Wir beschreiben ein allgemeines Protokoll, das hochauflösende Massenspektrometrie, Analyse und molekulares Docking in der Forschung der traditionellen chinesischen Medizin integriert.
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Methodenartikel
Hochauflösende Tandem-Massenspektrometrie zur Untersuchung chemischer Bestandteile von Gynura bicolor DC
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Trennung und Analyse der gewünschten chemischen Bestandteile sind wichtige Themen für die Grundlagenforschung der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM). Die Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Quadrupol-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS/MS) hat sich nach und nach zu einer führenden Technologie für die Identifizierung von TCM-Inhaltsstoffen entwickelt. Gynura bicolor DC. (BFH), ein mehrjähriges stielloses Kraut, das in China für Medizin und Lebensmittel verwendet wird, hat medizinische Wirkungen wie die Beseitigung von Hitze, die Befeuchtung der Lunge, die Linderung von Husten, die Zerstreuung von Stasis und die Linderung von Schwellungen. Polyphenole und Flavonoide enthalten zahlreiche Isomere, die die Identifizierung der komplexen Verbindungen in BFH erschweren. In dieser Arbeit wird ein systematisches Protokoll zur Untersuchung chemischer Bestandteile von BFH vorgestellt, das auf Lösungsmittelextraktion und integrierten Daten mittels UPLC-Q-TOF-MS basiert.
Das hier beschriebene Verfahren umfasst systematische Protokolle für die Probenvorbehandlung, die MS-Kalibrierung, die MS-Erfassung, die Datenverarbeitung und die Analyse der Ergebnisse. Die Probenvorbehandlung umfasst das Sammeln, Reinigen, Trocknen, Zerkleinern und Extrahieren. Die MS-Kalibrierung besteht aus Mehrpunkt- und Einzelpunktkorrektur. Die Datenverarbeitung umfasst den Datenimport, die Methodenetablierung, die Analyseverarbeitung und die Ergebnisdarstellung. Repräsentative Ergebnisse des typischen Fragmentierungsmusters von Phenolsäuren, Estern und Glykosiden in Gynura bicolor DC. (BFH) werden in dieser Arbeit vorgestellt. Darüber hinaus werden die Auswahl organischer Lösungsmittel, die Extraktion, die Datenintegration, die Auswahl der Kollisionsenergie und die Methodenverbesserung ausführlich diskutiert. Dieses universelle Protokoll kann in großem Umfang zur Identifizierung komplexer Verbindungen in der TCM verwendet werden.
Einleitung
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird in China seit Tausenden von Jahren klinisch praktiziert und spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Gesundheit der Chinesen1. Die Zusammensetzung der TCM ist vielfältig und komplex, und die TCM wurde in vielen qualitativen Studien, die sich auf die chemische Zusammensetzung konzentrierten, ausführlich berichtet2. Die chemischen Bestandteile der TCM lassen sich grob in folgende Kategorien einteilen: Alkaloide, organische Säuren, Phenylpropanoide, Cumarine, Lignane, Chinonen, Flavonoide, Terpenoide, Triterpenoid-Saponine, Steroid-Saponine, Herzglykoside und Tannine3. Angesichts der großen Anzahl unbekannter Bestandteile und ununterscheidbarer Isomere in der TCM sind die Trennung und Analyse der gewünschten chemischen Bestandteile wichtige Themen für die Grundlagenforschung der TCM4.
Die Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie Die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) wird zur Analyse von Substanzen in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) eingesetzt, die durch Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie getrennt werden können 5,6. Die hohe Auflösung von MS kann umfangreiche Ioneninformationen liefern, die für die Datenbankanalyse mit einem Fehler von weniger als 5 ppm7 verwendet werden. Nach dem Einschalten der Kollisionsenergie kann der sekundäre MS-Modus sekundäre Fragmentionen erhalten, deren Intensität und Anzahl von der Größe der Energie8 beeinflusst werden.
Gynura bicolor DC. (BFH), ein mehrjähriges, stängelloses Kraut, das häufig für Medizin und Lebensmittel verwendet wird (Abbildung 1A), ist eine seltene und gefährdete Pflanze, die nur in China vorkommt9. BFH hat reichlich Anthocyane, Polyphenole, Flavonoide und eine starke antioxidative Kapazität10. BFH hat medizinische Wirkungen, darunter die Reinigung von Hitze, die Kühlung des Blutes, die Befeuchtung der Lunge, die Linderung von Husten, die Zerstreuung von Stauungen, die Linderung von Schwellungen, die Linderung von Sommerhitze und die Beseitigung von Hitze. Nur wenige Studien haben sich mit der chemischen Zusammensetzung von BFH11 beschäftigt. Polyphenole und Flavonoide enthalten zahlreiche Isomere, die die Identifizierung der komplexen Verbindungen in der BFH erschweren. Es muss eine universelle Methode zur Identifizierung chemischer Bestandteile entwickelt werden, die auf alle Arten der TCM angewendet werden kann. Ziel dieser Studie war es, ein systematisches Protokoll zur Untersuchung chemischer Bestandteile von BFH auf der Grundlage von Lösungsmittelextraktion und integrierten Daten über UPLC-Q-TOF-MS zu erstellen.
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Protokoll
1. Vorbehandlung der Proben
- Waschen Sie das ganze Kraut von BFH in reinem Wasser, bis keine sichtbaren Ablagerungen und Verunreinigungen mehr vorhanden sind. Legen Sie den sauberen BFH in eine Schüssel und schieben Sie ihn dann in den Ofen (Abbildung 1B). Den Backofen 24 h lang auf 50 °C heizen.
HINWEIS: Die gesamte Pflanze von BFH wurde in der Provinz Sichuan, China, gesammelt. - Zerkleinern Sie getrocknete BFH in einem multifunktionalen Hochgeschwindigkeitsbrecher. Füllen Sie das grobe Pulver in ein 50-Maschen-Sieb (Abbildung 1C). Sammeln Sie das feine Pulver in einem luftdichten Beutel und bewahren Sie es in einem Trockenturm auf.
- Sechs BFH-Proben à 0,25 g werden genau gewogen und in sechs Erlenmeyerkolben gegeben. Geben Sie 30 ml organisches Lösungsmittel (50 % Ethanol-Wasser, 70 % Ethanol-Wasser, Chloroform, Petrolether, Ethylacetat und n-Butylalkohol) in jede konische Flasche (Abbildung 1D).
- Die Mischung wird für 30 Minuten bei 25 °C in ein Ultraschallbad-Ultraschallgerät gegeben. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 5 min. Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen 0,22 μm organischen mikroporösen Membranfilter vor. Alle Überstände werden in 2-ml-Probenflaschen filtriert.
2. MS-Kalibrierung
- Übertragen Sie mit einer Pipette mit einem 1.000-μl-Bereich 500 μl 0,1 M Natriumhydroxidlösung in einen 100-ml-Messkolben und dann 450 μl deionisiertes oder Reinstwasser in den 100-ml-Messkolben (Abbildung 2).
- Geben Sie mit einer Pipette im Bereich von 200 μl 50 μl Ameisensäure in den 100-ml-Messkolben. Stellen Sie ein Gesamtvolumen von 100 mL mit 90:10 2-Propanol:Wasser her und beschallen Sie die Lösung 5 Minuten lang. Beschriften Sie den Kolben als 0,5 mM Natriumformiatlösung in 90:10 2-Propanol:Wasser und bewahren Sie ihn im Kühlschrank auf.
HINWEIS: Die Natriumformiatlösung verfällt in 1 Woche bei Raumtemperatur. - Starten Sie die Steuerungssoftware UPLC-Q-TOF-MS und öffnen Sie dann das MS tune-Fenster . Stellen Sie im Bedienfeld für die Probendurchflusskontrolle 25 μl/min in der Option Infusionsdurchflussrate ein und wählen Sie C in der Option Reservoir aus. Warten Sie ca. 1 Minute bis zum Ende, bis die automatische Bereinigung abgeschlossen ist.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Flow , um mit der Verabreichung der Natriumformiatlösung zu beginnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Positiv, um in den positiven Ionenmodus zu wechseln, und klicken Sie auf die Schaltfläche Empfindlichkeit , um in den Empfindlichkeitsmodus zu wechseln.
HINWEIS: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, bis die charakteristischen Peaks des Natriumformiats im Echtzeit-Spektrumfenster angezeigt werden. - Öffnen Sie in der Steuerungssoftware UPLC-Q-TOF-MS das MS-Konsolenfenster . Wählen Sie in der linken Position nacheinander die Optionen SYNAPT XS und Intellistart aus.
- Aktivieren Sie das Häkchen bei Kalibrierung erstellen und klicken Sie auf die Schaltfläche Start . Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter und wählen Sie im Dropdown-Menü Kalibrierprofil aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter und wählen Sie den Empfindlichkeitsmodus mit positiver Polarität. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Weiter, Seite optimieren, Weiter und Start .
- Wechseln Sie zum MS tune-Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche Minus, um in den negativen Ionenmodus zu wechseln. Kehren Sie zum MS-Konsolenfenster zurück.
- Aktivieren Sie das Häkchen bei Kalibrierung erstellen und klicken Sie auf die Schaltfläche Start . Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter und wählen Sie im Dropdown-Menü Kalibrierprofil aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter und wählen Sie den Empfindlichkeitsmodus mit negativer Polarität. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Weiter, Seite optimieren, Weiter und Start .
- Stellen Sie im LockSpray Flow Control Panel eine Durchflussrate von 50 μl/min ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Flow , um die LE-Lösung in das Massenspektrometer gelangen zu lassen. Wechseln Sie zum MS Tune-Fenster , aktivieren Sie das Kontrollkästchen LockSpray Source Setup und klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Kalibrierung zu starten.
3. MS-Erwerb
- Wechseln Sie zur Hauptoberfläche und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spalte Inlet File , um die Flüssigchromatographie-Methode zu öffnen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Einlass und stellen Sie dann Parameter wie Laufzeit und Gradient ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Autosampler und stellen Sie dann Parameter wie Laufzeit, Spalte und Sample ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern .
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spalte MS-Methode , um die Massenspektrometrie-Methode zu öffnen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Information und stellen Sie dann Parameter wie Endzeit, Polarität, Analyser-Modus, geringe Masse, hohe Masse und Rampentransfer-Kollisionsenergie ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK und dann auf die Schaltfläche Speichern .
- Füllen Sie die Sequenztabelle mit Dateiname, Fläschchen und Band aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern .
- Wählen Sie in der Sequenztabelle die Zeile für das Beispiel aus, das Sie ausführen möchten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und dann auf die Schaltfläche OK in dem Fenster, das gerade erscheint.
4. Datenverarbeitung
- Starten Sie die Datenanalysesoftware. Klicken Sie in der Spalte "Meine Arbeit " auf die Schaltfläche "MassLynx-Daten importieren ", um ein neues Fenster zu öffnen.
- Klicken Sie auf das Pluszeichen und markieren Sie alle fünf Rohdateien aus dem positiven Modus. Geben Sie einen Gruppennamen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Create UNIFI Sample Set , um den Datenimport zu starten (Abbildung 3A).
- Doppelklicken Sie im positiven Modus auf die Datei Analysemethode. Klicken Sie auf die Beschriftung Verarbeitung und dann auf die Schaltfläche Ziel nach Masse . Geben Sie die Anzahl von 5 ppm in das Eingabefeld nach Zielübereinstimmungstoleranz und Fragmentübereinstimmungstoleranz ein.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Home und dann auf die Schaltfläche Addukte . Wählen Sie die Zeilen +H und +Na aus und klicken Sie auf die pfeilförmige Schaltfläche nach rechts . Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern (Abbildung 3B).
- Doppelklicken Sie im negativen Modus auf die Datei Analysemethode. Klicken Sie auf die Beschriftung Verarbeitung und dann auf die Schaltfläche Ziel nach Masse . Geben Sie die Anzahl von 5 ppm in das Eingabefeld nach der Toleranz für die Zielübereinstimmung und der Toleranz für die Fragmentübereinstimmung ein.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Home und dann auf die Schaltfläche Addukte . Wählen Sie die Zeilen -H und +HCOO aus und klicken Sie auf die pfeilförmige Schaltfläche nach rechts . Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern .
- Klicken Sie in der Spalte Meine Arbeit auf die Schaltfläche Analyse, um ein neues Fenster zu öffnen. Wählen Sie die soeben importierten Daten und die soeben erstellte Methode aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter. Geben Sie den Dateinamen ein. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Analysedaten gespeichert sind, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Fertig stellen
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Verarbeiten und warten Sie einige Minuten, bis die Ergebnisse angezeigt werden (Abbildung 3C).
- Kopieren Sie die Ergebnistabelle in ein leeres Formular (Abbildung 3D).
5. Ergebnisanalyse
- Wählen Sie eine Verbindung in der Ergebnistabelle aus. Das entsprechende sekundäre Massenspektrum wird in der unteren rechten Ecke angezeigt (Abbildung 4A).
- Klicken Sie auf die tabellenförmige Schaltfläche und wählen Sie die Option Hochenergetische Fragmente , um die Tabelle der sekundären Fragmentionen anzuzeigen (Abbildung 4B).
- Wählen Sie ein sekundäres Fragment in der Tabelle aus. Bewegen Sie die Maus über den Ionenpeak, der dem sekundären Massenspektrum entspricht, und der entsprechende strukturelle Bruch wird auf dem Bildschirm angezeigt (Abbildung 4C).
HINWEIS: Beurteilen Sie manuell die Angemessenheit der von der Software angegebenen Rissbildung und unterscheiden Sie Isomere anhand der sekundären Fragmentionen. - Zeichnen Sie das Fragmentierungsmuster manuell in der Zeichensoftware.
HINWEIS: Beispiele für Fragmentierungsmuster werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" ausführlich beschrieben.
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Ergebnisse
Als Modell für die Darstellung der repräsentativen Ergebnisse diente die Identifizierung der chemischen Zusammensetzung der BFH. Basen-Peak-Chromatogramme von lösungsmittelextrahiertem Gynura bicolor DC. sind in der Zusatzdatei 1-Ergänzende Abbildung S1-S6 dargestellt, und die beobachtete Retentionszeit (RT), der Komponentenname, die Formel, das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) und der Massenfehler sind in den Tabellen S1-S6 aufgeführt. Im ZBTK wurden alle 35 Arten von Verbindungen aus getrennt...
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Diskussion
Neben der Wasserabkochung12 ist die Extraktion organischer Lösungsmittel eine weitere gängige Methode der TCM-Vorbehandlung13. Nach dem Prinzip der Ähnlichphasenauflösung sind zahlreiche Bestandteile durch die Kombination verschiedener organischer Lösungsmittel14 extrahiert worden. Die ultraschallgestützte Extraktion ist eine der Hauptmethoden zur Gewinnung von Komponenten in TCM15. Die Extrak...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziert von der National Natural Science Foundation of China (82104881), Inheritance and Innovation Team of TCM Treatment of Immune Diseases, Chongqing Medical Scientific Research Project (Joint project of Chongqing Health Commission and Science and Technology Bureau) (2022DBXM007), einem speziellen Projekt für Leistungsanreize und Beratung des Chongqing Scientific Research Institute (cstc2022jxjl120005), einem speziellen Projekt für die Chongqing Postdoctoral Science Foundation (2022CQBSHTB3035), Senior Medical Talents Program of Chongqing for Yong and Mid-aged, das Programm für wissenschaftliche Einrichtungen von Chongqing (unabhängiges Forschungsprojekt Nr. 2022GDRC015).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chloroform | Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd | CAS 67-66-3 | |
| Ethanol | ChuandongChemical | CAS 64-17-5 | |
| Ethylacetat | ChuandongChemical | CAS 141-78-6 | |
| Flüssigchromatograph | Waters | ACQUITY Klasse 1 plus | |
| MassLynx | Waters | V4.2 | MS Steuerungssoftware |
| n-Butylalkohol | ChuandongChemical | CAS 71-36-3 | |
| Petrolether | ChuandongChemical | CAS 8032-32-4 | |
| Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | Software zur Datenanalyse |
Referenzen
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