Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.
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Methodenartikel
Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, eine serotypagnostische Methode zur Aufreinigung von AAV, die erstmals 1999 beschrieben wurde. rAAV-Vektoren werden häufig in Gentherapieanwendungen verwendet, um Transgene an verschiedene menschliche Zelltypen zu liefern. In dieser Arbeit wird das rekombinante Virus durch Transfektion von Expi293-Zellen in Suspensionskultur mit Plasmiden hergestellt, die für das Transgen, das Vektorkapsid und die adenoviralen Helfergene kodieren. Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation reinigt vollständige AAV-Partikel basierend auf der Partikeldichte. Darüber hinaus sind drei Schritte in dieser inzwischen allgegenwärtigen Methodik enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Ausfällungen aufgrund kontaminierender Proteine zu verringern bzw. das Endprodukt des Virus weiter zu konzentrieren: Ausfällung von Viruspartikeln aus Zellmedien unter Verwendung einer Lösung aus Polyethylenglykol (PEG) und Natriumchlorid, Einführung einer zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, und Pufferaustausch über einen Zentrifugalfilter. Mit dieser Methode ist es möglich, konsistent Titer im Bereich von 10bis 12 Viruspartikeln/ml von außergewöhnlicher Reinheit für die In-vivo-Anwendung zu erreichen.
Einleitung
Rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren sind weit verbreitete Instrumente zur Behandlung genetischer Erkrankungen, einschließlich spinaler Muskelatrophie, Netzhautdystrophie und Hämophilie A 1,2,3. rAAV-Vektoren sind so konstruiert, dass ihnen virale Gene fehlen, die in Wildtyp-AAV4 vorhanden sind, einem kleinen, nicht umhüllenden Ikosaedervirus mit einem linearen einzelsträngigen 4,7 kb DNA-Genom. AAV wurde erstmals in den 1960er Jahren als Kontaminante von Adenovirus-Präparaten entdeckt5. Trotz seiner kleinen Kap....
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Protokoll
Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Puffer ist in Tabelle 1 angegeben.
| Lösung | Zusammensetzung | |
| AAV-Lyse-Puffer | 1,2 ml 5 M NaCl-Lösung | |
| 2 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5 Lösung | ||
| 80 μl 1 M MgCl2-Lösung | ||
| mQ Wasser bis 40 mL | ||
| AAV-Fällungslösung | 40 g PEG 8000 | |
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Ergebnisse
Mit dieser Methode können Titer von mindestens 10bis 12 Viruspartikeln pro ml erhalten werden. Ein Titer kann (Abbildung 3) durch qPCR unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle 1 angegebenen ITR-Primer, durch ddPCR oder durch eine andere Titermethode erhalten werden. Suboptimale Titer könnten sich aus der Verwendung eines Cap-Gens ergeben, das für ein Kapsid mit schlechter Verpackungseffizienz kodiert.
Eine weitere möglic.......
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Diskussion
Das Protokoll zur doppelten Iodixanol-Dichtegradientenreinigung ist die universelle Methode, da es auf alle AAV-Mutantenvarianten anwendbar ist, unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität. Frühe Methoden der AAV-Reinigung beruhten auf der Partikeldichte und umfassten die isopyknische Zentrifugation in CsCl und die kontinuierliche Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation19. Später wurden Serotyp-spezifische Ansätze entwickelt, bei denen monoklonale Antikörper verwendet wurden, die an Sepharosesäulen .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Offenlegungen zu berichten.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5810 R Tischzentrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-Kanal-Schlauchpumpe | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automatisierter Zellzähler | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biologische Sicherheitswerkbank | Labconco | 322491101 | |
| CO2 Inkubator mit Schüttler | Eingestellt auf 8 % CO2 und 37 > C | ||
| Konische Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Konische Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Einweg-Mikropipetten | Fisherbrand | 21-164-2G | Kapillaren |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne CaCl2 und MgCl2 (DPBS) (10-fach) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverses Mikroskop | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F Zellen | Gibco | A14527 | |
| Filterspitzen | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µ L |
| Filterspitzen | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µ L |
| Filterspitzen | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µ L |
| Filterspitzen | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µ L |
| Injektionsnadeln | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Eiskübel mit Deckel | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 Rotor | Beckman Schar | 368690 | |
| Magnesiumchloridlösung (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metallständer und Klemme | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 22600028 | 1,5 mL |
| Spitzzange | |||
| Optima XE-90 Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Medium mit reduziertem Serum | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep Medium mit Dichtegradient (Iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60%ige Iodixanollösung |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipette | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipette | Gilson | F144058M | |
| Phenol rot Lösung | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP Pipettierhilfe | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo oder Addgene, etc. | N/A | Wir verwenden pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo oder Addgene, etc. | N/A | Wir verwenden pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 Polyollösung (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylenglykol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimin HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | In Wasser auf 40 μm verdünnen; M |
| Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, steril | Corning | 431123 | 500 mL |
| Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, steril | Corning | 430776 | 250 mL |
| Optiseal-Röhrchen aus Polypropylen | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serologische Pipetten | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serologische Pipetten | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serologische Pipetten | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serologische Pipetten | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Schüttelkolben | Fisherbrand | PBV1000 | 1 l |
| Schüttelkolben | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Schüttelkolben | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Schüttelkolben | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Natriumchloridlösung (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile Spritzen | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Spritzenfilter | Millipore | SLGV013SL | 0,22 Mikron |
| Tris-HCl pH 8,5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypanblau Lösung | Gibco | 15250061 | |
| Gestell für Rohre | Beckman Coulter | 361646 | |
| Abstandshalter für Schläuche (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Schläuche für Schlauchpumpe | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Typ 70 Ti Rotor aus Titan mit festem Winkel | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultratiefkühlschrank | Auf -70 Grad eingestellt; C | ||
| Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Wasserbad | Auf 37 Grad eingestellt; C |
Referenzen
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
