Methodenartikel

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

DOI:

10.3791/66078

⸱

13. Oktober 2023

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1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Zellsphäroide gelten als ein potenzielles Modell im Bereich biologischer Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur skalierbaren Erzeugung von Zellsphäroiden unter Verwendung eines 3D-Akustik-Assemblierungsgeräts, das eine effiziente Methode für die robuste und schnelle Herstellung einheitlicher Zellsphäroide bietet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellsphäroide sind vielversprechende dreidimensionale (3D) Modelle, die in vielen biologischen Bereichen breite Anwendung gefunden haben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von qualitativ hochwertigen Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung einer akustischen 3D-Montagevorrichtung durch manövrierfähige Verfahren dar. Die akustische Montagevorrichtung besteht aus drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene einer quadratischen Polymethylmethacrylat-Kammer (PMMA) angeordnet sind. Diese Konfiguration ermöglicht die Erzeugung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs), wenn drei Signale angelegt werden. Dadurch können Zellen in der Gelatinemethacryloyl-Lösung (GelMA) zu den LANs getrieben werden und gleichmäßige Zellaggregate in drei Dimensionen bilden. Die GelMA-Lösung wird dann UV-photogehärtet und vernetzt, um als Gerüst zu dienen, das das Wachstum von Zellaggregaten unterstützt. Abschließend werden Massen an gereiften Sphäroiden gewonnen und durch anschließendes Auflösen der GelMA-Gerüste unter milden Bedingungen gewonnen. Das vorgeschlagene neue akustische 3D-Zellassemblierungsgerät wird die Scale-up-Herstellung von Zellsphäroiden und sogar Organoiden ermöglichen und ein großes Technologiepotenzial im biologischen Bereich bieten.

Einleitung

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3D-In-vitro-Kulturmodelle, die im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturmodellen mehr In-vivo-ähnliche strukturelle und morphologische Eigenschaften aufweisen, wurden als vielversprechende Systeme in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen wie Tissue Engineering, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening anerkannt 1,2,3. Als eine Art von 3D-Kulturmodell beziehen sich Zellsphäroide typischerweise auf die Zellaggregation und erzeugen 3D-sphäroidale Strukturen, die durch verbesserte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen gekennzeichnet sind 4,5,6. Daher ist die Herstellung von Zellsphäroiden zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, um verschiedene biologische Studien zu ermöglichen.

Verschiedene Techniken, einschließlich des Aufhängensvon Tropfen 7, nicht klebender Platten8 oder Mikrotitervorrichtungen9, wurden entwickelt, um Sphäroide zu erhalten. Prinzipiell erleichtern diese Methoden die Zellassemblierung, indem sie physikalische Kräfte wie die Gravitationskraft nutzen und gleichzeitig die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat minimieren. Sie sind jedoch oft arbeitsintensiv, haben eine geringe Produktivität und stellen eine Herausforderung für die Steuerung der Sphäroidgrößedar 10,11. Wichtig ist, dass die Herstellung von Sphäroiden mit der gewünschten Größe und Gleichmäßigkeit in ausreichender Menge von größter Bedeutung ist, um spezifische biologische Anwendungen zu erfüllen. Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden haben akustische Wellen als eine Art von externer Krafttechnik 12,13,14 das Potenzial für die Massenherstellung von Zellsphäroiden mit hoher Qualität und hohem Durchsatz gezeigt, basierend auf dem Prinzip der Verbesserung der Zellaggregation durch äußere Kräfte 15,16,17,18. Im Gegensatz zu elektromagnetischen oder magnetischen Kräften sind akustische Zellmanipulationstechniken nicht-invasiv und markierungsfrei, was eine Sphäroidbildung mit ausgezeichneter Biokompatibilität ermöglicht19,20.

Üblicherweise wurden auf akustischen Wellen der stehenden Oberfläche (SAWs) und auf akustischen Massenwellen (BAWs) basierende Geräte entwickelt, um Sphäroide zu erzeugen, wobei die akustischen Knoten (ANs) verwendet werden, die durch entsprechende stehende akustische Felder21, 22, 23 erzeugt werden. Insbesondere akustische Montagevorrichtungen, die auf BAWs basieren, mit den Vorteilen einer bequemen Herstellung, einer einfachen Bedienung und einer ausgezeichneten Skalierbarkeit, haben für die Herstellung von Zellsphäroiden24,25 Aufmerksamkeit erregt. Wir haben kürzlich ein einfaches BAWs-basiertes akustisches Montagegerät entwickelt, das in der Lage ist, Sphäroide mit hohem Durchsatzzu erzeugen 26. Die vorgeschlagene Vorrichtung besteht aus einer quadratischen Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kammer mit drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene angeordnet sind. Diese Anordnung ermöglicht die Erstellung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs) zur Ansteuerung der Zellmontage. Im Vergleich zu zuvor berichteten BAWs- oder SAWs-basierten Vorrichtungen, die nur ein 1D- oder 2D-Array von ANs27, 28, 29 erzeugen können, ermöglicht die vorliegende Vorrichtung ein 3D-Punkt-Array von LANs für eine schnelle Zellaggregatbildung innerhalb der Gelatinemethacryloyl (GelMA)-Lösung. Anschließend reiften die Zellaggregate nach drei Tagen Kultivierung zu Sphäroiden mit hoher Viabilität innerhalb der photogehärteten GelMA-Gerüste. Schließlich konnte eine große Anzahl von Sphäroiden mit einheitlicher Größe aus den GelMA-Gerüsten für nachgelagerte Anwendungen leicht gewonnen werden.

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Protokoll

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1. Herstellung der 3D-Akustik-Montagevorrichtung

  1. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von vier 1 mm dicken PMMA-Platten durch Laserschneiden30 und kleben Sie sie dann zu einer quadratischen Kammer mit einer Innenbreite von 21 mm und einer Höhe von 10 mm zusammen.
  2. Befestigen Sie als Nächstes eine weitere 1 mm dicke PMMA-Folie am Boden der Kammer, die als Halterung für die Biotinte dient.
  3. Drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandler (PZT) (jeweils 20 mm lang, 10 mm breit, 0,7 mm dick und mit einer Primärresonanzfrequenz von 3 MHz, siehe Materialtabelle) werden vorsichtig an der Außenseite der drei orthogonalen Wände der Kammer angebracht. Stellen Sie sicher, dass der untere PZT-Wandler unter der Kammer zentriert ist.
  4. Löten Sie Drähte an die beiden leitenden Bereiche jedes PZT-Wandlers.
  5. Befestigen Sie das Gerät abschließend auf einem hohlen Boden, um zu verhindern, dass der untere PZT mit anderen Arbeitsplatten in Berührung kommt.

2. Aufbau des akustischen Montagesystems

  1. Montieren Sie das akustische Gerät zunächst auf einem Mikroskoptisch, um das Innere der Kammer aus der Vogelperspektive betrachten zu können.
  2. Positionieren Sie ein digitales Mikroskop auf der Seite des Geräts, die frei von PZT-Wandlern ist, um eine seitliche Beobachtung des Inneren der Kammer zu ermöglichen.
  3. Verbinden Sie die Drähte der drei PZT-Wandler unabhängig voneinander in Reihe mit drei Leistungsverstärkern und drei Ausgangskanälen von Funktionsgeneratoren (siehe Materialtabelle).
  4. Programmieren Sie die Einstellungen an den Funktionsgeneratoren für jeden PZT-Wandler und geben Sie Parameter wie sinusförmige Wellenform, Frequenz und Amplitude an.
  5. Um die Sterilisation zu gewährleisten, füllen Sie die Kammer des akustischen Geräts 5 Minuten lang mit 75%igem Alkohol, gefolgt von einer gründlichen Reinigung mit steriler PBS-Lösung. Bestrahlen Sie anschließend die Kammer mindestens 1 h lang mit UV-Licht in einer sauberen Bank.

3. Zellkultur- und Ernteverfahren

  1. Beginnen Sie mit der Kultivierung von C3A-Zellen, einer humanen hepatozellulären Karzinomzelllinie, in einer T25-Zellkulturflasche unter Verwendung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde (siehe Materialtabelle).
  2. Wenn die C3A-Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, führen Sie die Zellpassage wie folgt durch: Zuerst wird der Boden des Kulturkolbens zweimal mit PBS gewaschen. Dann werden 2 ml 0,05%iges Trypsin-EDTA in den Zellkulturkolben gegeben und bei 37 °C inkubiert, um die Zellablösung zu erleichtern. Stoppen Sie den Trypsinisierungsprozess, indem Sie 2 ml des vollständigen Nährmediums hinzufügen.
  3. Die Zelllösung wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten.

4. Herstellung der Biotinte

  1. Bereiten Sie eine 6%ige (w/v) GelMA-Lösung mit 0,5 % (w/v) Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) vor, indem Sie 0,3 g GelMA und 0,025 g LAP (siehe Materialtabelle) in 5 ml Phosphatpufferlösung (PBS) auflösen. Die Mischung 1 h im 47 °C warmen Wasserbad ziehen lassen.
  2. Vor dem Mischen mit Zellen wird die GelMA-Lösung zur Sterilisation durch einen 0,22-μm-Filter (siehe Materialtabelle) geleitet.
  3. Resuspendieren Sie das oben erwähnte Zellpellet (Schritt 3.3) in Zellkulturmedium. Färben Sie ein kleines Zellvolumen mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung und verwenden Sie dann ein sauberes Hämozytometer zur Zellzählung.
  4. Mischen Sie eine geeignete Menge C3A-Zellen, berechnet auf der Grundlage der oben erhaltenen Zelldichte, mit der sterilisierten GelMA-Lösung, um die Biotinte mit einer Zelldichte von 2 × 106 Zellen/ml herzustellen.
  5. Zur Visualisierung der zusammengesetzten Zellsphäroide werden C3A-Zellen vorgefärbt, indem sie mit 2 μM Cell Tracker (DiO-Farbstoff, siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 20 min inkubiert werden. Anschließend werden die markierten Zellen vor Gebrauch dreimal mit frischem Zellkulturmedium gewaschen.

5. Zusammenbau der Zellsphäroide mit dem akustischen Gerät

  1. Pipettieren Sie mehr als 1 ml der Biotinte in die sterilisierte Kammer. Stellen Sie sicher, dass der Abstand von Angesicht zu Angesicht zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und dem Kammerboden ein ganzzahliges Vielfaches der halben akustischen Wellenlänge ist.
    HINWEIS: Man kann diesen Abstand steuern, indem man die Menge der zugegebenen Biotinte anpasst. Die akustische Wellenlänge (λ) kann mit der Formel λ = c/f abgeschätzt werden, wobei c für die Schallgeschwindigkeit im Medium und f für die Frequenz des PZT-Wandlers steht.
  2. Schalten Sie den Funktionsgenerator und den Leistungsverstärker ein, um die Betätigung jedes PZT-Wandlers einzuleiten.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, jeden PZT-Wandler zuerst einzeln zu betätigen, um das optimale Parallellinien-Zellmuster zu erreichen. Dies kann erreicht werden, indem für jeden PZT-Wandler ein Frequenz-Sweep mit einer Schrittweite von 0,001 MHz in der Nähe der primären Resonanzfrequenz durchgeführt wird. Anschließend werden diese optimalen Signale gleichzeitig auf alle drei PZT-Wandler angewendet, um das erwartete zelluläre 3D-Punktmuster zu erhalten. Stellen Sie vor dem Auftragen jedes Eingangssignals sicher, dass die Zellen durch leichtes Rühren gleichmäßig in der Biotinte verteilt sind.
  3. Vernetzen Sie die Biotinte mit blauem Licht (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s), um ein 3D-Hydrogel-Gerüst zu erstellen, das die akustisch zusammengesetzten Zellaggregate einkapselt. Schalten Sie anschließend den Funktionsgenerator und die Endstufe aus.
  4. Übertragen Sie das 3D-Hydrogel-Gerüst vorsichtig aus der Kammer in eine Petrischale und schneiden Sie es mit einem sauberen Rasiermesser in kleine Stücke (z. B. 2 mm × 2 mm × 2 mm).
  5. Geben Sie Zellkulturmedium für die Kultivierung hinzu.
    HINWEIS: Denken Sie daran, das Nährmedium jeden Tag zu wechseln.

6. Abrufen von Zellsphäroiden

  1. Beginnen Sie mit der Beobachtung der Sphäroidbildung an verschiedenen Schichten der Gerüste mit einem inversen Mikroskop.
  2. Entfernen Sie nach 3 Tagen Kultur das Nährmedium und waschen Sie die Hydrogel-Gerüste zweimal gründlich mit PBS.
  3. Inkubieren Sie die Gerüste mit mehr als 2 ml GelMA-Lysepuffer in einer Verdünnung von 1:200 mit Zellkulturmedium für 30 Minuten in einem Zellinkubator. Dieser Schritt zielt darauf ab, die Hydrogel-Gerüste aufzulösen.
  4. Die Lösung aus dem vorherigen Schritt wird in ein Röhrchen überführt und dann bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das Zellkugelpellet zu erhalten.
  5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Nährmedium für nachgelagerte Anwendungen.

7. Sphäroid-Viabilitätsanalyse

  1. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit von Zellsphäroiden entweder innerhalb der Hydrogel-Gerüste oder in den gewonnenen Sphäroiden mit einem Lebend-/Tot-Färbekit (siehe Materialtabelle).
  2. Inkubieren Sie die Proben zu verschiedenen Kulturzeitpunkten mit 1 ml PBS-Lösung, die 1 μl Calcein-AM und 2 μl Propidiumiodid (PI) enthält, für 15 Minuten bei 37 °C.
  3. Proben innerhalb der Hydrogel-Gerüste werden zweimal direkt mit PBS gewaschen. Bei gewonnenen Sphäroiden wird bei 200 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um ein Sphäroidpellet zu erhalten, und vor der Beobachtung zweimal gewaschen.
  4. Beobachten Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie die Fluoreszenzbilder auf.
  5. Berechnen Sie das Verhältnis der mit Calcein-AM gefärbten Fläche zur Gesamtfläche, die sowohl mit Calcein-AM als auch mit PI gefärbt ist, mit ImageJ, um die Sphäroidviabilität zu bestimmen.

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Ergebnisse

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In dieser Studie wurde ein akustisches 3D-Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden entwickelt. Die akustische Vorrichtung bestand aus einer quadratischen Kammer mit zwei PZT-Wandlern, die an der X- und Y-Ebene an der Außenfläche der Kammer angebracht waren, und einem PZT-Wandler am Boden der Kammer (Abbildung 1A, B). Drei Ausgangskanäle von zwei Funktionsgeneratoren wurden mit drei Leistungsverstärkern verbunden, um drei unabhängig voneinander sinusförmige Sig...

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Diskussion

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Die effiziente und stabile Herstellung von Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung von Technologien wie dem 3D-Akustik-Montagegerät ist vielversprechend für die Weiterentwicklung der Biomedizintechnik und des Wirkstoffscreenings 1,2,3. Dieser Ansatz vereinfacht die Massenproduktion von Zellsphäroiden durch einfache Verfahren.

Es gibt jedoch kritische Faktoren, die bei der Verwendung dieses...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) und der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22-μ m FilterMerckSLGSM33SSWird für die Sterilisation von GelMA-Lösungen
verwendet 35-mm-ZellkulturschaleCorning430165Wird für die Kultivierung von Zellen
verwendet KonfokalmikroskopNikonA1RHD25Fluoreszierende Zellbeobachtung
DiO-FarbstoffBeyotimeC1038Farbstoff zur Färbung von Zellen
DMEMGibco12430054Zellkulturmedien
FBSGibco10099141CNahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
FunktionsgeneratorRigolDG5352Für die Erzeugung von HF-Signalen
GelMARegenovononeWird zur Herstellung von Bioink
GelMA Lysepufferverwendet EFLEFL-GM-LS-001Wird zum Auflösen von GelMA-Gerüsten
Umgekehrtes MikroskopNikonTi-UZellbeobachtung
LAPSigma-Aldrich900889Wird als Photoinitiator
verwendet Leben-Tot-KitBeyotimeC2015MZellvabilitätsanalyse
PBSGibco10010002Wird als Puffer
verwendet Penicillin-StreptomycinGibco15070063Verhindert die Kontamination von Zellkulturen
LeistungsverstärkerMinicircuitLCY-22+Erhöhen Sie die Spannungsamplitude des HF-Signals
PZT-WandlerYantai Xingzhiwen Trading Co., Ltd.PZT-41Funktionseinheiten für akustische Montagevorrichtung
T25 ZellkulturkolbenCorning430639Wird für die Kultivierung von Zellen
verwendet Trypanblau Gibco15250061Zellzählung
Trypsin-EDTA Gibco25200056Enzym zur Zelldissoziation

Referenzen

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3D ZellkulturSpheroid HerstellungGelMA Ger stPZT WandlerBioink Pr parationFluoreszenzmikroskopieZellaggregateHochdurchsatz Spheroids

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