CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Audrey E. Van Heest; Feiyang Deng; Renee T. Zhao; Nour Saida Harzallah; Heather E. Fleming; Sangeeta N. Bhatia; Liangliang Hao

doi:10.3791/66189

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Methodenartikel

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

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DOI:

10.3791/66189

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8. Dezember 2023

Audrey E. Van Heest¹ , Feiyang Deng¹ , Renee T. Zhao² , Nour Saida Harzallah²^,³ , Heather E. Fleming³^,⁴ , Sangeeta N. Bhatia²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸ , Liangliang Hao¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University, ²Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, ³Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, ⁴Howard Hughes Medical Institute, ⁵Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, ⁶Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, ⁷Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, ⁸Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Entwicklung synthetischer Biomarker für die Entwicklung von Präzisionsdiagnostika hat die Erkennung von Krankheiten über Wege ermöglicht, die über die für herkömmliche Biofluidmessungen verwendeten hinausgehen. Synthetische Biomarker verwenden im Allgemeinen Reporter, die lesbare Signale in der Bioflüssigkeit liefern, um die biochemischen Veränderungen in der lokalen Krankheitsmikroumgebung während des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit widerzuspiegeln. Die pharmakokinetische Konzentration der Reporter und die biochemische Amplifikation des Krankheitssignals sind von größter Bedeutung, um eine hohe Sensitivität und Spezifität in einem diagnostischen Test zu erreichen. Hier wird eine Krebsdiagnoseplattform mit einem Format synthetischer Biomarker aufgebaut: aktivitätsbasierte Nanosensoren, die chemisch stabilisierte DNA-Reporter tragen, die durch aberrante proteolytische Signaturen in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden können. Synthetische DNA als Krankheitsreporter bietet Multiplexing-Fähigkeit durch ihre Verwendung als Barcode, die das gleichzeitige Auslesen mehrerer proteolytischer Signaturen ermöglicht. DNA-Reporter, die in den Urin freigesetzt werden, werden mit Hilfe von CRISPR-Nukleasen durch Hybridisierung mit CRISPR-RNAs nachgewiesen, die wiederum bei Enzymaktivierung ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal erzeugen. In diesem Protokoll werden DNA-Barcode-basierte, aktivitätsbasierte Nanosensoren konstruiert und ihre Anwendung in einem präklinischen Mausmodell für metastasierenden Darmkrebs veranschaulicht. Dieses System ist je nach Krankheitsbiologie in hohem Maße modifizierbar und erzeugt mehrere Krankheitssignale gleichzeitig, was ein umfassendes Verständnis der Krankheitsmerkmale durch einen minimalinvasiven Prozess ermöglicht, der nur die Verabreichung von Nanosensoren, die Urinsammlung und einen Papiertest erfordert, der eine Point-of-Care-Diagnostik ermöglicht.

Einleitung

Trotz der erheblichen Anstrengungen, Tumor-Biomarker wie abgestoßene Proteine und DNA zu identifizieren, wurde das Feld der Krebsdiagnostik durch ihre geringe Häufigkeit oder ihren schnellen Abbau im Kreislauf belastet¹. Als ergänzende Strategie stellen biotechnologisch hergestellte synthetische Biomarker, die selektiv auf Krankheitsmerkmale reagieren, um verstärkte Signale zu erzeugen, neue Wege zu einer genauen und zugänglichen Diagnostik dar ^2,3. Um die Erkennung zu unterstützen, nutzen diese synthetischen Biomarker tumorabhängige Aktivierungsmechanismen wie die enzymatische Amplifik....