Methodenartikel

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

DOI:

10.3791/65634

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9. Juni 2023

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1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Zusammenfassung

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Salidrosid (Sal) enthält antikarzinogene, antihypoxische und entzündungshemmende pharmakologische Aktivitäten. Die zugrundeliegenden Anti-Brustkrebs-Mechanismen sind jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Daher sollte dieses Protokoll das Potenzial von Sal bei der Regulierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs bei der malignen Proliferation menschlicher Brustkrebs-MCF-7-Zellen entschlüsseln. Zunächst wurde die pharmakologische Aktivität von Sal gegen MCF-7 mittels CCK-8 und Zell-Scratch-Assays untersucht. Darüber hinaus wurde die Resistenz von MCF-7-Zellen durch Migrations- und Matrigel-Invasions-Assays gemessen. Für Zellapoptose und Zyklusassays wurden MCF-7-Zellen schrittweise mit Annexin V-FITC/PI bzw. Zellzyklus-Färbe-Detektionskits für Durchflusszytometrie-Analysen prozessiert. Die Gehalte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ wurden mittels DCFH-DA und Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Aktivitäten von Na+-K+-ATPase undCa2+-ATPase wurden mit den entsprechenden kommerziellen Kits bestimmt. Die Protein- und Genexpressionsniveaus in der Apoptose und im PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg wurden mit Hilfe von Western-Blot- bzw. qRT-PCR-Analysen bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Sal-Behandlung die Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen mit dosisabhängigen Effekten signifikant einschränkte. In der Zwischenzeit zwang die Sal-Verabreichung auch MCF-7-Zellen auf dramatische Weise dazu, Apoptose und Zellzyklus-Arrest zu durchlaufen. Die Immunfluoreszenztests zeigten, dass Sal die Produktion von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen beobachtbar stimulierte. Weitere Daten bestätigten, dass Sal die Expressionsniveaus der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bim, gespaltener Caspase-9/7/3 und der entsprechenden Gene förderte. Konsequenterweise reduzierte die Sal-Intervention die Expression der Proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α und FoxO1 und ihrer entsprechenden Gene deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sal als potenzielle pflanzliche Verbindung zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann, da es die maligne Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen reduzieren kann, indem es den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg hemmt.

Einleitung

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Als eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und häufigsten bösartigen Erkrankungen zeigen die neuesten Statistiken, dass bis 2020 weltweit 2,3 Millionen Fälle von Brustkrebs aufgetreten sind, was 11,7 % aller Krebsfälle ausmacht1. Häufige Symptome von Brustkrebs sind Brustspannen und -kribbeln, Knoten und Schmerzen in der Brust, Ausfluss aus der Brustwarze, Erosion oder eingesunkene Haut und vergrößerte axilläre Lymphknoten 1,2. Noch alarmierender ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen und die Gesamtinzidenz von Brustkrebs jedes Jahr mit einer überwältigenden Rate zunehmen un....

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Protokoll

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Die für die vorliegende Studie verwendeten MCF-7-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Zellkultur

  1. Die MCF-7-Zellen werden in einer befeuchteten 5%igen CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit DMEM kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) enthält (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Zellen, die 90 % des Bodens der Schale bedeckten, wurden für das Experiment verwendet und in die folgenden Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Doxorubicinhydrochloridgruppe (DXR, 5 μM) und Sal-Gruppe (20 μM, 40 μ....

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Ergebnisse

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Auswirkungen von Sal auf die Hemmung der übermäßigen Proliferation und die Verzögerung der Wundheilung in MCF-7-Zellen
Um das Potenzial von Sal gegen Brustkrebs zu untersuchen, testeten wir zunächst seine krebshemmenden Eigenschaften mit Hilfe von Zellproliferationstoxizität und Scratch-Assays der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Diese Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe von Sal (5-320 μM) für 24 h co-inkubiert, und die Zellproliferation wurde mit einem CCK-8-Assay bewertet. Es wurde e.......

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Diskussion

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Brustkrebs betrifft Menschen jeden Alters und verursacht unkalkulierbare körperliche und seelische Belastungen und einen großen wirtschaftlichen Druck1. Brustkrebs mit seiner von Jahr zu Jahr steigenden Morbidität und Mortalität hat auch weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wenn es darum geht, wirksame pflanzliche Therapien zu finden, die über herkömmliche Behandlungen hinausgehen 4,5. Vielversprechend ist, dass eine große Anzahl von.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Sichuan (120025) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1% Penicillin/StreptomycinHyCloneSV30010
AKT AntikörperImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI KitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatischer Mikroplatten-ReaderMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax AntikörperCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA-KitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 AntikörperCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim-Antikörper-Zellsignaltechnologie, Inc.#2933
Ca2+– ATPase Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Zellzählkit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Zellzyklus-FärbekitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
gespaltene Caspase-3-Zell-Signaltechnologie, Inc.#9661
gespaltene Caspase-7-Zell-Signaltechnologie, Inc.#8438
gespaltene Caspase-9-Zell-Signaltechnologie, Inc.#20750
Kristallviolette LösungBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM Kulturmedium mit hohem GlukosegehaltServicebio Technology Co., Ltd.G4510
DoxorubicinhydrochloridMedChemExpressHY-15142
ECL ChemilumineszenzlösungBiosharp Life SciencesBL520B
Fötales RinderserumProcell Life Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.164210
DurchflusszytometerBDFACSCanto figure-materials-1
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 AntikörperImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Ziege Anti-Kaninchen IgG SekundärantikörperMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism SoftwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1&alpha AntikörperAffinity BiosciencesBF8002
Humane Brustkrebs-Zelllinie MCF-7Procell Life Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.CL-0149
LadepufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 
mTOR-AntikörperServicebio Technology Co., Ltd.
Na+– K+– ATPase Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optisches MikroskopOlympusIX71PH
p-AKT AntikörperImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K AntikörperServicebio Technology Co., Ltd.
p-PI3K AntikörperAffinity BiosciencesAF3241
Quantitatives Western-Blot-BildgebungssystemTouch Image ProeBlot
Reverse Transkription Erststrang-cDNA-SynthesekitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS Assay KitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA Fluoreszenzsonde ist hier enthalten
SalidrosidChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE BausatzServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Gesamt-RNA-IsolationskitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-AktinAffinity BiosciencesAF7018
356234GB11405GB11525

Referenzen

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  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al.

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Schlagwörter

Wirkung von SalidrosidMCF 7 ZellenBrustkrebsZellmigrationPI3K AKT SignalwegZellapoptoseWestern BlotDurchflusszytometrieqRT PCR

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