Postoperatives Ileus-Mausmodell

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Mausmodell des postoperativen Ileus, das durch intestinale Manipulation erzeugt wurde. Die gastrointestinale Transitfunktion, die pathologischen Veränderungen und die Aktivierung der Immunzellen wurden 24 Stunden nach der Operation beurteilt.

Zusammenfassung

Bei den meisten Patienten kommt es nach der Operation zu einem postoperativen Ileus (POI), der mit einer erhöhten Morbidität, Mortalität und Krankenhausaufenthaltszeit verbunden ist. POI ist eine Folge mechanischer Beschädigungen während der Operation, die zu einer Störung der Beweglichkeit im Magen-Darm-Trakt führen. Die Mechanismen der POI hängen mit einer aberranten neuronalen Empfindlichkeit, einer gestörten epithelialen Barrierefunktion und einer erhöhten lokalen Entzündung zusammen. Die Details bleiben jedoch rätselhaft. Daher sind experimentelle Mausmodelle entscheidend für die Aufklärung der Pathophysiologie und des Mechanismus der POI-Schädigung und für die Entwicklung neuartiger Therapien.

Hier stellen wir ein murines Modell von POI vor, das durch intestinale Manipulation (IM) erzeugt wurde und der klinischen Chirurgie ähnelt; Dies wird durch eine mechanische Schädigung des Dünndarms erreicht, indem der Bauch 1-3 Mal mit einem Wattestäbchen massiert wird. Die IM verzögerte die gastrointestinale Passage 24 Stunden nach der Operation, beurteilt durch FITC-Dextransonde und Fluoreszenzdetektion des segmentalen Verdauungstrakts. Darüber hinaus wurden die Gewebeschwellung der Submukosa und die Infiltration von Immunzellen mittels Hämatoxylin- und Eosinfärbung und Durchflusszytometrie untersucht. Der richtige Druck des IM und eine hyperämische Wirkung auf den Darm sind entscheidend für das Verfahren. Dieses murine Modell des POI kann verwendet werden, um die Mechanismen der Darmschädigung und der Genesung nach einer Bauchoperation zu untersuchen.

Einleitung

Der postoperative Ileus (POI) ist ein Syndrom, das eine große Herausforderung im Bereich der menschlichen Gesundheit darstellt, insbesondere bei der Behandlung von Patienten, die sich einer Bauchoperation unterziehen. Der POI ist durch eine verzögerte Erholung der gastrointestinalen Motilität gekennzeichnet und trägt zu längeren Krankenhausaufenthalten und erhöhten Gesundheitskosten bei, ohne dass es eine etablierte Definition, Ätiologie oder Behandlung gibt¹. Neuere Forschungen haben Aufschluss über die zentrale Rolle von Immunzellen bei der Progression von POI^{gegeben 2,3,4}, aber es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.

In diesem Protokoll stellen wir ein murines Modell des durch intraabdominale Chirurgie induzierten POI vor, das die Auswirkungen einer abdominalen Operation auf den Verdauungstrakt sehr gut nachahmt. Unser Ziel war es, eine standardisierte Methode für die Modellierung von POI in Mäusen bereitzustellen, die es den Forschern ermöglicht, ihre Pathophysiologie zu untersuchen und neue therapeutische Interventionen zu erforschen.

Der Grund für die Entwicklung und Nutzung dieser Technik liegt in der Notwendigkeit zuverlässiger präklinischer Modelle zur Untersuchung von POI. Traditionellen Ansätzen zur Untersuchung von POI fehlt es oft an translationaler Relevanz oder sie erfassen nicht das komplexe Zusammenspiel von Faktoren, die zu der Erkrankung beitragen. Durch die Einführung eines Mausmodells, das das klinische Szenario genau nachbildet, können die Forscher die Mechanismen, die dem POI zugrunde liegen, genauer untersuchen und potenzielle therapeutische Interventionen in einer kontrollierten experimentellen Umgebung testen.

Im Vergleich zu alternativen Techniken bietet das in diesem Protokoll vorgestellte murine Modell des POI mehrere Vorteile. Zunächst haben wir unsere experimentellen Ergebnisse mit den jüngsten Fortschritten kombiniert, um ein standardisiertes und reproduzierbares Protokoll für die Induktion von POI bei Versuchstieren zu etablieren. Dieses Protokoll ermöglicht eine konsistente Beurteilung der gastrointestinalen Transitfunktion. Zweitens ermöglichte der Einsatz histologischer Färbung und Durchflusszytometrie die Beurteilung der Gewebeschwellung, der Immunzellproliferation und -aktivierung, was wertvolle Einblicke in die Entzündungsprozesse lieferte, die POI⁵ zugrunde liegen.

Im breiteren Kontext der Literatur trägt die Etablierung eines murinen Modells des POI zu der wachsenden Zahl von Forschungsarbeiten bei, die darauf abzielen, die Pathophysiologie dieser Erkrankung zu verstehen. Durch die Überbrückung der Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Praxis spielen präklinische Modelle eine zentrale Rolle bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für POI⁶. Darüber hinaus erhöht die Verfügbarkeit standardisierter Tiermodelle die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit von Forschungsergebnissen über verschiedene Labore hinweg. Dieses POI-Modell beruht jedoch auf einer mechanischen Stimulation während des chirurgischen Eingriffs. Andere Formen des stimulationsinduzierten Ileus sind für dieses Modell möglicherweise nicht geeignet. Darüber hinaus sollten Forschende bei der Planung von Experimenten mit diesem Modell Faktoren wie Tierschutzvorschriften, ethische Überlegungen und die Verfügbarkeit von Ressourcen berücksichtigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einführung eines murinen Modells des POI einen bemerkenswerten Fortschritt in der präklinischen Forschung zu dieser schwächenden Erkrankung darstellt. Darüber hinaus setzten wir H&E-Färbung und Durchflusszytometrie ein, um die Gewebeschwellung sowie die Proliferation und Aktivierung von Immunzellen zu beurteilen. Die Etablierung eines murinen POI-Modells würde die Entdeckung von POI-Mechanismen erleichtern und die Entwicklung neuartiger Therapien für POI fördern.

Protokoll

Die Tierpflege und die Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Leitprinzipien für die Pflege und Verwendung von Tieren (China) durchgeführt und vom Ethikprüfungsausschuss des Beijing Friendship Hospital (Nr. 20-2056) genehmigt. Für die Studie wurden C57BL/6 Mäuse (8-12 Wochen alt) verwendet.

1. Vorbereitung auf die Operation

1. Fasten Sie alle Mäuse 12 Stunden vor der geplanten Modellierung, um die Standardisierung der experimentellen Bedingungen zu erfüllen (Abbildung 1A).
2. Chirurgische Instrumente vorbereiten und sterilisieren.
3. Bereiten Sie das Anästhetikum Tribromethanol und das Heizkissen vor. Überwachen Sie das Heizkissen, um eine Überhitzung zu vermeiden und es auf einer konstanten Temperatur (37,5 °C) zu halten.

2. Anästhesie

1. Betäuben Sie jede Maus mit Tribromethanol.
   1. Tribromethanol wird verdünnt, um eine Lösung von 20 mg/ml in normaler Kochsalzlösung herzustellen. Verabreichen Sie 0,2 ml der Tribromethanol-Arbeitslösung pro 10 g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion. Verwenden Sie eine Augensalbe auf die Augen von Mäusen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse innerhalb von 5 Minuten vollständig betäubt sind und 20 Minuten lang betäubt bleiben.
2. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Unfähigkeit der Maus beobachten, aufrecht zu bleiben, und auf Muskelentspannung prüfen. Beobachten Sie den Verlust der willkürlichen Bewegung, des Blinzelreflexes und der Reaktion auf die Reflexstimulation (Zehen- oder Schwanzkneifen mit festem Druck).
3. Beurteilen Sie die Atemfrequenz und das Atemmuster der Maus, indem Sie die Bewegung der Brustwand und des Bauches überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz bei optimaler Anästhesie ~ 55-65 Atemzüge/min beträgt.
4. Platzieren Sie die betäubte Maus auf einem Brett und befestigen Sie sie mit Klebeband.
5. Nachdem die Mäuse vollständig betäubt wurden, verwenden Sie einen elektrischen Haarrasierer, um Haare aus dem Bauch zu entfernen. Wischen Sie nach der Rasur alle losen Haare am Bauch mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattebausch ab.
   HINWEIS: Achten Sie beim Umgang mit Tribromethanol auf eine ordnungsgemäße Belüftung und die Verwendung eines Abzugs oder einer Biosicherheitswerkbank, um das Expositionsrisiko zu minimieren. Tragen Sie während des Eingriffs geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Laborkittel, um einen versehentlichen Kontakt mit Chemikalien und biologischen Materialien zu vermeiden.

3. Chirurgie

1. Strecken Sie die Gliedmaßen vollständig aus, um den Bauch freizulegen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus so positioniert ist, dass die Atemwege frei bleiben (Abbildung 1B).
2. Desinfizieren Sie die Haut des Operationsbereichs zweimal mit einem Wattebausch, der mit 75% Alkohol getränkt ist. Verwenden Sie nach der Desinfektion eine trockene, sterile medizinische Gaze, um überschüssigen Alkohol aus dem Bauch zu entfernen. Lidocain (10 mg/kg, subkutan) vor der Inzision an der vorgesehenen Stelle verabreichen.
3. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen Schnitt in die Haut zu machen, und heben Sie den Musculus rectus abdominis in der Mitte des Bauches mit einer Pinzette an.
   1. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Mittellinie des Musculus rectus abdominis und achten Sie darauf, Verletzungen verschiedener Organe im Bauchraum zu vermeiden.
   2. Stellen Sie sicher, dass der ungefähre Bereich des Schnitts wie folgt ist. Stellen Sie sicher, dass der obere Rand des Schnitts 6-8 mm vom Xiphoid-Prozess des Brustbeins entfernt ist, der untere Rand 6-8 mm von den äußeren Genitalien und die Länge des Schnitts ~1 cm.
4. Legen Sie ein Stück steriles OP-Tuch oder sterile Gaze auf beide Seiten des Bauchschnittes. Verwenden Sie eine hämostatische Pinzette, um die sterile Gaze am oberen und unteren Rand des Schnitts zu fixieren und den Schnitt freizulegen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: In der Scheingruppe wurde der Schnitt ohne chirurgischen Eingriff 5 Minuten lang mit feuchter Gaze abgedeckt.
5. Fixiere das sterile Tuch oder die Gaze richtig und drücke dann mit zwei mit Kochsalzlösung vorangefeuchteten Wattestäbchen sanft gegen beide Seiten der Bauchdecke, die an den Schnitt angrenzen. Drücken Sie eine kleine Menge des Darmschlauchs durch den Schnitt heraus und legen Sie ihn frei, indem Sie ihn auf das sterile Tuch oder die Gaze legen (Abbildung 1D).
6. Befeuchten Sie zwei sterile Wattestäbchen vollständig mit normaler Kochsalzlösung. Fassen Sie mit den angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig das Darmgewebe an und entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm.
   1. Lokalisieren Sie den Blinddarm und nehmen Sie dann den Darm mit den sterilen Wattestäbchen bis 2 cm vor dem Magen heraus, um eine Berührung der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden. Verlängern Sie den Darm vom proximalen Ende des Pankreato-Duodenalbandes bis zum distalen Ende der Ileozökalregion.
7. Üben Sie gleichmäßigen Druck entlang des gesamten Dünndarms von den proximalen bis zu den distalen Enden aus. Stellen Sie sicher, dass die Kraft 5 Minuten lang gleichmäßig ausgeübt wird, bis kleine Blutungsflecken auf der Darmoberfläche entstehen (Abbildung 1E).
8. Nach 5 Minuten verwenden Sie vorangefeuchtete sterile Wattestäbchen, um den gesamten Dünndarm vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zu legen, wobei Sie der normalen physiologischen anatomischen Position des Dünndarms folgen.
9. Massieren Sie den Bauch 3-5 s lang sanft über die sterile Gaze und die Bauchdecke, um sicherzustellen, dass der Darm wieder in seine natürliche anatomische Position zurückkehrt und um einen künstlichen mechanischen Darmverschluss oder eine Mesenterialdrehung nach der Operation zu verhindern.
10. Injizieren Sie 100 μl Kochsalzlösung in die Bauchhöhle, um während der Operation verlorene Flüssigkeit zu ersetzen und das Bauchgewebe zu schmieren.
11. Verschließen Sie den Bauch mit einer chirurgischen Naht 6-0 und führen Sie einen zweischichtigen Verschluss am Bauchschnitt durch. Beginnen Sie damit, die Muskelschicht mit durchgehenden Nähten zu verschließen, und achten Sie darauf, Schäden an den Bauchorganen zu vermeiden. Heben Sie den Musculus rectus abdominis während des Nähens an (Abbildung 1F).
12. Nachdem Sie den Musculus rectus abdominis vollständig verschlossen haben, nähen Sie ihn vollständig mit einfachen intermittierenden Nähten mit einer chirurgischen Naht 6-0. Halten Sie eine Stichlänge von ~0,5 mm und einen Nadelabstand von ~2 mm ein.
13. Wischen Sie nach dem Schließen des Bauchschnitts den Bereich in der Nähe des Einschnitts vorsichtig mit trockener, steriler medizinischer Gaze ab, um ihn trocken und sauber von Blut, Gewebeflüssigkeit oder normaler Kochsalzlösung zu halten.
14. Tragen Sie eine kleine Menge medizinischen Schnittkleber auf und um den Schnitt auf, um Risse nach der Operation zu vermeiden.
15. Nachdem der medizinische Schnittkleber vollständig getrocknet ist, legen Sie die Mäuse auf ein Papiertuch und legen Sie das Papiertuch im Käfig auf eine Heizdecke, die bei einer konstanten Temperatur von 37,5 °C gehalten wird, bis sich die Mäuse vollständig erholt haben. Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
16. Bringen Sie die wachen Mäuse in die Umgebung der Fütterungsbarriere und lassen Sie sie bis zum Erkennungszeitpunkt frei trinken.

4. Gastrointestinale Transituntersuchung

1. Verabreichen Sie den nüchternen Mäusen 22,5 h nach der Operation 200 μl FITC-Dextran-Lösung (5 mg/ml in PBS) über eine Sonde (Abbildung 1A).
2. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Methode, wie z. B. CO₂ -Inhalation gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
   1. Um den Verdauungstrakt zu isolieren, machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie vom Zwerchfell zum Becken und entfernen Sie vorsichtig das umgebende Bindegewebe und die Organe.
   2. Trennen Sie den Verdauungstrakt von den umliegenden Geweben und Organen und stellen Sie sicher, dass der gesamte Trakt vom Magen bis zum Anus einbezogen wird.
3. Unterteilen Sie den Verdauungstrakt in 15 gleiche Segmente (vom Magen bis zum Dickdarm), die je nach physiologischer Position von 1 bis 15 fortlaufend nummeriert sind (Sequenz: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (Abbildung 2A).
4. Schneiden Sie jedes Segment des Darmgewebes mit seinem Inhalt in 1-4 mm große Stücke und legen Sie diese in separate 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml DPBS.
5. Die Zentrifugenröhrchen 10 s lang vortexen, um die Proben zu homogenisieren.
6. Die Röhrchen bei 500 × g 1 min zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand für die FITC-Fluoreszenzquantifizierung mit einem Multimode-Mikroplatten-Reader.
7. Beschreiben Sie die gastrointestinale Passage, indem Sie das geometrische Zentrum (GC) des FITC-Dextrans berechnen und mit der folgenden Formel berechnen: (Σ[% FITC pro Segment x Segmentnummer])/100.

5. Paraffineinbettung und Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung

1. Die Mäuse werden durch CO₂ -Inhalation eingeschläfert, gefolgt von einer Zervixluxation nach 24 h. Führen Sie Paraffineinbettungs- und Magen-Darm-Assays am selben Tier durch.
2. Öffnen Sie die Bauchhöhle und sammeln Sie Dünndarmgewebe für die weitere Analyse.
3. Fixieren Sie den gesamten Darm mit Darminhalt in Carnoys Fixiermittel (60 % Methanol + 10 % Essigsäure + 30 % Chloroform) bei 4 °C für 2 h.
4. Entsäuern Sie das Gewebe, indem Sie zweimal jeweils 30 Minuten lang mit Methanol spülen.
5. Ersetzen Sie Methanol zweimal für jeweils 30 Minuten durch Ethanol.
6. Entsäuern Sie das Gewebe, indem Sie zweimal jeweils 30 Minuten lang mit Methanol spülen. Um Gewebetransparenz mit Xylol zu erreichen, tauchen Sie das Gewebe in Xylol und inkubieren Sie es 1 h lang.
7. Betten Sie das Gewebe mit einer Paraffineinbettmaschine in Paraffinwachs ein. Schneiden Sie das eingebettete Gewebe mit einem Mikrotom in 4 μm dicke Scheiben.
   HINWEIS: Teilen Sie den Dünndarm in verschiedene Wachse auf, um die Leistung zu verbessern. Beschriften Sie die Segmente ordnungsgemäß, um ihre Position zu identifizieren.
8. Führen Sie die HE-Färbung mit dem HE-Färbeset durch. Versiegeln Sie die Objektträger und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop zur Analyse.

6. Isolierung von Immunzellen und Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
   1. Vorverdauungslösung: Bereiten Sie Hanks ausgewogene Salzlösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ mit 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor.
   2. Aufschlusslösung: Bereiten Sie eine Lösung vor, die 200 μg/ml DNAase I, 500 μg/ml Kollagenase IV, 4 % FBS und 100 μM HEPES-Puffer in RPMI 1640 enthält.
   3. MACS-Puffer (Magnetic-activated cell sorting works): Bereiten Sie einen Puffer vor, der 5 g/L BSA und 2 mM EDTA in PBS ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ enthält.
2. Entfernen Sie den Stuhlinhalt, indem Sie den Darm mit normaler Kochsalzlösung waschen. Entfernen Sie Peyer-Pflaster und Bindegewebe des Dünndarms. Den Dünndarm längs aufschneiden und dann in eiskaltem PBS in 1 cm große Segmente schneiden.
3. Waschen Sie die Darmsegmente 20 Minuten lang mit einer Vorverdauungslösung bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler. Sammeln Sie die Vorverdauungslösung und filtrieren Sie sie durch 70 μm Zellsiebe, um intraepitheliale Lymphozyten (IELs) zu erhalten.
4. Verdauen Sie die Segmente in der Aufschlusslösung für 30 Minuten und filtrieren Sie dann die Suspension durch 70-μm-Zellsiebe, um Lamina-propria-Lymphozyten (LPLs) zu erhalten.
5. Die LPL-Zellen werden 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
6. Waschen und suspendieren Sie die Zellen mit DPBS (Natriumazid, Tris und proteinfrei) in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/100 μL.
7. Inkubieren Sie die Zellen mit einem fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff (1:500) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln.
8. Die Zellen mit MACS-Puffer suspendieren und bei 500 × g 5 min zentrifugieren.
9. Zählen Sie die gefärbten Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/100 μl MACS-Puffer. Führen Sie eine Antikörperfärbung (1:200-1:400) durch, indem Sie das entsprechende Volumen Antikörper in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
10. Waschen Sie die Zellen wie in Schritt 6.8 beschrieben.
11. Detektieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie und analysieren Sie die Daten mit der zugehörigen Durchflusszytometrie-Software ^7,8.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde der POI chirurgisch durch Darmmanipulation (IM) induziert, was dem Effekt einer klinischen Operation ähnelt. In der Scheingruppe wurde ein Schnitt ohne IM gesetzt. POI-Mäuse wurden 24 Stunden nach der POI-Operation zusammen mit Scheinkontrollmäusen getötet. Die kritische Funktion des Verdauungstraktes, die Funktion des Inhaltstransits, wurde durch eine Sonde von FITC-Dextran nachgewiesen. Das POI-Modell wurde als erfolgreich angesehen, da die FITC-Intensität im proximalen Teil des Dünndarms zunahm (Abbildung 2B). Die mittleren GC wurden berechnet, um die Transitstörung des IM zu quantifizieren und die Konsistenz des Vorgangs anzuzeigen (Abbildung 2C).

Die HE-Färbung zeigte die Morphologie verschiedener Segmente des Verdauungstrakts an (Abbildung 3). Die Submukosa und die glatte Muskelschicht des Duodenums und des Ileums schwollen 24 h nach der POI-Induktion an (Abbildung 3A,B). Im Vergleich zu denen in Scheinmäusen zeigte die HE-Färbung des Zwölffingerdarms eine erhöhte Infiltration von Immunzellen bei POI-Mäusen (Abbildung 3A).

Die mehrfarbige durchflusszytometrische Analyse ist die zentrale Methode zur Analyse von Anteil, Status und Funktion von Immunzellen. Das Darmgewebe wurde mit Kollagenase und Desoxyribonuklease verdaut und für die Durchflusszytometrie in eine Einzelzellsuspension getrennt. Die Gating-Strategie wurde verwendet, um die Anteile von CD3-T-Zellen und verwandten Subpopulationen unter den LPLs zu bestimmen (Abbildung 4A). Der Aktivierungs- und Adhäsionsmarker CD69 und die Expression von CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und gd-T-Zellen sind in POI-Mäusen hochreguliert (Abbildung 4B)⁷. In ähnlicher Weise zeigte der Anteil der CD44+ PD-1+ (Aktivierung, terminale Differenzierung und Erschöpfungsmarker) eine zunehmende Tendenz (Abbildung 4C)⁷. Neben den Lymphozyten sind auch die Anteile der myeloischen Zelluntergruppen (Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen) nach der IM-Operation erhöht (Abbildung 4D)⁸.

Abbildung 1: Mausmodell des postoperativen Ileus. (A) Schematische Darstellung des Mausmodells des postoperativen Ileus. (B) Fixierung der Maus nach Anästhesie und Rasur. (C) Der Schnitt wurde freigelegt und mit einer medizinisch sterilen Gaze bedeckt. (D) Die Darmschläuche wurden durch den Bauchschnitt aus der Bauchhöhle herausgedrückt und freigelegt, indem sie auf sterile Gaze gelegt wurden. (E) Der gesamte Dünndarm wurde einem angefeuchteten sterilen Wattestäbchen ausgesetzt. (F) Die Muskelschicht wurde durch eine chirurgische Naht verschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gastrointestinaler Transitassay zur Beurteilung der Funktion des Verdauungstrakts. 22,5 h nach der Operation wurden die Schein- oder POI-Mäuse mit FITC-Dextran-Lösung versorgt und 90 min später getötet. (A) Der Verdauungstrakt wurde in 15 Segmente unterteilt und nach physiologischer Position nummeriert. (B) FITC-Intensität jedes Segments aus dem Verdauungstrakt von Schein- und POI-Mäusen. (C) Die geometrischen Zentren des verabreichten FITC-Dextrans wurden berechnet und sind als Violinplots dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative HE-Färbung des Dünndarms von POI-Mäusen. HE-Färbung von Querschnitten des (A) Zwölffingerdarms und des (B) Ileums von Schein- und POI-Mäusen. Maßstabsleisten: 100 μm oder 25 μm (vergrößertes Bild des Einschubs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Immunzellen des Dünndarms von POI-Mäusen. (A) Durchflusszytometrische Gating-Strategie für T-Zellpopulationen aus Dünndarmgewebe von POI-Mäusen 24 h nach der Operation. (B) Die Anteile des aktiven T-Zell-Markers CD69⁺ in CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und gd-T-Zellen aus dem Dünndarm von Schein- und POI-Mäusen. (C) Die Anteile von CD44⁺ PD-1⁺ aktiven Markern unter CD4 T-Zellen, CD8 T-Zellen und gd T-Zellen im Dünndarm von Schein- und POI-Mäusen. (D) Die Anteile von Neutrophilen (Ly6G⁺ CD11b⁺), dendritischen Zellen (CD11c⁺ MHC-II⁺) und Makrophagen (CD11b⁺ F4/80⁺) unter den CD45^{+ Aqua-lebenden} Immunzellen aus dem Dünndarm von Schein- und POI-Mäusen. Die Zahl in jedem Feld stellt den Prozentsatz der jeweiligen Zellentypen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Der Erfolg einer Operation hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Erstens ist die Aufrechterhaltung der Konsistenz während der intestinalen intramuralen (IM) Operation unerlässlich, um eine ausgedehnte Schädigung des Dünndarms zu induzieren. Der richtige Druck während des IM-Eingriffs und die daraus resultierende hyperämische Wirkung auf den Darm sind entscheidend für den Operationserfolg. Als Indikator für eine erfolgreiche Operation diente die Beobachtung, dass sich der gesamte Verdauungstrakt nach dem Reiben mit einem Wattestäbchen rosa färbte und rote hämorrhagische Flecken aufwies. Darüber hinaus zeigt die Sicherstellung, dass der mittlere GC-Wert nach der Operation bei etwa 5 bleibt, dass das Modell im Vergleich zu dem von scheinoperierten Mäusen erfolgreich war. Die mikroskopische Untersuchung der Gewebeschwellung in der Submukosa und der Infiltration von Immunzellen, wie sie durch HE-Färbung nachgewiesen wird, dient ebenfalls als kritischer Schritt bei der Validierung des Schweregrads von POI.

Änderungen am Protokoll können erforderlich sein, um die Ergebnisse zu optimieren oder auftretende Herausforderungen zu beheben. Um beispielsweise morphologische Veränderungen im Darmepithel genau darzustellen, wird empfohlen, das Darmgewebe zusammen mit seinem Inhalt mit dem Fixiermittel von Carnoy einzubetten⁹. Dieses einzigartige Einbettungsprotokoll gewährleistet eine schnelle Fixierung, die für die Erhaltung der Gewebemorphologie unerlässlich ist. Liegt die Zielsetzung des Untersuchers jedoch auf dem Epithel oder der Lamina propria, ist die Anwendung der verbesserten Schweizer Rolltechnik zur Wachseinbettung der Darmgewebepräparation ratsam¹⁰. Diese Technik komprimiert den Zwischenraum des Darmgewebes und sorgt für eine gleichmäßige Richtung der Zotten, wodurch die Einbettung des gesamten Dünndarms in eine in Wachs eingebettete Probe erleichtert wird.

Trotz seiner Nützlichkeit hat das Protokoll Einschränkungen. Eine Einschränkung ist die Abhängigkeit von Tiermodellen, die die Komplexität der menschlichen Pathophysiologie möglicherweise nicht vollständig replizieren. Darüber hinaus können Unterschiede in der Operationstechnik und den individuellen Reaktionen der Maus zu einer Variabilität der Ergebnisse führen. Laut unserer aktuellen Studie ist die Verwendung eines konsistenten Bedieners ein wichtiges Prinzip, um die bedienerabhängige Variabilität zu reduzieren. Darüber hinaus stellten Van et al. ein selbstgebautes Gerät vor, das in der Lage ist, ein bestimmtes Gewicht auf den Darm aufzubringen, um einen gleichmäßigen Druck auf den IM bei verschiedenen Mäusen zu gewährleisten¹¹. Dieser Ansatz erweist sich in der Tat als wertvoll, um die Konsistenz des Modells zu wahren.

Dieses Protokoll stellt einen wertvollen Beitrag auf diesem Gebiet dar, indem es eine standardisierte Methode zur Induktion von POI durch IM-Chirurgie bei Mäusen bereitstellt. Durch die Aufklärung kritischer Schritte und das Angebot von Modifikationen für die Gewebeeinbettung und Immunzellisolierung verbessert dieses Protokoll die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit bei der POI-Modellierung. Die Verwendung der Durchflusszytometrie ^7,8 für die Immunzellanalyse ermöglicht eine umfassende Untersuchung der Immunantwort, die der POI-Pathogenese zugrunde liegt, ergänzt bestehende Techniken und erweitert unser Verständnis dieses komplexen Syndroms.

Das hier vorgestellte Protokoll ist vielversprechend für zukünftige präklinische Forschung, die sich auf das Verständnis und die Behandlung von POI konzentriert. Durch die Verfeinerung von Operationstechniken und die Optimierung von Gewebeverarbeitungsmethoden können Forscher die Mechanismen, die der Entwicklung von POI zugrunde liegen, weiter erforschen und neue therapeutische Ziele identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht die Kompatibilität des Protokolls mit der Durchflusszytometrie ein tiefgreifendes Immunprofiling und eröffnet Wege für die Untersuchung immunmodulierender Interventionen zur Linderung von POI-Symptomen. Insgesamt legt das Protokoll den Grundstein für die Erweiterung unseres Wissens über POI und die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien zur Verbesserung der Patientenergebnisse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC Anti-Maus I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC Anti-Maus TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 Anti-Maus CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 Anti-Maus Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 Anti-Maus CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 Anti-Maus F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 Anti-Maus/Mensch CD44	Biolegend	103041
BUV395 Anti-Maus CD8a	BD	563786
BUV737 Anti-Maus CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Kulturmikroskop	CKX53	Olympus
Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol Lösung	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC Anti-Maus CD45	Biolegend
FITC-Dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal-Transit-Assay
HE-Färbekit	solarbio	G1120
PE Anti-Maus CD11b	Biolegend	101208
PE Anti-Maus PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 Anti-Maus CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Durchflusszytometer		BD-Immunzellnachweis und -sortierung
Tribromethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anästhesie
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode-Mikroplatten-Reader
Zombie Aqua Fixierbares Viabilitätskit	Biolegend	423102	Fluoreszierend Viabilität Farbstoff