Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung beim Verständnis der Ursachen der weiblichen Unfruchtbarkeit besteht darin, die Mechanismen aufzuklären, die die Entwicklung weiblicher Keimzellen, der sogenannten Eizellen, steuern. Ihre Entwicklung ist durch Zellwachstum und anschließende Teilungen gekennzeichnet, zwei kritische Phasen, die die Eizelle auf die Fusion mit Spermien vorbereiten, um die Embryogenese einzuleiten. Während des Wachstums reorganisieren Eizellen ihr Zytoplasma, um den Zellkern im Zellzentrum zu positionieren, ein Ereignis, das die erfolgreiche Entwicklung der Eizellen bei Mäusen und Menschen und damit ihr embryogenes Potenzial vorhersagt. In Maus-Eizellen wurde gezeigt, dass diese zytoplasmatische Reorganisation durch das Zytoskelett angetrieben wird, dessen Aktivität mechanische Kräfte erzeugt, die den Zellkern bewegen, neu positionieren und durchdringen. Folglich stimmt diese Kraftübertragung von Zytoplasma zu Nukleoplasma die Dynamik von Kern-RNA-verarbeitenden Organellen, die als biomolekulare Kondensate bekannt sind, ab. Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um mit hoher zeitlicher Auflösung den Einfluss des Zytoskeletts auf den Zellkern über räumliche Skalen in Maus-Eizellen zu dokumentieren. Es beschreibt die Bildgebungs- und Bildanalyseschritte und -werkzeuge, die erforderlich sind, um i) die Zytoskelettaktivität im Zytoplasma der Eizelle, ii) die auf dem Zytoskelett basierende Agitation des Eizellkerns und iii) ihre Auswirkungen auf die biomolekulare Kondensatdynamik im Eizellnukleoplasma zu bewerten. Über die Biologie der Eizellen hinaus können die hier entwickelten Methoden für den Einsatz in somatischen Zellen angepasst werden, um die auf dem Zytoskelett basierende Abstimmung der Kerndynamik über Skalen hinweg in ähnlicher Weise zu adressieren.

Einleitung

Die Kernpositionierung ist für mehrere Zell- und Entwicklungsfunktionen unerlässlich 1,2,3,4,5. Weibliche Keimzellen von Säugetieren, die Eizellen genannt werden, bauen ihr Zytoplasma um, um den Zellkern im Zellzentrum zu positionieren, obwohl sie eine asymmetrische Größenteilung durchlaufen, die auf einer nachfolgenden Chromosomen-Off-Centering beruht⁶ (Abbildung 1). Diese Zentrierung des Zellkerns sagt eine erfolgreiche Eizellenentwicklung bei Mäusen und Menschen^{voraus 7,8} und damit ihr embryogenes Potenzial (Abbildung 1).

Der zytoplasmatische Umbau in Maus-Eizellen wird hauptsächlich durch das Aktomyosin-Zytoskelett⁹ angetrieben (Abbildung 2). Seine Aktivität erzeugt mechanische Kräfte, die den Kern¹⁰ bewegen, neu positionieren und durchdringen (Abbildung 2). Folglich stimmt diese Kraftübertragung von Zytoplasma zu Nukleoplasma die Dynamik von nuklearen Boten-RNA-verarbeitenden Organellen ab, die als Kernflecken¹¹ bezeichnet werden, eine von mehreren membranlosen Organellen im Zellkern, die als biomolekulare Kondensate^{bekannt sind 12,13,14,15,16} (Abbildung 2).

Die Live-Bildgebung war entscheidend für die Entschlüsselung der funktionellen Implikationen der nuklearen Bewegung. Filme der Kernmigration über Stunden sowie Filme mit hoher zeitlicher Auflösung des Aktinnetzes und des Bulk-Zytoplasmas trugen weitgehend zur Ausarbeitung eines theoretischen Modells für die Kernpositionierung bei, das verschiedene Zeitskalen miteinander verbindet⁹. Auch Filme mit hoher zeitlicher Auflösung des Zytoplasmas, des Kernumrisses und der Kernkomponenten wie Chromatin und Kernkondensate hoben die Rolle der zytoskelettbasierten Agitation des Zellkerns bei der RNA-Prozessierung und Genexpression in Maus-Eizellen hervor und überbrückten verschiedene raumzeitliche Skalen innerhalb der Zelle^10,11. Insgesamt lieferte ein solcher skalenübergreifender Ansatz, der auf Live-Bildgebung basiert, die erste Begründung, die die Bewegung des Zellskeletts des Zellkerns mit dem Entwicklungserfolg von Eizellen in Verbindung bringt.

Das Protokoll stellt die Bildgebungs- und Bildanalyse-Pipeline bereit, mit der die Übertragung zytoplasmatischer Kräfte (hauptsächlich durch F-Aktin und teilweise durch Mikrotubuli erzeugt) auf den Zellkern und seine internen Komponenten in Maus-Eizellen untersucht wird. Das Ergebnis dieser Experimente besteht darin, das Kontinuum der Kräfte über räumliche Skalen hinweg zu erfassen, vom Zytoskelett im Zytoplasma bis zum Kerninneren über Filme mit hoher zeitlicher Auflösung, wie in zwei neueren Studien^{gezeigt 10,11}, die den Zusammenhang zwischen zytoplasmatischen aktiven Bewegungen, Fluktuationen des Kernumrisses sowie Bewegungs- und Oberflächenfluktuationen eines einzigen Typs von biomolekularen Kernkondensaten herstellten: nukleare Flecken. Derselbe Ansatz kann auf andere Modellsysteme angewendet werden, bei denen erwartet wird, dass sich die zytoplasmatischen Kräfte ändern, z. B. im Zusammenhang mit bösartigen Krebszellen¹⁷.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt und vom französischen Landwirtschaftsministerium (Genehmigung Nr. 75-1170) und von der Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GVO-Vertragsnummer DUO-5291). Die Mäuse wurden in der Tieranlage in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit einer Umgebungstemperatur von 22-24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40%-50% untergebracht. Zu den hier verwendeten Mäusen gehören weibliche OF1 (Oncins France 1, 8 bis 12 Wochen alt) und weibliche C57BL/6 (10 bis 14 Wochen alt).

1. Eizellentnahme und -aufbereitung

1. Sammeln Sie Eizellen von 8 bis 14 Wochen alten Mäusen, wie in¹⁸ und¹⁹ beschrieben.
   1. Kurz gesagt, extrahieren Sie zuerst Eierstöcke von Mäusen wie in¹⁸ in vorgewärmtes (37 °C) M2+Rinderserumalbumin (BSA)-Medium, das mit 1 μM Milrinon¹⁹ ergänzt wird, das die Wiederaufnahme der Meiose in Eizellen verhindert.
   2. Punktion der Eierstockfollikel mit chirurgischen Nadeln, um wachsende Eizellen aus den Antralfollikeln freizusetzen (Ende des Eizellwachstums²⁰).
   3. Sammeln Sie Eizellen der für Experimente erforderlichen Größe (wachsende und/oder ausgewachsene Eizellen) mit einer Mikropipette, die auf die Eizellentnahme spezialisiert ist, bevor Sie sie waschen und in Geschirr mit frischem Medium unter Mineralöl umfüllen.
2. Die Eizellen werden mechanisch von den antralen Follikelzellen durch Auf- und Abpipettieren dissoziiert und 1 h im Inkubator bei 37 °C stabilisiert, bevor mit den nachfolgenden Versuchsschritten fortgefahren wird.
   HINWEIS: Die Eizellen werden während aller Versuchsschritte bei 37 °C gehalten. Für dieses Protokoll wurden die größten Eizellen, also die ausgewachsenen, gesammelt.

2. Mikroinjektion von Eizellen

HINWEIS: Um die zytoskelettbasierte Aktivität im Zytoplasma zu erfassen, wird Hellfeld-Live-Bildgebung verwendet. Eine Mikroinjektion von Fluoreszenzmarkern ist daher nicht erforderlich, und das Protokoll kann bei Schritt 3 fortgesetzt werden. Um den nuklearen Umriss abzubilden, wurde Rango, eine Sonde mit YFP-Tag an seinem N-Terminus und einem CFP-Tag an seinem C-Terminus^21,22, verwendet. Wenn es in Eizellen bei 488 nm abgebildet wird, markiert es den gesamten Zellkern, mit Ausnahme des Nukleolus²³, und zeigt einen sehr scharfen Kernumriss. Um nukleäre Speckles sichtbar zu machen, wurde SRSF2-GFP (NM_011358), ein Marker für nukleäre Speckles¹¹, verwendet. Das gleiche Medium wird für die Eizellentnahme, die Mikroinjektion, die komplementäre RNA-Translation und die Bildgebung lebender Zellen verwendet.

1. Linearisieren Sie Rango-Plasmid mit SfiI- oder SRSF2-GFP-Plasmid mit AgeI-Restriktionsenzymen.
2. Synthetisieren Sie gedeckelte komplementäre RNAs (cRNA) mit dem entsprechenden In-vitro-Transkriptionskit entsprechend dem Promotor (T3 für Rango und T7 für SRSF2-GFP) und reinigen Sie sie mit einem Säulenreinigungskit, wie zuvor beschrieben²⁴.
   HINWEIS: Polyadenylat SRSF2-GFP-RNA unter Verwendung eines Polyadenylierungskits zur Erhöhung der cRNA-Stabilität. Aufgrund von Unterschieden im Plasmidrückgrat werden zwei verschiedene Promotoren verwendet.
3. Messen Sie die cRNA-Konzentrationen mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer.
4. Verdünnen Sie Rango-cRNA auf 1000 ng/μl und SRSF2-GFP-cRNA auf 600 ng/μl in dH₂O.
5. cRNA-Aliquot bei 4 °C für mindestens 60 min bei 25.000 x g vor der Mikroinjektion zentrifugieren.
6. cRNAs, die für YFP-Rango oder SRSF2-GFP kodieren, wie in^11,25 beschrieben, werden mit einem Mikroinjektor in 37 °C M2+ BSA+Milrinon-Medium in das Zytoplasma von Eizellen injiziert.
7. Inkubieren Sie die Eizellen mindestens 2 h lang in Kulturmedium bei 37 °C für die cRNA-Translation.
8. Legen Sie die Eizellen in kleine (5 μl) Nährmediumtröpfchen auf einer 35-mm-Gewebekulturschale mit mit Mineralöl bedecktem Deckglasboden ab. Legen Sie eine Eizelle pro Tröpfchen, um ein Photobleichen benachbarter Eizellen zu vermeiden.

3. Lebendzell-Bildgebung

HINWEIS: Lebende Maus-Eizellen wurden mit einem inversen konfokalen Mikroskop untersucht, das mit einem Plan-APO 40x/1,25 NA Ölimmersionsobjektiv, einem motorisierten Scanning-Deck, einer Inkubationskammer (37 °C), einer an ein Filterrad gekoppelten CCD-Kamera und einer rotierenden Scheibe ausgestattet war. Bilder mit hoher zeitlicher Auflösung werden mit Metamorph (im Folgenden als Bildgebungssoftware bezeichnet) im Stream-Erfassungsmodus aufgenommen.

1. Öffnen Sie das Acquire-Fenster der Imaging-Software.
2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 500 ms, den Kamerabereich auf Full Chip und das Binning auf 1.
3. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassen " die Beleuchtung für den gewünschten Kanal ein. Um die zytoplasmatische Aktivität abzubilden, beleuchten Sie die Eizellen mit Durchlicht. Um den mit YFP-Rango oder SRSF2-GFP markierten Zellkern abzubilden, beleuchten Sie Eizellen mit einer Anregungswellenlänge von 491 nm.
4. Konzentrieren Sie sich bei zytoplasmatischen Rühr- oder YFP-Rango-Experimenten auf den Eizellnukleolus, der mit Durchlicht leicht beobachtet werden kann (Abbildung 3A). Ein einzelnes Flugzeug wird erworben. Konzentrieren Sie sich bei Kernspeckle-Experimenten auf SRSF2-GFP-Tröpfchen (Abbildung 3C).
5. Stellen Sie auf der Registerkarte Spezial die Parameter ein, um die Erfassungsgeschwindigkeit wie folgt zu optimieren.
   Kameraverschluss: Offen für die Belichtung
   Clear-Modus: CLEAR PRESEQUENCE
6. Öffnen Sie das Fenster Stream Acquisition der Imaging-Software. Legen Sie die Streamingparameter entsprechend dem Experiment fest. Für beide Studien ^10,11 sind die unten beschriebenen Parameter zu verwenden.
   1. Legen Sie auf der Registerkarte "Erfassen " die folgenden Parameter fest.
      Aufnahmemodus: In RAM streamen
      Anzahl der Bilder: 480 (kann auf 240 Bilder verringert werden, um die Bildzeit zu verkürzen)
      Kameraparameter: Bilder mit Bildrate aufnehmen
      Anzahl (Nb) der zu überspringenden Frames: 0
   2. Legen Sie auf der Registerkarte Parameter des Digitalkamera-Controllers die folgenden Parameter fest.
      Kamerastatus: HALT
      Verschlussmodus: NIE ÖFFNEN
      Clear-Modus: CLEAR PRESEQUENCE
      Anzahl der durchschnittlichen Frames: 1
      HINWEIS 1: Im Stream-Modus wird die Filmdauer nach dem Einstellen der Belichtungszeit durch die Anzahl der Bilder bestimmt. Beispiel: 500 ms Belichtungszeit und 480 Bilder erzeugen einen Film von 4 min. Während der Bildaufnahme kann eine Vorschau angezeigt werden.
7. Passen Sie einen Interessenbereich (ROI) um das Objekt an. Die Minimierung des ROI-Bereichs verkürzt die Erfassungszeit.
8. Klicken Sie im Fenster Stream Acquisition auf Erfassen, um den Film zu starten.
9. Speichern Sie den Film am Ende der Aufnahme als .tif Datei.
   HINWEIS: Um Kernstrukturen bei Filmen mit hoher zeitlicher Auflösung zu verfolgen, sollten Kernsonden (YFP-Rango und SRSF2-GFP) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, um die Segmentierung der Objekte während der weiteren Schritte der Bildanalyse zu erleichtern. Exogene SRSF2-GFP-Expressionsprofile sollten mit endogenen Immunfärbungen von Kernspeckles vergleichbar sein (Abbildung 3C-D). Veränderungen der SRSF2-GFP-Expressionsprofile im Vergleich zur endogenen Färbung können hohe Dosen von cRNA-Injektion und -Translation widerspiegeln²⁶ (Abbildung 3C-D).

4. Bildanalyse: Zytoplasmatisches Rühren

HINWEIS: Die zytoplasmatische Bewegung, die die Intensität der aktinbasierten Zytoskelettaktivität in Eizellen widerspiegelt, wird durch Bildkorrelationsanalysen unter Verwendung einer Software aus einer früheren Veröffentlichung des Labors⁹ bestimmt, die unter²⁷ verfügbar ist. Die Software misst, wie viel Pixelintensität zwischen aufeinanderfolgenden Bildern erhalten bleibt. Das Ergebnis ist der Verlust der Korrelation zwischen Bildern in der Zeit, beginnend bei 1 und exponentiell abnehmend mit der Zeit, wie in⁹.

1. Richten Sie rohe Zeitrafferbilder (Δt = 0,5 s) mit dem Fiji StackReg-Plugin (Plugins>StackReg) aus. Um das Plugin StackReg²⁸ zu installieren, aktivieren Sie die BIG-EPFL-Update-Site²⁹ , um Zugriff auf das Plugin zu erhalten.
2. Berechnen Sie Hellfeld-Bildkorrelationen in 3 bis 4 zytoplasmatischen Regionen von ~300^{μm 2} mit den folgenden Schritten.
   1. Schneiden Sie die Regionen zu und speichern Sie sie als separate Filmdateien. Öffnen Sie das Terminalfenster.
   2. Geben Sie oocyte ein, drücken Sie die Leertaste und drücken Sie dann die Eingabetaste. Ein Fenster mit dem Namen Signal und Slot wird angezeigt. Wählen Sie die zugeschnittenen Filmdateien aus, die analysiert werden sollen.
      HINWEIS: Es können mehrere Filme gleichzeitig ausgewählt werden.
3. Die Anwendung gibt Dateien im selben Ordner wie die Filme zurück. Es werden drei verschiedene Dateien mit .csv-, .eps- und .xls-Erweiterungen generiert. Die .xls Datei enthält die Daten zum Zeichnen der Korrelationsdiagramme für eine Region. Durchschnittliche Korrelationswerte aus verschiedenen Regionen innerhalb einer Zelle.
4. Transformieren Sie aus Gründen der visuellen Übersichtlichkeit die endgültigen Korrelationswerte, indem Sie den Wert jedes Zeitpunkts von 1 subtrahieren, um eine invertierte exponentielle Kurve wie in ¹¹ zu erhalten.

5. Bildanalyse: Zytoplasmatische Vektorkarten

HINWEIS: Zytoplasmatische Vektorkarten von Maus-Eizellen wurden mit dem Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)-Plugin³⁰ erzeugt, das zuvor zum Nachweis zytoplasmatischer Flüsse in Maus-Eizellen³¹ auf Fidschi ³² implementiert wurde und auf ³³ verfügbar ist. Die Karten zeigen die Größe und Richtung der zytoplasmatischen Strömungsgeschwindigkeit, wie in⁹ und¹¹.

1. Konvertieren Sie Hellfeld-Zeitrafferbilder (Δt = 0,5 s) in das 32-Bit-Format.
2. Richten Sie Bilder mit dem Fiji StackReg-Plugin in Plugins > StackReg neu aus und wählen Sie Rigid Body Transformation aus.
3. Mit dem Plugin-Stack subtract moving average jru v2 (in den Detrend-Tools der STICS-Plugin-Suite) entfernen Sie stationäre Strukturen im Film, indem Sie das zeitlich gemittelte Bild des Films subtrahieren. Kontrollkästchen Statischen Durchschnitt subtrahieren und Teilstapel ausgeben, wählen Sie Räumlichen Durchschnitt beibehalten und Periode auf 5 setzen.
4. Zeichnen Sie einen ROI um die Eizelle herum, ohne den Kortex, um Randeffekte des Plugins zu vermeiden.
5. Starten Sie das STICS-Karten-jru V2-Plugin (in ICS-Tools) mit einer Unterbereichsgröße von 32 Pixeln, einer Schrittgröße von 16 Pixeln, einer zeitlichen STICS-Verschiebung von 3, X- und Y-Offsets von 0, einem Geschwindigkeitsmultiplikator von 8, einem Schwellenwert von 0 und den Kontrollkästchen " Vektorlänge normalisieren", "Vektoren zentrieren", "Ausgabegeschwindigkeiten" und "Filmmaske verwenden".
   HINWEIS: Das Plugin generiert eine Karte der Eizelle im .tif-Format, die zytoplasmatische Flüsse als Vektoren mit Farben anzeigt, die Flussamplituden anzeigen, wie in⁹ und¹¹, und eine Excel-Datei mit gemessenen Flussgeschwindigkeiten.

6. Bildanalyse: Schwankungen der Kernumrisse

ANMERKUNG: Nukleare Umrissfluktuationen, die die Bewegung der Kernmembran widerspiegeln, können aus Filmen von Kernen bestimmt werden, die mit YFP-Rango markiert wurden (Abbildung 4A, C). Die Bildanalyse für nukleare Umrissschwankungen erfordert Fiji und die Installation der Plugins StackReg (aktivieren Sie die BIG-EPFL-Update-Site²⁹ , um Zugriff auf das StackReg-Plugin zu erhalten), PureDenoise³⁴ und Ovocyte_nucleus. Das StackReg-Plugin führt eine Bildregistrierung durch, um mögliche globale Bewegungen zu korrigieren. Das PureDenoise-Plugin entfernt das Rauschen von mehrdimensionalen Bildern, die durch gemischtes Poisson-Gauß-Rauschen beschädigt wurden, und glättet die nuklearen Umrisse. Das Ovocyte_nucleus-Plugin schwellt das Signal und füllt das Loch, das dem Nukleolus entspricht, um eine binäre Kernmaske zu erstellen, sie mit StackReg neu auszurichten und den Abstand r vom Schwerpunkt der Kernmaske zum Umfang der Maske für alle θ-Winkel zu berechnen (θ° von 0° bis 360° in 1°-Schritten), wie in Abbildung 4. Alle Codes für diese Plugins finden Sie unter ³⁵.

1. Wählen Sie auf Fidschi im Menü Plugins > CIRB > Verlhac die Option Ovocyte Nucleus Shape aus.
2. Führen Sie im Dialogfeld die folgende Auswahl durch.
   1. Wählen Sie den Ordner aus, der die zu analysierenden Filme enthält.
   2. Wählen Sie den θ-Winkel (ein Wert von 1° bis 360° kann gewählt werden und ein Wert von 1° wurde für eine optimale Umrissauflösung verwendet), die Ränder für das Zuschneiden (5 μm werden empfohlen, um den gesamten Kern zu erhalten).
   3. Wählen Sie die XY-Kalibrierung und das Zeitintervall aus. Klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Ergebnisse werden als .xls Dateien in einem Ausgangsordner in dem Ordner bereitgestellt, der die Originalfilme enthält. Diese Datei zeigt alle gemessenen Radien r für jede Zeit t und jeden Winkel θ an. Ein Beispiel für eine Ausgabedatei finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Der Ordner out enthält auch einen Film der Kernmaske.
3. Berechnen Sie mit Hilfe einer Tabelle den mittleren Radius R über alle Zeitpunkte t für jeden definierten θ-Winkel. Dies ermöglicht es, die mittlere Form über die Zeit darzustellen (Abbildung 4B). Siehe Beispiel in der ergänzenden Tabelle 2.
4. Subtrahieren Sie für jedes t und θ den mittleren Radius R über die Zeit vom Radius r. Die Varianz (r-R)² ist ein Maß für die Schwankungen der Kernhülle.
5. Berechnen Sie den Mittelwert der Fluktuationen für alle Zeitpunkte t und alle Winkel θ für jeden Kern und schließlich für alle Kerne aus einer Bedingung.
   HINWEIS: Wenn die Form von Kernen signifikant verändert ist, wie z. B. im Fall eines gestörten Zytoskeletts, werden mit YFP-Rango markierte Kerne auf Fidschi gedreht, um den glatten Teil nach oben und die Einstülpung nach unten auszurichten, bevor mit der Analyse der Kernumrissfluktuationen fortgefahren wird, wie in¹⁰.

7. Bildanalyse: Nukleare Speckle-Bewegungen (diffusive Dynamik)

HINWEIS: Die Analyse der nuklearen Speckle-Bewegung ermöglicht es, die Art der Dynamik (getrieben, diffusiv oder begrenzt) dieser Organellen aus ihren Spuren abzuleiten.

1. Wählen Sie Bilder im Stream-Modus von Eizellen aus, die SRSF2-GFP-Tröpfchen exprimieren, die sich hauptsächlich in der X-Y-Achse bewegen.
2. Korrektur für das Bleaching von Zeitrafferbildern von Eizellen, die SRSF2-GFP exprimieren, unter Verwendung der Histogramm-Matching-Methode in Fidschi (Bild > Adjust > Bleach Correction).
3. Richten Sie Bilder mit dem Fiji StackReg-Plugin neu aus.
4. Verfolgen Sie SRSF2-GFP-Tröpfchenzentren mit dem Fiji Manual Tracking-Plugin (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Drücken Sie Track hinzufügen , um die Verfolgung zu starten, und drücken Sie End Track , wenn Sie fertig sind. Aktivieren Sie nicht die Zentrierkorrektur.
5. Kopieren Sie Tracks in eine Tabellenkalkulationsdatei, um mit der Berechnung der zeitlichen mittleren quadratischen Verschiebungen (MSD) wie in ¹¹ fortzufahren, und berechnen Sie zeitliche MSDs aus den Tröpfchentrajektorien von jeweils 20 s.
6. Passen Sie Kurven (msd(t) = beta x t^α) mit der Nelder-Mead-Methode unter Verwendung der R-Software an, um den Diffusionsexponenten alpha (α) zu schätzen.
7. Messen Sie den effektiven Diffusionskoeffizienten, um die verschiedenen Bedingungen vergleichen zu können, da die Diffusion voraussichtlich anomal ist (α< 1).
8. Berechnen Sie den effektiven Diffusionskoeffizienten D_eff aus einer linearen Anpassung (alpha=1) an den 40 ersten Punkten (20 s) der zeitlichen MSD-Kurve und normalisieren Sie ihn nach Tröpfchengröße (D_eff in μm²/s x 3/2 πr in μm).

8. Bildanalyse: Nukleare Speckle-Oberflächenfluktuationen

HINWEIS: Die Entwicklung der Kernfleckenkontur im Laufe der Zeit, ein Auslesen der aktiven Kraftübertragung auf diese Organellen, wurde mit einem speziell angefertigten Plugin Radioak³⁶ für den Einsatz in Fidschi gemessen und ist auf³⁷ verfügbar. Das Plugin extrahiert die Werte der Radien einer bestimmten Auswahl für alle Winkel um den Auswahlmittelpunkt. Die Formvariation im Laufe der Zeit wurde gemessen, indem der Wert des Radius relativ zu seinem Durchschnittswert für jeden Winkel verglichen wurde. Das Plugin ermöglicht es, die Formschwankungen zu quantifizieren und bietet die Möglichkeit, diese Dynamiken zu visualisieren. Um es zu installieren, laden Sie die Radioak_.jar-Datei herunter und legen Sie sie im Plugins-Ordner von Fiji ab. Starten Sie Fidschi neu. Dieses Plugin ist eine aktualisierte Version des Plugins, das verwendet wird, um die oben genannten Schwankungen der nuklearen Umrisse zu analysieren und eine vergleichbare Pipeline zu implementieren.

1. Wählen Sie in Stream-Filmen von SRSF2-GFP-Tröpfchen größere Tröpfchen vergleichbarer Größe (Radius ~2,5 μm) aus.
   HINWEIS: Wenn die Tröpfchen zu klein sind, führt eine unzureichende Auflösung zu abweichenden Oberflächenfluktuationsmessungen.
2. Schneiden Sie Zeitrafferbilder von Tröpfchen zu, die sich über 15 s erstrecken (Δt = 0,5 s), indem Sie ein Rechteck um das Tröpfchen zeichnen und Bild > Zuschneiden auswählen (Abbildung 5).
3. Richten Sie Bilder mit dem Fiji StackReg-Plugin in Plugins > StackReg neu aus und wählen Sie Rigid Body Transformation aus.
4. Glätten Sie das Bild, um Rauschen um das Tröpfchen herum zu entfernen, indem Sie die Option "Fiji glätten" unter "Prozess" verwenden.
5. Erstellen Sie eine binäre Tröpfchenmaske mit der Option In Maske konvertieren in Fidschi unter Prozess > Binärdatei. Verwenden Sie die Standardmethode und Dark für den Hintergrund (Abbildung 5).
6. Analysieren Sie die generierte binäre Tröpfchenmaske mit der Option Partikel analysieren in Fidschi unter Analysieren, wählen Sie Ergebnisse löschen und Zum Manager hinzufügen Optionen und speichern Sie den Interessenbereich (ROIs) im RoiManager (More > Save) im ZIP-Format, um von Radioak gelesen zu werden. Die ROIs müssen in einem Ordner namens contours im selben Ordner wie die Filme gespeichert werden, in Dateien namens imagename_UnetCortex.zip für jeden Film, der von Radioak gefunden werden soll.
7. Wählen Sie im Menü Fiji Plugins > CIRB > Radioak entweder Radien abrufen , um nur einen Film zu verarbeiten, oder Einen Ordner erstellen , um alle Filme desselben Ordners zu analysieren.
   HINWEIS: Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie die Winkelnummer und den Maßstab auswählen können. Radioak wurde mit 1°-Winkelschritten von 0° bis 360° (Eingabe von 360) gestartet und die Radienwerte extrahiert.
8. Wählen Sie den Film oder den Ordner aus, der die zu analysierenden Filme enthält. Die Ergebnisse werden als .xls Dateien (eine für jeden Film) in einem Radioakres-Verzeichnis in dem Ordner bereitgestellt, der die Originalfilme enthält. Jede Datei zeigt alle gemessenen Radien r (in μm, wenn der Skalenparameter ausgefüllt wurde) für jede Zeit t (in Scheibe) und jeden Winkel (im Bogenmaß; Abbildung 5; siehe Beispiel für .xls Ausgabe in der ergänzenden Tabelle 3).
9. Berechnen Sie in der Tabelle den mittleren Radius R über alle Zeitpunkte t für jeden definierten Winkel (siehe Beispiel in der ergänzenden Tabelle 4). Dies ermöglicht es, die mittlere Form über die Zeit darzustellen.
10. Zeichnen Sie die Varianz (r-R)² in μm² auf, die dem Maß für die Fluktuationen der Tröpfchenoberfläche entspricht.

Ergebnisse

Die Bildtafeln in Abbildung 3 zeigen Beispiele einer typischen ausgewachsenen Eizelle (Abbildung 3A), das Nukleoplasma in einer ausgewachsenen Eizelle, das YFP-Rango exprimiert (Abbildung 3B), das Nukleoplasma in einer ausgewachsenen Eizelle, das ein korrektes (linkes Bild; Abbildung 3C) oder ein exzessives (rechtes Feld; Abbildung 3C) Dosis von SRSF2-GFP-cRNA und eine Immunfärbung von Kernflecken in einer ausgewachsenen Eizelle mit dem SC35-Antikörper (Abbildung 3D). Die richtige Dosis von SRSF2-GFP-cRNA für die Mikroinjektion wurde auf der Grundlage visueller Vergleiche zwischen Expressionsprofilen von SRSF2-GFP und endogenen Profilen von Kernspeckles definiert.

Zytoplasmatische Rührkräfte in Eizellen, wie frühere Arbeiten aus dem Labor mit STICS-Vektorkarten und Bildkorrelationsanalysen (siehe⁹ und¹¹) gezeigt haben, können durch zytoskelettale Störungen verringert werden, sowohl genetische (z. B. FMN2-mutierte Maus) als auch chemische (z. B. Cytochalasin D). STICS-Karten von Kontroll-Eizellen zeigen zahlreiche Vektoren, wobei Farben hohe Flussgeschwindigkeiten anzeigen, während Karten von Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften weniger Vektoren zeigen, wobei Farben niedrige Flussgeschwindigkeiten anzeigen. In ähnlicher Weise geht die Bildkorrelation in Kontrolleizellen im Vergleich zu Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften sehr schnell verloren. Dies ist auf Korrelationskurven zu beobachten, mit einer schnelleren Abnahme der Kurve für Kontrolleizellen im Vergleich zu Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften⁹ oder einem schnelleren Anstieg, wenn die Kurve invertiert wird¹¹.

Zytoskelettkräfte bewegen den Kern und seine inneren Organellen, insbesondere Kernkondensate wie Kernflecken^10,11. In Abbildung 4A ist der Kern der Kontrolleizellen wichtigen peripheren Fluktuationen ausgesetzt, die mit der Kernsonde YFP-Rango sichtbar sind. Die Kernform in Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften ist im Laufe der Zeit stabil (Abbildung 4C). Die Analyse der Schwankungen der Kernumrisse ist der Schlüssel zur genauen Quantifizierung der Bewegung. Durch die Bestimmung der Varianz des Abstands vom Kernschwerpunkt zu seiner Peripherie (r-R)² (Abbildung 4B) konnten Fluktuationen quantifiziert werden, die zeigten, dass die Kernbewegung in Kontroll-Eizellen 6-mal höher ist als in Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften¹⁰. In Abbildung 5A-B sind Kernspeckles (SRSF2-GFP⁺-Tröpfchen) in Kontroll- und gestörten Kontexten zytoplasmatischer Kräfte mit hoher zeitlicher Auflösung dargestellt. In Kontrollen schwankt die Tröpfchenoberfläche signifikant stärker als Tröpfchenoberflächen in Eizellen mit gestörten zytoplasmatischen Kräften, was mit dem Radioak^32-Plugin visualisiert und quantifiziert werden kann. Visuell zeigen grüne und rote Farben (Radioak-Ausgabe auf den unteren Bildern von Abbildung 5A-B) Winkel an, in denen das Plugin Oberflächenveränderungen zwischen aufeinanderfolgenden Bildern erkannt hat, und Weiß zeigt ein Fehlen von Oberflächenveränderungen an.

Abbildung 1: Illustration der späten Mausoogenese und der frühen Embryogenese. Abbildung der Kernzentrierung, die im späten Eizellenwachstum, der Chromosomen-Off-Zentrierung, die während der Eizellteilung auftritt, und der frühen Schritte (1-Zell- und 2-Zell-Stadien) der Embryogenese. Die weiblichen Genome (Eizellkern und weiblicher Vorkern) sind rosa, der männliche Vorkern blau. Die Embryokerne (nach Fusion der elterlichen Genome) sind violett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Illustration des zytoplasmatischen und nuklearen Umbaus über Skalen hinweg in wachsenden Maus-Eizellen. Diese Abbildung fasst die wichtigsten Ergebnisse von ^9,10,11 zusammen. Illustration des Aktomyosin-basierten Remodells des Zytoplasmas, der Kernbewegung und des funktionellen nuklearen biomolekularen Kondensatumbaus über raumzeitliche Skalen. Der skalenübergreifende Umbau von Kernspeckles verbessert biomolekulare Reaktionen, die mit ihrer Funktion verbunden sind (d. h. das Spleißen von prä-mRNA). Beachten Sie, dass dieses Protokoll die Beurteilung der Kernbewegung nur über räumliche, aber nicht über zeitliche Skalen ermöglicht, da alle Bildgebungen mit der gleichen zeitlichen Auflösung von 0,5 s zwischen den Bildbildern durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispielbilder der ausgewachsenen Eizelle und des Nukleoplasmas. (A) Hellfeldbild einer ausgewachsenen Eizelle mit Chromatin (Cyan), das den Nukleolus umgibt. Ein gepunkteter weißer Kreis umreißt den Kern. (B) lebender Eizellkern, der YFP-Rango exprimiert; Beachten Sie das Fehlen von Fluoreszenz im Nukleolus. (C) Beispiel für einen lebenden Eizellkern, der SRSF2-GFP nach Mikroinjektion korrekter cRNA-Dosen (linkes Bild) oder hoher cRNA-Dosen (rechtes Bild) exprimiert; Beachten Sie die kondensierten (Tröpfchen) und gelösten Phasen auf der linken Seite und deren Abwesenheit im Zustand auf der rechten Seite. (D) Immunfärbung durch Kernspeckle in einer fixierten Eizelle; Beachten Sie das endogene Expressionsprofil, das mit dem in C (linkes Feld) vergleichbar ist. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Plugin-Ausgaben von Kontroll- und gestörten Kernumrissfluktuationen. (A) Zeitraffer eines Kontroll-Oozytenkerns, der YFP-Rango exprimiert (oben) und der entsprechenden binären Maske, die vom Ovocyte_nucleus-Plugin erzeugt wurde (unten). (B) Prinzip der Kernumrissfluktuationen, Messungen über die Zeit und in eine bestimmte Richtung. Die Richtungen werden durch einen Drehwinkel θ von 1° in Schritten von 0° bis 360° definiert. Es werden zwei repräsentative Formen bei t=0 s (gelb) und t=135 s (violett) dargestellt. Die blaue Form entspricht der mittleren Form über die Zeit. (C) Kernumrissschwankungen eines Zellkerns in einer Eizelle mit verminderten Zytoskelettkräften aufgrund einer Störung sowohl von F-Aktin (FMN2-mutierte Maus) als auch von Mikrotubuli (Nocodazol-Behandlung; wie in¹⁰). Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Plugin-Ausgaben der Kontroll- und gestörten Tröpfchenoberflächenfluktuationen. (A) Ausschnitt eines SRSF2-GFP-Kerntröpfchens, abgebildet mit 500 ms pro Frame und in der Ice Look Up Table (LUT) (oben) dargestellt; binäre Maske des gleichen Tröpfchens, das von Fidschi erzeugt wurde (Mitte); und Radioak-Plugin-Ausgänge nach der Analyse der Oberflächenfluktuationen des Tropfens (unten), wobei Grün und Rot Winkel anzeigen, in denen das Plugin Oberflächenveränderungen zwischen aufeinanderfolgenden Bildern erkannt hat, und Weiß, das auf fehlende Oberflächenveränderungen hinweist. (B) Oberflächenfluktuationen eines Kerntröpfchens in Eizellen mit verminderten Zytoskelettkräften aufgrund der Störung sowohl von F-Aktin als auch von Mikrotubuli (wie in¹¹). Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispiel für Ovocyte_nucleus Ausgabe der Plugin-Analyse. Derselbe Zellkern, der wie in Abbildung 4A dargestellt ist. Theta (θ) ist der Winkel in Grad und t1 bis t600 entsprechen der Bildnummer, die zeitlich umgerechnet werden kann. Die Radien sind in μm angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Beispieltabelle zur Berechnung der Schwankungen der Kernumrisse. Derselbe Zellkern, der wie in Abbildung 4A dargestellt ist. Theta (θ) ist der Winkel in Grad und t1 bis t600 entsprechen der Bildnummer, die zeitlich umgerechnet werden kann. Tab Raw und Durchschnitt: Die Radien sind in μm angegeben. Tab r-R: Die r-R-Abstände sind in μm angegeben. Tabelle (r-R)²: Die Schwankungswerte sind in^{μm 2} angegeben. Die Registerkarten x und y entsprechen den kartesischen Koordinaten der Radien aus der Registerkarte Roh und Durchschnitt. Sie ermöglichen es, die mittlere Form des Kerns im Laufe der Zeit auf der Registerkarte "Mittelform" zu zeichnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Beispiel für die Ausgabe der Radioak-Plugin-Analyse. Derselbe Tröpfchen, der wie in Abbildung 5A dargestellt ist. Die gemessenen Radien zu verschiedenen Zeitpunkten und Winkeln werden angezeigt. Die Radien sind in μm angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Beispieltabelle zur Berechnung der Oberflächenfluktuationen von Kerntröpfchen. Derselbe Tröpfchen, der wie in Abbildung 5A dargestellt ist. Theta (θ) ist der Winkel in Grad und t1 bis t600 entsprechen der Bildnummer, die zeitlich umgerechnet werden kann. Tab Raw und Durchschnitt: Die Radien sind in μm angegeben. Tab r-R: Die r-R-Abstände sind in μm angegeben. Tabelle (r-R)²: Die Schwankungswerte sind in^{μm 2} angegeben. Die Tabs x und y entsprechen den kartesischen Koordinaten der Radien aus dem Reiter Raw und Durchschnitt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehören die ordnungsgemäße Mikroinjektion von Eizellen, ohne ihr Überleben oder ihre normale Funktion zu beeinträchtigen ^9,10,11, sowie die Mikroinjektion vordefinierter Mengen an cRNA, die eine korrekte Visualisierung relevanter Strukturen wie Kernflecken ermöglichen würden.

Die Verbindung zwischen zytoplasmatischer und (intra-)nukleärer Dynamik ist unerlässlich, um zu untersuchen, wie das Zytoskelett den Zellkern oder sein Inneres bewegt. Dieses Protokoll ermöglicht dies mit leichten Modifikationen, indem es die zytoplasmatischen Rührintensitäten mit der nuklearen YFP-Rango- oder SRSF2-GFP-Tröpfchendynamik korreliert (wie in¹¹). Um fortzufahren, sollten die Eizellen zunächst 120 s lang im Hellfeldmodus gefilmt werden, um zytoplasmatische Bewegungen einzufangen, bevor sie sofort 120 s lang mit einem 491-nm-Laser gefilmt werden, um die Kernkontur oder die Tröpfchendynamik zu erfassen. Im Falle von nukleären SRSF2-GFP-Tröpfchen kann die Korrelation einfach durch Vergleich ihrer effektiven Diffusionskoeffizienten (siehe Schritt 7 in diesem Protokoll) mit den invertierten maximalen Intensitätswerten des zytoplasmatischen Rührens bewertet werden, die mit Hilfe von Bildkorrelationsanalysen erhalten wurden (siehe Schritt 4 in diesem Protokoll). Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Größe der Kondensate, die für die Analyse von Tropfenoberflächenschwankungen gewählt werden. Tröpfchen mit ähnlichem Durchmesser sollten für vergleichende Analysen ausgewählt werden, um Verzerrungen zu vermeiden, da die Größe die Intensität der Oberflächenschwankungen moduliert.

Es gibt einige Einschränkungen für dieses Protokoll. Analysen von Fluktuationen des Kernumrisses beruhen auf einer vollständigen intranukleären Färbung wie YFP-Rango oder NLS-GFP. Bei Analysen an Kernspeckles kann die Mikroinjektion übermäßiger Mengen SRSF2-GFP-cRNA zu offensichtlichen Veränderungen der phasentrennenden Eigenschaften dieses Kondensatmarkers führen (Abbildung 3C), wie zuvor von anderen überprüft²⁶. Die Überprüfung, ob exogene Proteinexpressionsprofile mit den endogenen vergleichbar sind, ist daher von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus sollten relativ kleine Tröpfchen (<2 μm Radius) aufgrund von Einschränkungen der räumlichen Auflösung mit den hier definierten Werkzeugen von Oberflächenfluktuationsanalyse-Pipelines ausgeschlossen werden. Dieses Auflösungsproblem kann in der Regel durch den Einsatz von auflösenderen Mikroskopen gelöst werden, die beispielsweise erforderlich sein könnten, um Oberflächenschwankungen kleinerer Kondensate im Eizellkern oder im deutlich kleineren Kern somatischer Zellen zu untersuchen.

Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll die Erfassung von Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskelett-basierter Agitation des Maus-Eizellkerns über Skalen hinweg. Insbesondere ermöglicht es die Dokumentation der zytoskelettbasierten Mobilisierung des Zytoplasmas, der Kernumrissfluktuationen zusammen mit flüssigkeitsartigen Kernfleckenverschiebungen und Oberflächenfluktuationen. Obwohl einige Studien in anderen Zelltypen einige dieser Angelegenheiten 38,39,40 über unterschiedliche Protokolle unterschiedlicher Komplexität auf einzelnen räumlichen Skalen behandeln, bietet dieses einfache Protokoll die notwendigen Werkzeuge, um die erwähnte zelluläre Dynamik über mehrere Skalen hinweg in einer einzigen Arbeitspipeline zum ersten Mal anzugehen. Darüber hinaus ermöglichen die aus diesem Ansatz generierten Daten, wenn sie durch biophysikalische Modellierungen wie in^10,11 ergänzt werden, eine minimalinvasive Bewertung von: i) Veränderungen in der Kernmechanik¹⁰; ii) die Übertragung von Zytoskelett-basierten aktiven Kräften im Zytoplasma auf Kondensate im Zellkern¹¹; und iii) die Dissipation dieser aktiven Energie über verschiedene zelluläre Kompartimente^10,11. Wichtig ist, dass dieses Protokoll vielseitig ist, da es nicht nur an andere Kernkondensate wie den Nukleolus²³ angepasst werden kann, sondern auch an andere Zelltypen wie Krebszellen, bei denen Veränderungen sowohl im Verhalten des Zytoskeletts als auch des Kernkondensats dokumentiert wurden^17,41.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 Spinning Disk	Yokogawa
DMI6000B Mikroskop	Leica
Femtojet Mikroinjektor	Eppendorf
Fidschi
Filterrad	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph Software	Universelle Bildgebung		Version 7.7.9.0
Mineralöl	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 und C57BL/6 Mäuse	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing-Kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD-Kamera	QImaging
RNAeasy Bausatz	Qiagen	74104
SC35 Antikörper	Abcam	ab11826	Nukleärer Speckle-Antikörper; Maus IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP Plasmid &	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
-Mikropipette	XLAB Lösungen		spezialisiert auf die Eizellentnahme
T3 mNachricht mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mNachricht mMaschine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatkammer	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows