.
  4. Tage 2,5 bis 4
    1. Ein Aliquot des Restvolumens des Tages 2,5 bis 4 Medium im 37 °C warmen Wasserbad für 5 min vorwärmen.
    2. Saugen Sie das Medium an und geben Sie sofort 2 ml frisch zubereitetes Days 2,5 to 4 Medium an die Seite der Vertiefung.
    3. Stellen Sie die Platte wieder auf 37 °C und 5 % CO2 für 36 h.
  5. Tag 4
    HINWEIS: In diesem Stadium ist die Expression der definitiven Endodermmarker am Maximum, und die Zellen können die Differenzierung primitiver Darmschläuche initiieren.
    1. Bereiten Sie ein Aliquot des erforderlichen Volumens des Mediums für das primitive Darmstadium Tag 4 vor (2 ml pro Well einer Sechs-Well-Platte) und erwärmen Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (15 °C -25 °C).
    2. Tage 2,5 bis 4 medium ansaugen und 2 ml Waschmedium hinzufügen 1.
    3. Saugen Sie das Waschmedium 1 an und geben Sie sofort 2 ml des primitiven Darmstadiums von Tag 4 an die Seite der Vertiefung.
    4. Stellen Sie die Platte wieder auf 37 °C und 5 % CO2 für 48 h.
  6. Tag 6 bis 8
    HINWEIS: In diesem Stadium initiieren die Zellen eine weitere Differenzierung auf das hintere Vorderdarmschicksal.
    1. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des posterioren Vorderdarmmediums für die Tage 6 bis 8 vor (2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und erwärmen Sie das Medium 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (15 °C -25 °C).
    2. Aspirieren Sie das Medium für Tag 4 und fügen Sie sofort 2 ml des hinteren Vorderdarmmediums der Tage 6 bis 8 an die Seite der Vertiefung hinzu.
    3. Stellen Sie die Platte 48 h lang in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 .
  7. Tag 8 bis 12
    HINWEIS: Die Zellen sind bereit, die Differenzierung der Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse zu durchlaufen.
    1. Bereiten Sie das erforderliche Volumen der Tage 8 bis 12 Pankreasvorläuferzellen vor (2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und erwärmen Sie das Medium bei Raumtemperatur (15 °C -25 °C) für 20 Minuten.
    2. Aspirieren Sie das Medium der Tage 6 bis 8 und fügen Sie sofort 2 ml des hinteren Vorderdarmmediums der Tage 6 bis 8 an der Seite der Vertiefung hinzu.
    3. Die Platte 48 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 -Gehalt in einen Inkubator stellen.
  8. Tag 12: Ausführen des Clustering-Schritts
    HINWEIS: In diesem Stadium bilden die Zellen eine dichte Monoschicht und werden in eine 3D-Zellkultur überführt, um Cluster zu bilden. Dieser Schritt ist entscheidend für die Differenzierung, um die strukturelle Ähnlichkeit von β-ähnlichen Zellen mit nativen menschlichen Inseln zu verbessern, verbessert aber auch ihre funktionelle Ähnlichkeit sowohl auf zellulärer als auch auf Clusterebene11 (Abbildung 1).
    1. Behandeln Sie eine 6-Well-Platte mit Mikrowells mit einer Größe von 400 μm (wie in der Materialtabelle angegeben: Human Stem Cell Derived β-Cells Directed Differentiation, Tag 12) mit 2 ml Anti-Adhärenz-Spüllösung bei Raumtemperatur (15 °C - 25 °C).
      HINWEIS: Die Mikrovertiefung verhindert, dass sich Zellen am Well-Boden festsetzen, und erleichtert die mechanische Bildung von 3D-Clustern.
    2. Schleuderplatte bei 1.300 x g für 5 min.
    3. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Blasen unter einem inversen Mikroskop. Wenn keine Blasen beobachtet werden, aspirieren Sie eine Antihaft-Spüllösung und fügen Sie sofort 2 ml Waschmedium hinzu 2 (Materialtabelle).
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.8.3. zweimal.
    5. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des Clustermediums vor und erwärmen Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (15 -25 °C). Stellen Sie sicher, dass zwei Wells einer 6-Well-Platte in ein Well der 400-μm-Mikrowell-6-Well-Platte mit 4 ml des Cluster-Mediums passen.
    6. Pankreas-Vorläufermedium aspirieren und Dissoziationspuffer (0,5 ml pro Well) hinzufügen.
    7. Bei Raumtemperatur (15 °C - 25 °C) 2-5 min inkubieren. Überprüfen Sie regelmäßig den Dissoziationsprozess unter einem inversen Mikroskop und aspirieren Sie den Dissoziationspuffer, wenn die meisten Zellen gerundet sind, aber noch adhärent sind.
    8. Saugen Sie den Dissoziationspuffer an und geben Sie sofort 1 ml Clustermedium in jede Vertiefung.
    9. Dissoziieren Sie Zellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette und 1.000-μl-Filterspitzen sechsmal sanft auf und ab pipettieren.
    10. Übertragen Sie die Zellen und die Cluster-Medium-Mischung in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
    11. Fügen Sie 1 ml des Cluster-Mediums hinzu, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
    12. Fügen Sie das Clustermedium zum erforderlichen Gesamtvolumen hinzu, sodass jede Vertiefung der Mikrotiterplatte 4 ml gemischtes Clustermedium/Zellen enthält.
    13. Das Waschmedium 2 wird aus der 6-Well-Platte der Mikrowells angesaugt und die Zellsuspension übertragen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 24 h.
  9. Tag 13: Umgang mit den Zellen nach dem Clustering und Wechsel ihrer Medien ab Tag 13.
    HINWEIS: Cluster sind hochempfindlich und erfordern eine sorgfältige Handhabung, um ihre Integrität und Lebensfähigkeit in den folgenden Tagen zu gewährleisten. Daher ist es wichtig, die Cluster in der Zeit nach dem Clustering nach Tag 12 genau zu überwachen. Regelmäßige Evaluierungen und Anpassungen sind unerlässlich, um erfolgreiche Ergebnisse im experimentellen Prozess zu fördern.
    1. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des Mediums für Tage 13 (2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und in einem separaten konischen Röhrchen von 50 ml für das endokrine Vorläufermedium der Bauchspeicheldrüse an Tag 15 bis 20 vor.
    2. Sammeln Sie die Cluster langsam aus der 6-Well-Platte der Mikrowells in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einer p1000-Pipette und gefilterten 1.000-μl-Spitzen.
    3. Fügen Sie 1 ml Tages-13-Medium hinzu, um die verbleibenden Cluster zu sammeln, und übertragen Sie die Cluster in das Röhrchen.
    4. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang auf natürliche Weise unter Schwerkraft am Boden des konischen Röhrchens absetzen.
    5. Saugen Sie so viel Überstand wie möglich aus dem Röhrchen ab, ohne die Zellverbände zu stören. Die Pipettenspitzen sollten die Cluster, sondern nur den Überstand nicht berühren oder absaugen.
    6. Fügen Sie das erforderliche Volumen des Tages-13-Mediums wie folgt hinzu: 1 Vertiefung der 6-Well-Mikrowell-Platte geht in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit geringer Anhaftung (2 ml Medium pro Well).
    7. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab und vermeiden Sie dabei das Ansaugen von Clustern.
    8. Übertragen Sie die Suspension auf eine sehr schwach haftende 6-Well-Platte.
    9. Bewegen Sie die Platte sechsmal schnell hin und her, von einer Seite zur anderen.
    10. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 48 h.
    11. Führen Sie die Medienwechsel in allen nächsten Schritten bis zum Ende der Differenzierung durch, wie in diesem Abschnitt 2.9 beschrieben.
  10. Tage 15 bis 20
    1. Wechseln Sie bis zum Tag 21 der Differenzierung alle 48 Stunden zum Medium des endokrinen Vorläuferstadiums der Bauchspeicheldrüse, indem Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen sammeln und die Schritte 2.9.4 bis 2.9.10 für Tag 13 befolgen.
  11. Tag 21 bis 27
    HINWEIS: In diesem Stadium differenzieren sich Cluster auf Pankreas-β-Zellen.
    1. Bereiten Sie das Medium für das Pankreas- β-Zell-Stadium vor.
    2. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, wie für die Tage 15 bis 21 beschrieben.
      HINWEIS: Nach Tag 25 können die inselartigen Organoide einer Analyse unterzogen werden, um zu bestätigen, dass sie voll funktionsfähig sind.

3. Färbung von Pankreas-β-Zell-Clustern

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt durch, um die funktionelle Bewertung von Clustern nach der Differenzierung zu untersuchen

  1. Sammeln Sie am Ende der Differenzierung fünf bis zehn Cluster in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Fixieren Sie die Zellcluster mit 200 μl 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur.
  3. Geben Sie 1 ml PBS in die Cluster und entfernen Sie das PBS mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, ohne die Cluster zu stören.
  4. 200 μl 30%ige Saccharose in die Cluster geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  5. Übertragen Sie die Cluster in ein Kryomold, entfernen Sie überschüssige Saccharose, fügen Sie einen Tropfen O.C.T.-Medium hinzu und mischen Sie die Cluster mit O.C.T.-Medium.
  6. Den Kryoschimmel auf Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
  7. Schneiden Sie 5 μm große Schnitte aus dem gefrorenen Block auf Objektträgern mit einem Mikrotom/oder Kryostaten.
  8. Lagern Sie Objektträger bei -80 °C im Gefrierschrank, bis sie fleckig sind.
  9. Nehmen Sie die Objektträger am Tag der Färbung aus dem -80 °C Gefrierschrank.
  10. Entfernen Sie vorsichtig das Eis um die Abschnitte der Kryoform.
  11. Kreisen Sie Zellcluster auf Objektträgern mit einem hydrophoben Stift ein.
  12. Rehydrieren Sie Objektträger 15 Minuten lang in einem Objektträger-Färbegefäß, das PBS enthält.
  13. Geben Sie kaltes Methanol in das Objektträger-Färbeglas und stellen Sie das Glas mit Objektträgern für 10 Minuten auf -20 °C.
  14. Tauchen Sie die Objektträger in ein PBS-Glas.
  15. Wiederholen Sie Schritt 3.14 dreimal.
    Anmerkungen: Verwenden Sie diese Methode für alle folgenden Waschschritte.
  16. PBS von den Objektträgern entfernen und sofort mit 100 μl Blockierungslösung mit 2-5% BSA in PBS-T bedecken.
  17. Fügen Sie jedem Objektträger Blockierungslösung hinzu und bedecken Sie ihn mit Paraffinfolie.
  18. 1 h bei Raumtemperatur (15 -25 °C) inkubieren.
  19. Verdünnen Sie die Primärantikörper in der Blockierungslösung mit den im Abschnitt Reagenzien und Lösungen angegebenen Verhältnissen.
  20. Entfernen Sie die Blockierlösung von den Objektträgern.
  21. Verdünnte Antikörper sofort hinzufügen und Objektträger mit Parafilm abdecken, um ein Austrocknen des Objektträgers zu verhindern.
  22. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  23. Am nächsten Tag waschen Sie die Objektträger 3 - 5 Mal mit PBS-T.
  24. Bereiten Sie verdünnte Sekundärantikörper und DNA-Färbung vor.
  25. Entfernen Sie überschüssiges PBS-T von den Objektträgern.
  26. Verdünnte Sekundärantikörper und DNA-Färbung hinzufügen. 45 min bei Raumtemperatur (15 -25 °C) inkubieren.
  27. Waschen Sie die Objektträger 3 - 5 Mal mit PBS-T.
  28. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten von den Objektträgern.
  29. Geben Sie einen Tropfen Histologie-Eindeckmedium in jeden Abschnitt.
  30. Decken Sie den Objektträger mit einer Glasabdeckung ab.
  31. Machen Sie Fotos von gefärbten Objektträgern mit einem Fluoreszenzmikroskop.

4. GSIS (Glukose-stimulierter Insulinsekretionstest)

  1. Bereiten Sie drei verschiedene Lösungen vor: KREBS-Lösung mit niedrigem Glukosegehalt, KREBS-Lösung mit hohem Glukosegehalt und KREBS-Lösung mit niedrigem Glukosegehalt mit KCl.
  2. Erwärmen Sie alle Lösungen bei 37 °C Wasserbad.
  3. Wählen Sie mit einer 1000-μl-Pipettenspitze sorgfältig etwa 10 - 15 Cluster ähnlicher Größe aus und geben Sie sie zusammen mit einer kleinen Menge differenziertem Medium in ein 1,5-ml-Röhrchen, um ein Austrocknen der Cluster zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Cluster sollten mit bloßem Auge sichtbar sein, aber wenn nicht, legen Sie die Platte mit den differenzierten Clustern unter ein inverses Mikroskop, um die Cluster auszuwählen und in ein 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen.
  4. Legen Sie das Rohr mit Clustern und Medium auf ein Rohrgestell und warten Sie, bis die Cluster auf den Boden des Rohrs sinken.
  5. Saugen Sie den Überstand langsam mit einer 200-μl-Pipette ab und fügen Sie 200 μl KREBS-Lösung mit niedrigem Glukosegehalt hinzu.
  6. Inkubieren Sie die Inselzellen in der glukosearmen Lösung für 1 h bei 37 °C.
    HINWEIS: Um die genaue Beurteilung der Clusteranzahl und Konsistenz in Experimenten zu gewährleisten, ist es ratsam, während des Transfers das Vorhandensein aller Cluster in der Lösung zu überprüfen, da sie dazu neigen, am Röhrchen zu haften.
  7. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Inkubator und saugen Sie langsam 200 μl KREBS-Lösung an, ohne Cluster abzusaugen.
  8. 200 μl glukosearme KREBS-Lösung zugeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
  9. Das Volumen von 200 μl KREBS-Lösung mit niedrigem Glukosegehalt wird in ein 500-μl-Röhrchen abgesaugt und sofort bei -80 °C für Insulinmessungen gelagert. Wiederholen Sie dies für separate Behandlungen.
  10. Um die Cluster zu waschen, geben Sie 200 μl KREBS-Lösung ohne Glukose in das Röhrchen mit den Clustern. Lassen Sie die Trauben am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Trauben zu stören.
  11. 200 μl KREBS-Lösung mit hohem Glukosegehalt zugeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
  12. Aspirieren Sie 200 μl KREBS mit hohem Glukosegehalt in ein 500 μl-Röhrchen und lagern Sie es sofort bei -80 °C für die Insulinmessung. Wiederholen Sie dies für separate Behandlungen.
  13. Um die Cluster zu waschen, geben Sie 200 μl KREBS-Lösung ohne Glukose in das Röhrchen mit den Clustern. Lassen Sie die Trauben am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Trauben zu stören.
  14. Fügen Sie 200 μl KCl KREBS-Lösung hinzu und wiederholen Sie dies für separate Behandlungen.
  15. 30 min bei 37 °C inkubieren.
  16. 200 μl KCl KREBS-Lösung in ein 500-μl-Röhrchen ansaugen und sofort bei -80 °C für Insulinmessungen lagern. Wiederholen Sie dies für andere Behandlungen.
  17. Fügen Sie 50 μl Reinstwasser hinzu und fahren Sie mit der Messung des Gesamtinsulingehalts fort.
  18. Geben Sie 150 μl saure Ethanollösung in das Röhrchen mit Inselzellen und Reinstwasser.
  19. Lagern Sie die Proben über Nacht bei 4 °C (12 - 15 h).
  20. Am nächsten Tag jede Probe vortexen.
  21. Führen Sie die Beschallung mit einem elektrischen Ultraschallgerät durch, das 1 s lang auf 20 % Leistung eingestellt ist, um eine vollständige Lyse des Inselgewebes zu gewährleisten.
    HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 4.21, bis keine verbleibenden Cluster mehr sichtbar sind.
  22. Alle Proben werden 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert und der Überstand aufbewahrt.
  23. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nanotropfen-Spektralphotometer, das dann zur Normalisierung von Insulinmessungen verwendet werden kann.

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Ergebnisse

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll bietet einen hocheffizienten Ansatz zur Unterscheidung β-ähnlicher Zellen von hPSCs10. Bei diesem Verfahren wird ein leicht skalierbares 2D-Kultursystem verwendet, das den Einsatz in verschiedenen experimentellen Umgebungen ermöglicht, z. B. bei der Lerndifferenzierung, kleineren Projekten und Labors sowie bei Pilotversuchen, um das Potenzial einer iPSC-Linie für die Differenzierung zu bewerten.

Es ist wichtig, die funktionell...

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Diskussion

Die erfolgreiche Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen hängt von der Optimierung aller Aspekte der routinemäßigen Kultivierung und Passage der ausgewählten hPSCs ab. Dazu gehört die Sicherstellung, dass die Zelllinie einen normalen Karyotyp aufweist, negativ für eine Mykoplasmeninfektion ist und frei von Plasmid- oder viralen Vektorgenomen ist. Darüber hinaus ist es bei der Verwendung von hiPS-Zellen wichtig, die frühesten Passagen, die sich noch in der Umprogrammierung befinden, nicht für Pilotversuche zu verwe...

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Danksagungen

Ines Cherkaoui wurde durch ein Diabetes UK-Stipendium (BDA 18/0005934) an GAR unterstützt, das sich auch beim Wellcome Trust für einen Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC für einen Programmzuschuss (MR/R022259/1), Diabetes UK für einen Projektzuschuss (BDA16/0005485), CRCHUM für Start-up-Fonds, Innovation Canada für einen John R. Evans Leader Award (CFI 42649) bedankt. NIH-NIDDK (R01DK135268) für einen Projektzuschuss und CIHR, JDRF für einen Teamzuschuss (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion und Dr. Harry Leitch für ihre Hilfe bei der Erzeugung und Kultur menschlicher hiPSCs, der NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid Facility, London.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL TubeOne MikrozentrifugenröhrchenStarlabsS1615-5500
6-Well-ZellkulturplatteThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-Well-Platte STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serumfrei Thermo Fisher Scientific17504044
Rinderserumalbumin, fettsäurefreiSigma-AldrichA3803-100G
CalciumchloriddihydratSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium frei D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamin-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glukose, BioXtraSigma-AldrichG7528
Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfreiSigma-Aldrich94046-100ML-DMEM
plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016Für Waschmedium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus AdhäsionsfolienThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Sekretase-Hemmer XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 in kaltes DMEM/F-12-Medium, um eine endgültige Verdünnung von 1:100 zu erzielen.
Ziege Anti-Meerschweinchen, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Ziege Anti-Meerschweinchen, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Ziege Anti-Maus Sekundärantikörper, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568Thermo FisherScientific A-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES PufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochloridThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Rekombinantes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
ChlorwasserstoffSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP PenAgar ScientificAGG4582 LDN193189
Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma-AldrichM9272-500G
OCT Verbindung 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tabletten, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
KaliumchloridSigma-Aldrich7447-40-7
Rekombinantes humanes EGF-ProteinR& D Systems236-EG-200
Rechteckige Deckgläser, 22-fach; 50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochlorid)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung   Thermo Fisher Scientific61870036für Waschmedium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-MountThermo Fisher Scientific9990402
NatriumbikarbonatSigma-AldrichS6014-500G
NatriumchloridSigma-AldrichS3014
Natriumdihydrogenphosphat wasserfreiSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Sie das StemFlex Supplement über Nacht bei 4° auf; C, übertragen Sie die Restflüssigkeit der Ergänzungsflasche in StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans RetinsäureReprocell04-0021 
Schilddrüsen-Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypanblau-Lösung, 0,4 %ThermoFisherScientific 15250061
(1X)Thermo FisherScientific 12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Platte mit extrem niedrigem Adhärentgehalt für SuspensionskulturenThermo Fisher Scientific38071
Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes WasserThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochlorid) STEMCELL Technologies72302
ZinksulfatSigma-Aldbsp;Z4750
Tauen TrypL-Express-Enzym

Referenzen

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  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
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  8. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
  9. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
  10. Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).
  11. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).
  12. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  13. Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
  14. Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
  15. Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).

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